摘要： 【目的】昆虫病原线虫(entomopathogenic nematodes, EPNs)的寿命和抗逆性是影响其商品化的重要因素。本研究旨在鉴定崇明拟异小杆线虫Heterorhabditidoides chongmingensis的模式品系DZ0503CMFT(DZ)的DAF-16基因的生物学功能，探讨该基因在DZ线虫的寿命和抗逆性中的作用。【方法】根据DZ线虫和其自身共生菌Serratia nematodiphila DZ0503SBS1T(S1)及非自身共生菌S. nematodiphila DR186(186)共培养时生长发育的差异，结合已经构建的DZ线虫的数字基因表达谱(digital gene expression profile, DGE)文库，选取调控生长发育的胰岛素/类胰岛素信号通路(insulin/insulin-like growth factor signaling pathway, IIS)的主要转录输出信号DAF-16作为研究对象。通过同源性分析选取daf-16基因中特异性片段作为干扰片段，利用L4440质粒载体构建干扰片段的dsRNA表达载体，并转化到大肠杆菌Escherichia coli HT115(DE3)中。用饲喂法将daf-16 dsRNA导入DZ线虫体内沉默基因；利用实时定量PCR检测RNA干扰效果，统计daf-16基因表达下调后的DZ线虫寿命、4个生理阶段的时长、抗逆性(热应激和氧化应激)以及表型(体长)和繁殖性状(48 h内产卵量、卵孵化率和雌虫率)等的变化。【结果】 DZ线虫的daf-16 (GenBank登录号: MH101641) cDNA全长2 164 bp，其中开放阅读框(open reading frame, ORF)长1 353 bp，编码450个氨基酸。RNAi后DZ线虫体内的daf-16基因表达量被显著敲低，相对于对照组空载L4440降低了49.05%。RNAi组线虫平均寿命为14.96 d，比空载L4440组(17.60 d)降低了15.00%。DZ线虫daf-16 RNAi组在繁殖阶段和快速身体运动阶段的时长比空载L4440组的短，而快速咽吸阶段和咽抽吸阶段的时长比空载L4440组的长。处理7 d后DZ线虫daf-16 RNAi组在热应激(37℃)和氧化应激(10 mmol/L百草枯水溶液)处理时存活率显著低于DZ线虫的空载L4440组。在产卵量、孵化率、雌虫率和体长上daf-16 RNAi组与对照组之间没有显著差异。【结论】通过RNAi方法初步验证了DZ线虫的daf-16基因的生物学功能，该基因调控了崇明拟异小杆线虫的寿命和抗逆性。
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崇明拟异小杆线虫daf-16基因的功能鉴定
本站小编 Free考研考试/2022-01-03
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