0 引言
【研究意义】双孢蘑菇（Agaricus bisporus）色质白嫩,肉质肥厚,美味且营养丰富,历来具有“素中之王”的美称。由于其组织细嫩,水分含量高,呼吸作用强,菌表没有明显的保护结构,所以一般在常温贮藏时,双孢蘑菇很快就会出现失水、开伞、破膜、褐变等现象[1,2],其中褐变直接影响双孢蘑菇采后的表观品质,是双孢蘑菇贮藏和鲜销的主要限制因素,因此,减轻并控制双孢蘑菇在贮藏和运输过程中的褐变,是目前亟待解决的难题。【前人研究进展】麦角硫因（巯基组氨酸三甲基内盐,ergothioneine,EGT）是一种天然、无毒的抗氧化剂和细胞保护剂,它可以保护DNA及其他线粒体成分免受电子传递活性氧的损伤,从而有助于维持线粒体的结构和功能,而线粒体是ATP合成的重要场所,直接关系到细胞内各项生命活动的能量供应[3,4]。前人发现将虾[5]、牛肉[6]、蟹[7]、金枪鱼[8]等用富含麦角硫因的菌类提取物进行处理后,其褐变都得到了很好的抑制。CAI等[9]发现对日本海鲈鱼进行壳聚糖—麦角硫因素涂膜处理,有效缓解了海鲈鱼的颜色变化。PAHILA等[10]发现无论是对鲑鱼进行膳食补充麦角硫因,还是在新鲜鲑鱼肉中添加麦角硫因,均能使鲑鱼鲜肉中的虾青素含量保持在较高水平。吕华等[11]用富含麦角硫因的金针菇提取物处理冰藏南美白对虾,发现能显著抑制其黑变。目前国内外关于麦角硫因抑制褐变的研究主要集中在动物性水产品中,将其用于果蔬抗褐变的研究少见报道。许多研究表明,多种果蔬发生褐变是由于能量水平低引起的,维持较高的ATP水平和能荷值可以提高果蔬的抗褐变能力。前人研究发现,麦角硫因处理对维持双孢蘑菇外观及营养品质都有一定效果,但有关麦角硫因处理对双孢蘑菇能量代谢的影响目前未见报道[12,13]。【本研究切入点】麦角硫因处理对双孢蘑菇采后褐变的抑制效应及其与能量代谢的关系有待研究。【拟解决的关键问题】本研究通过测定双孢蘑菇在贮藏期间的菌盖白度、褐变度、丙二醛（MDA）、ATP、ADP、AMP含量以及琥珀酸脱氢酶（SDH）、细胞色素氧化酶（CCO）、Ca2+-ATPase和H+-ATPase的酶活性来研究麦角硫因处理抑制其褐变的能量代谢机理,为控制双孢蘑菇的采后褐变、延缓其衰老,从而延长果实保鲜期,扩大市场销售范围提供科学依据和生产指导。1 材料与方法
试验于2016年11月在浙江工商大学食品与生物工程学院农产组实验室进行。1.1 材料与处理
双孢蘑菇（Agaricus bisporus）品种为AS2796,产自浙江平湖盛龙果蔬培育场,采后即刻运回实验室,然后装筐套袋开始预冷,温度为4℃,时间为12 h。挑选菌盖完好、颜色洁白、无病害、大小基本相同的蘑菇,将其清洗后自然晾干。分别用浓度为0.03、0.06和0.12 mmol∙L-1麦角硫因溶液进行喷涂处理,经过反复试验,发现0.12 mmol∙L-1浓度的麦角硫因溶液处理效果最佳,所以本试验采用的麦角硫因水溶液浓度为0.12 mmol∙L-1,对照组用超纯水处理,两组样品量各为150个,待其自然晾干后装筐,每筐约30个左右,装筐时避免菇体碰撞叠放,最后套上厚度为0.04 mm的PE薄膜袋,于4℃低温贮藏。贮藏期间每隔3 d取样测定各项指标,每组每次取样数量均为30个,处理当天记为采后第1天,测定至采后第17天结束。1.2 试剂
麦角硫因,德国Sigma公司,纯度99.99%。1.3 仪器与设备
3-30K冷冻高速离心机,德国Sigma公司;POLYTRON PT 2100匀浆机,瑞士Kinematica公司;CR-400色差仪,日本KONICA MINOLTA公司;UV-1800紫外可见分光光度计,日本岛津;Agilent 1100高效液相色谱分析仪,美国安捷伦公司。1.4 测定方法
1.4.1 白度值的测定 采用CR-400色差仪测定其菌盖白度值。1.4.2 褐变度的测定 参考苏新国等[14]的方法,略有改动。称取1.0 g蘑菇样品,加入20.0 mL蒸馏水,在冰浴上研磨成匀浆,过滤,之后将滤液置于25℃恒温水浴锅中保温5 min,以蒸馏水作空白对照,测定样品在410 nm波长下的吸光度,用OD410×20来表示样品的褐变度,重复3次。
1.4.3 丙二醛含量的测定 采用硫代巴比妥酸法[15]。
1.4.4 双孢蘑菇ATP、ADP、AMP含量及能荷值的测定 参照YI等[16]的方法,略作改动。称取2.0 g蘑菇样品用液氮研磨,加入6.0 mL 0.6 mol∙L-1高氯酸溶液继续研磨20 min。然后在4℃下16 000×g离心15 min。收集上清液,用1 mol∙L-1氢氧化钾溶液调节pH至6.5—6.8,定容到5.0 mL后采用0.45 µm孔径微孔滤膜进行过滤。最后釆用HPLC（Agilent 1100）法测定ATP、ADP、AMP的含量。
分析柱采用反向C-18柱（Eclipse Plus C-18,5 µm×150 mm×4.6 mm）,紫外检测器,测定波长为254 nm。流动相A包含0.06 mol∙L-1的磷酸氢二钾和0.04 mol∙L-1的磷酸二氢钾,用0.1 mol∙L-1 KOH调节pH至7.0;流动相B为100%甲醇溶液。HPLC采用梯度洗脱,条件为0 min：95% A、5% B,保持3 min;4 min：50% A、50% B,保持至8 min结束。流速：1 mL∙min-1。进样量：20 µL。柱温：30℃。标线用外标法定量。
能荷计算公式为：
EC（Energy charge）=（ATP+1/2 ADP）/（ATP+ ADP+AMP）
1.4.5 线粒体的提取 参照JIN[17]、陈京京[18]等方法进行。
1.4.6 琥珀酸脱氢酶（SDH）活性的测定 参考ACKRELL等[19]的方法测定。
1.4.7 细胞色素氧化酶（CCO）活性的测定 参考ERREDE等[20]的方法。
1.4.8 H+-ATPase活性的测定 参照ZHANG[21]、KAN[22]等的方法进行测定。
1.4.9 Ca2+-ATPase活性的测定 参照陈文烜[23]、祝美云[24]等的方法进行测定。
1.5 数据统计和分析
使用Excel进行数据处理,并用Origin9.0绘图,SPSS Statistics17.0进行显著性分析,显著性水平设置为P<0.05。2 结果
2.1 麦角硫因处理对采后双孢蘑菇菌盖白度值和褐变度的影响
采后双孢蘑菇的菌盖白度变化情况如图1-A所示,对照组和麦角硫因处理组菌盖白度的变化趋势基本一致,表现为持续下降。处理组的菌盖白度值始终高于对照组,且在第5—17天,处理组双孢蘑菇的白度显著高于对照组（P<0.05）,第5、9和13天,处理组比对照组分别高4.9%、6.9%和6.7%,说明麦角硫因处理减缓了双孢蘑菇的表面褐变,有很好的护色作用,这与周巧丽[10]的研究结果相一致。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1麦角硫因处理对双孢蘑菇在4℃贮藏下菌盖白度值(A)及褐变度(B)的影响
不同字母表示处理间差异显著（P<0.05）。下同
-->Fig. 1Effects of ergothioneine treatment on whiteness value of cap of Agaricus bisporus (A) and browning degree of Agaricus bisporus (B) during 4℃storage
Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05). The same as below
-->
由图1-B可知,对照组和处理组的双孢蘑菇褐变度均呈持续上升的趋势。在4℃贮藏的第5—13天,麦角硫因处理显著抑制了双孢蘑菇褐变度的上升（P<0.05）,且在第9、13天抑制效果最为明显,对照组褐变度比处理组分别高20.4%和15.5%。说明麦角硫因处理对于延缓双孢蘑菇在贮藏期褐变度有着很好的效果。
2.2 麦角硫因处理对采后双孢蘑菇丙二醛含量的影响
由图2可知,对照组和麦角硫因处理的双孢蘑菇MDA含量呈现出大致相同的变化趋势,表现为持续上升。在整个贮藏期间,处理组的MDA含量始终低于对照组,贮藏末期（第17天）,对照组的双孢蘑菇MDA含量比处理组高10.9%,差异达显著水平（P<0.05）,说明麦角硫因处理抑制了采后双孢蘑菇MDA含量的上升,使MDA含量始终保持在较低水平,降低了膜脂过氧化程度,保护了细胞膜的完整性。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2在4℃贮藏下麦角硫因处理对双孢蘑菇丙二醛含量的影响
-->Fig. 2Effect of ergothioneine treatment on MDA content of Agaricus bisporus during 4℃storage
-->
2.3 麦角硫因处理对采后双孢蘑菇ATP、ADP、AMP含量及能荷值的影响
如图3-A所示,对照组和麦角硫因处理组的双孢蘑菇ATP含量变化趋势基本一致,均为先上升后下降。对照组的ATP含量在第5天后开始下降,处理组第9天后才开始下降。贮藏期间处理组的ATP含量始终高于对照组,在贮藏第9天差距最大,处理组ATP含量比对照组高17.1%,两者差异显著（P<0.05）。说明麦角硫因处理可以延迟ATP峰值的出现,抑制了细胞的呼吸代谢,减少了能量的消耗,有利于ATP的积累,使采后双孢蘑菇的ATP含量始终维持在较高水平。由图3-B、C可知,ADP和AMP含量整体呈现上升趋势,且ADP在贮藏前期略有下降,说明贮藏前期会消耗一定的ADP来合成ATP,主要表现为ATP的积累,随着子实体内ATP的大量水解,ADP和AMP含量上升。处理组的ADP含量显著低于对照组（P<0.05）,AMP含量显著高于对照组（P<0.05）,说明经麦角硫因处理的双孢蘑菇对于ATP的利用更加充分彻底。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3在4℃贮藏下麦角硫因处理对双孢蘑菇ATP(A)、ADP(B)、AMP(C)含量及能荷水平(D)的影响
-->Fig. 3Effects of ergothioneine treatment on ATP(A), ADP(B), AMP(C) content and Energy charge (D)of Agaricus bisporus during 4℃storage
-->
能荷指在总的腺苷酸系统中所负荷的高能磷酸基的数量,即能量负荷,在一定程度上可以全面反映细胞整体的能量状态[25]。由图3-D可知,对照组和麦角硫因处理组的能荷值变化趋势基本一致,都呈现持续下降的趋势,但处理组的能荷值始终高于对照组,说明麦角硫因处理减缓了双孢蘑菇采后能荷值的下降,提升了细胞内的能荷水平。
2.4 麦角硫因处理对采后双孢蘑菇琥珀酸脱氢酶活性的影响
如图4所示,SDH活性在贮藏初期持续下降,中期开始上升,末期又急剧下降。麦角硫因处理双孢蘑菇的SDH酶活性始终高于对照组,贮藏第13天时,处理组和对照组同时达到峰值,且处理组双孢蘑菇的峰值显著高于对照组（P<0.05）,比对照组高13.0%。麦角硫因处理通过提高三羧酸循环关键酶SDH的活性,保证了TCA循环的顺利进行,从而较好地维持了线粒体的理化性质和基本功能。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4在4℃贮藏下麦角硫因处理对双孢蘑菇琥珀酸脱氢酶活性的影响
-->Fig. 4Effect of ergothioneine treatment on SDH activity of Agaricus bisporus during 4℃storage
-->
2.5 麦角硫因处理对采后双孢蘑菇细胞色素氧化酶活性的影响
CCO是线粒体呼吸链上氧化磷酸化的关键酶,也是呼吸链上的末端氧化酶,能反映生物体有氧呼吸的代谢水平,主要功能是将细胞色素C的电子传递到氧,通过氧化磷酸化提供能量[17]。由图5可知,处理组和对照组采后双孢蘑菇的CCO酶活性的变化基本一致,均为先上升再下降。处理组CCO酶活性的峰值出现在第5天,为25.16 U∙mg-1,对照组在9天达到最高峰,峰值为27.69 U∙mg-1。在贮藏前期（第5天）和贮藏末期（第17天）,处理组的CCO酶活性相较于对照组有所提升。说明麦角硫因处理抑制了采后双孢蘑菇CCO酶活性在贮藏末期的下降,有助于维持线粒体的功能。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图5在4℃贮藏下麦角硫因处理对双孢蘑菇细胞色素氧化酶活性的影响
-->Fig. 5Effect of ergothioneine treatment on CCO activity of Agaricus bisporus during 4℃storage
-->
2.6 麦角硫因处理对采后双孢蘑菇H+-ATPase和Ca2+-ATPase酶活性的影响
H+-ATPase是细胞膜质子泵,通过向外泵出H+产生跨膜质子推动力（电化学势）从而合成ATP[26]。双孢蘑菇采后的H+-ATPase酶活性变化情况如图6-A所示,处理组和对照组均呈现先上升后下降再上升的趋势。整个贮藏期间,处理组H+-ATPase酶活性均显著高于对照组（P<0.05）,并同时在第5天达到最高峰,且处理组的峰值比对照组高13.0%;在贮藏末期（第17天）,处理组H+-ATPase酶活性比贮藏开始时高9.3%。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图6在4℃贮藏下麦角硫因处理对双孢蘑菇H+-ATPase（A）和Ca2+-ATPase（B）活性的影响
-->Fig. 6Effects of ergothioneine treatment on H+-ATPase activity (A) and Ca2+-ATPase activity (B) of Agaricus bisporus during 4℃storage
-->
Ca2+-ATPase能调节线粒体Ca2+的平衡,对于维持线粒体功能具有重要作用[27]。由图6-B可知,处理组和对照组双孢蘑菇的Ca2+-ATPase酶活性基本保持一致,都是在贮藏前期缓慢上升,上升至最高峰后急剧下降,之后基本保持不变,维持在较低水平。处理组和对照组同时在第9天出现峰值,且处理组的峰值比对照组高36.45%,两者差异显著（P<0.05）。在整个贮藏期间,处理组的Ca2+-ATPase酶活性始终高于对照组。综上,麦角硫因处理明显提升了双孢蘑菇采后H+-ATPase和Ca2+-ATPase酶活性,维持了线粒体的基本功能,促进了ATP的生成,保障了机体的能量供应,有助于双孢蘑菇抗褐变。
3 讨论
本研究表明,麦角硫因对采后双孢蘑菇的护色效果明显,不仅可以抑制其菌盖表面的颜色变化,还能减轻双孢蘑菇子实体内部的褐变,很好地维持了双孢蘑菇的品质。双孢蘑菇的细胞膜主要由不饱和脂肪酸构成,在贮藏期间,极易受到自由基攻击而发生结构改变,从而加深膜脂过氧化程度。而丙二醛是膜脂过氧化作用的主要产物,是衡量细胞膜损伤的重要检测指标。正常情况下,双孢蘑菇细胞内的酶和酚类底物由于区域化作用而被分隔。然而当机体发生机械性损伤或自然衰老时,细胞膜完整性遭到破坏,膜脂过氧化程度随之加剧,区域化作用将被破坏,使酚类底物被进一步氧化,从而发生褐变[28,29]。本研究表明,麦角硫因处理抑制了双孢蘑菇子实体内MDA含量的上升,降低了膜脂过氧化程度,增强了细胞的区域化作用,进而减缓了双孢蘑菇的褐变程度。越来越多的研究表明能量代谢与园艺作物的采后衰老及褐变密切相关,其机制可能是ATP参与脂质的合成与脂肪链的去饱和,从而影响膜的完整性与理化性质,进而影响园艺作物的采后抗性[30,31]。SAQUET等[32]发现梨果心褐变可能是由于能量供应受到阻碍,从而损伤细胞膜而产生的结果。DUAN等[33]研究认为25℃纯氧条件下贮藏6 d能使荔枝果皮保持更高的ATP、ADP和能荷水平,从而显著阻止荔枝果皮褐变。SU等[27]的研究表明枇杷采后果皮褐变可能是ATP合成少,供能不足导致的。能量是细胞内一切生命活动得以顺利进行的基本保障,能量缺乏会使细胞膜发生损伤,促进细胞内活性氧代谢,降低细胞的抗氧化性,促使果蔬发生褐变与衰老。通过观察ATP、ADP、AMP含量和能荷水平的变化情况,可以直观地了解采后果蔬组织细胞内能量代谢状态。本研究表明,麦角硫因处理提高了采后双孢蘑菇细胞内ATP含量及其利用率,使能荷水平始终处于较高水平,从而为细胞提供足够的能量,保证了细胞膜结构和功能的完整性。
线粒体是植物细胞能量代谢、物质转化的中枢,也是大多数真核细胞活性氧产生的主要部位,线粒体通过呼吸链的单电子载体产生活性氧[34]。线粒体对氧化胁迫非常敏感,在各种胁迫条下,植物线粒体结构和功能会受到损伤而严重影响ATP的生成,使细胞内能量供应不足,进而导致植物细胞膜的损伤[35]。麦角硫因作为一种抗氧化剂和细胞保护剂,可以保护DNA及其他线粒体成分免受电子传递活性氧的损伤,有助于维持DNA的生物合成及线粒体的结构和功能[12]。H+-ATPase、Ca2+-ATPase、SDH和CCO是线粒体内膜上的关键呼吸酶,也是线粒体呼吸作用的标志酶,其活性变化会直接影响到果实合成ATP的能力。本研究发现,麦角硫因处理明显提高了H+-ATPase、Ca2+-ATPase、SDH酶活性,且这3种酶活性在贮藏期间始终高于对照组。相比之下,麦角硫因对CCO酶活性的增强仅表现在贮藏初期（第5天）和贮藏末期（第17天）,处理效果不如前3种酶明显。表明麦角硫因处理主要是通过提高H+-ATPase、Ca2+-ATPase、SDH酶活性来维持线粒体的功能,从而提升ATP的合成能力,使细胞内的能量积累,从而有效抑制采后双孢蘑菇的褐变。
4 结论
麦角硫因处理减缓双孢蘑菇采后的褐变,对其菌表褐变和内部组织的褐变都有较好的抑制作用,且明显提升了采后双孢蘑菇细胞内ATP的含量及其利用效率,表明麦角硫因对双孢蘑菇采后褐变的抑制作用与能量代谢之间关系密切。麦角硫因处理通过增强线粒体内与能量合成密切相关的酶H+-ATPase、Ca2+- ATPase和琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性,使能荷维持在较高水平,满足了双孢蘑菇采后进行各项生理活动的能量需求,降低了膜脂过氧化程度,保障了膜系统结构和功能的完整性,保护子实体的正常代谢机能,从而延缓了采后双孢蘑菇褐变和衰老的进程。The authors have declared that no competing interests exist.
