0 引言
【研究意义】温敏雄性不育系GS-19作为花椰菜育种中一种新型的雄性不育系,在两系法花椰菜杂交育种中有十分重要的作用。明确花椰菜温敏雄性不育系GS-19育性转换过程中的花器形态特征、花药发育的败育时期、特点和基因表达差异,不仅为阐明该花椰菜温敏雄性不育系的遗传及分子机理奠定基础,而且为花椰菜温敏不育系的利用提供理论依据。【前人研究进展】花椰菜（Brassica oleracea var.botrytis）是一种非常重要的十字花科蔬菜作物,被公认为是最有营养的作物之一,特别是钙、抗氧化剂、维生素A、维生素K、胡萝卜素、核黄素及铁的含量很丰富[1-3],是杂种优势利用潜力很大的一类作物,而雄性不育途径是培育花椰菜新品种的主要途径之一。雄性不育主要特征是雄蕊发育受阻不能产生正常功能的花粉,是杂种优势利用中的重要材料和工具。首个水稻光敏核不育系农垦58S的发现促使两系法杂交水稻育种取得突破性进展[4]。自此以后,小麦[5]、玉米[6]、大豆[7]、水稻[8]、油菜[9]等作物中都发现了光（温）敏雄性不育材料,许多****对其败育时期和方式进行了研究,发现不同作物或者同一作物不同的雄性不育系之间也有差异。对水稻[10-11]、小麦[12]、油菜[13-15]、玉米[16]、茄子[17]、辣椒[18]、甘蓝[19]等作物的雄性不育系细胞学研究较多,主要有无花粉囊型、花粉母细胞败育型和单核败育型3种。高通量转录组测序技术以其速度快、测序长、通量高、准确率高等优点已被广泛应用于生物学[20]、医学[21]、农学[22-24]等研究领域。在雄性不育相关研究中,高通量测序技术应用主要集中在水稻、小麦、玉米、棉花、菊花等20多个物种中,包括细胞质雄性不育[25-26]、细胞核雄性不育[27-28]、化学诱导雄性不育[29]、光温敏雄性不育[30-31]等多种败育类型,这对于雄性不育败育机理的深入研究具有重要意义,也为相关研究提供了丰富的数据信息。【本研究切入点】2005年,笔者课题组从花椰菜种质资源圃里发现了几株温度敏感的不育株,后经多代自交选育成育性稳定的温敏不育系GS-19[32],属高温不育类型,该雄性不育系已经在生产中进行了应用[33],但导致其花药败育的细胞学和转录组水平上的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】以花椰菜温敏雄性不育系GS-19为试验材料,不同温度（15℃和20℃）处理,采用形态学、细胞学方法及高通量测序技术,研究花椰菜温敏雄性不育系花器形态特征、花药败育的细胞学特点及转录组水平上的基因差异,明确不育系GS-19的花器败育特征、花药败育时期、细胞学特征及差异基因表达特点,为花椰菜温敏雄性不育进一步研究和应用奠定基础。1 材料与方法
试验于2012—2016年在甘肃省农业科学院蔬菜研究所农业部园艺作物生物学与种质创制西北地区科学观测实验站进行。1.1 试验材料
试验选取的花椰菜温敏雄性不育系GS-19由甘肃省农业科学院蔬菜研究所选育和提供。育性表现与温度有关,温度高于18℃表现为不育,温度低于16℃时表现为育性完全恢复。1.2 育性转换观察
2014年3月,在智能玻璃温室中花盆直播不育系GS-19,共播种25盆直径为38 cm的花盆,显球后分别移入20℃（16 h光照/8 h黑暗）和15℃（16 h光照/8 h黑暗）的人工智能气候箱中,开花期观察统计育性情况。1.3 花器特征观察
在盛花期,采集在不同温度处理下不育系GS-19开花前3—4 d的花蕾和当天完全开放的花各20朵,用游标卡尺测量7个指标,即花蕾长、花蕾宽、花冠开度、花柱长、花药长、花丝长和花药总长各部分大小,进行比较方差分析。1.4 扫描电镜观察
取不育系GS-19的不育和可育株不同大小花蕾（0.25、0.5、0.75和1.0 cm）,用手术刀横切（或剥出花药）,确保切面整齐,将导电胶带粘在样品托盘上,再将试验样品切面向上按已标记的顺序粘在胶带上,并用镊子进行固定,粘贴面必须保持平整,确保样品粘贴牢固,直接放入样品台,用HitachiS-3400N型扫描电镜观察并照相。1.5 透射电镜观察
选取不育系GS-19不育和可育株不同发育时期（孢原细胞、花粉母细胞、单核花粉粒和花粉粒成熟期）的花蕾,快速剥开花蕾,取出花药。采用戊二醛和四氧化锇双重固定法,先用2.5%戊二醛固定6 h,再用1%四氧化锇固定2 h,丙酮进行梯度（70%、80%、90%、100%）脱水,环氧树脂包埋,超薄切片机切成厚度为5 μm的切片,载玻片上粘片,用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色,TEM-1230透射电镜观察并照相。1.6 转录组分析
RNA提取：在不育系GS-19的盛花期,分别取10株待测不育株和可育株开花前发育成熟的花蕾,采用Trizol法分别提取不育和可育株花蕾总RNA,每个样本取等量混合组成1个RNA池,用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA,将得到的mRNA逆转录成dsDNA,对其末端修复,加poly(A)并连接测序接头,制备测序文库,PCR富集测序样本。功能注释：通过Illumina HiSeq 2500 的测序平台,采用PE125的测序方法,构建GS-19不育和可育株花蕾转录组文库后进行测序并获取相关数据。通过Blastx比对工具,将不育系GS-19与蛋白数据库进行比对,根据基因的相似性进行功能注释,得到与给定Unigene具有最高序列相似性的蛋白及功能注释信息。数据库包括Nr（Non-redundant protein database,非冗余蛋白数据库）、Nt（NCBI non-redundant nucleotide database,非冗余核苷酸数据库）;SwissProt（SwissProt protein database,蛋白质序列数据库）、COG（Cluster of Orthologous Groups,蛋白质直系同源数据库）、Pfam（Protein families database,蛋白质家族域数据库）、GO（Gene Ontology,基因本体论数据库）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,东京基因与基金组百科全书）。
差异基因分析：采用TMM对read count数据进行标准化处理,再用DEG seq进行差异分析,筛选阈值为qvalue<0.005 & |log2FoldChange|>1;对于差异基因,如果基因的log2Foldchange>0,则认为该差异基因是上调;反之,若log2Foldchange<0,认为该差异基因是下调。
1.7 数据处理
试验结果为3次重复的平均值,用Excel 2010进行数据整理、标准偏差计算及图表的绘制,差异显著性用SPSS 18.0 统计软件进行分析。2 结果
2.1 温敏雄性不育系GS-19的育性转换分析
育性统计结果发现,2个温度处理后的温敏不育系GS-19的育性变化存在显著差异。温敏雄性不育系GS-19在2个温度条件下可育率发生了显著的变化,在15℃条件下,完全可育,可育率为100%,20℃条件下完全不育,可育率为0,说明温敏不育系GS-19育性转换受温度控制,属于高温不育类型。2.2 雄性不育系GS-19的花器特征分析
花椰菜温敏雄性不育系GS-19的不育株和可育株的花器有显著差异,不育株花器明显小于可育株。方差分析表明（图1）,除雄蕊数量没有变化外,不育和可育株的花蕾长、花蕾宽、花冠开度、花丝长、花药总长（花丝+花药）及花柱长都存在显著差异,不育株花明显小于可育株,且雄蕊很短,在开花期看不到雄蕊,雄蕊萎缩在基部,只有柱头明显外露（图2）,而且雄蕊也不产生花粉,但可育株的雄蕊基本与雌蕊高度一致,产生大量花粉,能完成正常的授粉。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1GS-19不育和可育株的花器比较
-->Fig. 1Comparison of flowers between sterile and fertile plants of the GS-19
-->
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图22种温度处理GS-19的花器特征
A：可育株（15℃）;B：不育株（20℃）;C：可育花（15℃）;D：不育花（20℃）;E：可育花药（15℃）;F：不育花药（20℃）
-->Fig. 2Flower characteristics of the GS-19 in two temperature treatments
A: Fertile plant (15℃); B: Sterile plant (20℃); C: Fertile flower (15℃); D: Sterile flower (20℃); E: Fertile (15℃); F: Sterile (20℃)
-->
2.3 雄性不育系GS-19的电镜扫描观察
2.3.1 不育和可育株花药外部形态观察 通过对不育系GS-19不育和可育的花药进行电镜扫描观察,不育和可育株花药外部形态存在显著差异（图3）。花蕾长度为0.25 cm时,不育和可育株花药外部形态无差异,棒状形,光滑饱满;花蕾长度为0.5 cm时,不育和可育株花药变成了锥形,不育株的花药壁出现轻微萎缩现象,表面变得不光滑,可育株花药发育正常,仍然饱满光滑;花蕾长度为0.75 cm时,不育株花药变成干瘪状,明显萎缩,表面变得粗糙不平整,中空明显,表现为完全不育,可育株的花药增大明显,发育正常,饱满光滑;开花期（花蕾长度为1.0 cm）不育株花药发育只剩下开裂的空壳花药壁,无花粉粒,可育株的花药开裂,裂口处能看到大量饱满的花粉粒。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图32种温度处理GS-19花药外部形态扫描电镜观察
上：15℃和16 h光照/8 h黑暗处理GS-19花药;下：20℃和16 h光照/8 h黑暗处理GS-19花药
-->Fig. 3Scanning electron microscope observation on the anther external morphology of GS-19 in two temperature treatments
Up: 15℃ and 16 h light /8 h dark treatment GS-19 anther; Down: 20℃ and 16 h light /8 h dark treatment GS-19 anther
-->
2.3.2 不育和可育株花药横切面观察 通过对不育系GS-19不育和可育株花蕾横切面电镜扫描观察,不育和可育株花蕾发育横切面存在显著差异（图4）。花蕾长度为0.25 cm时,不育和可育株花药横切面差异不明显,都被早期发育的小孢子填充;花蕾长度为0.5 cm时,不育株花药发生了败育,花药横切面有变空现象,能清楚地看到花药壁,但可育株花药内部仍然被小孢子填充,没有出现变空现象;花蕾长度为0.75 cm时,不育株花药横切面中空明显,花药壁变薄,完全不育,而可育株花药横切面变化不明显,明显看到花药里被发育的小孢子填充,没有中空现象;开花期（花蕾长度为1.0 cm左右）不育株花药横切电镜扫描发现花药就剩下薄薄的一层花药壁,没有花粉粒,但可育株的花药被成熟花粉粒填充。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图42种温度处理GS-19花药横切面扫描电镜观察
上：15℃和16 h光照/8 h黑暗处理GS-19花药;下：20℃和16 h光照/8 h黑暗处理GS-19花药
-->Fig. 4Scanning electron microscope observation on the anther transaction of GS-19 in two temperature treatments
Up: 15℃ and 16 h light /8 h dark treatment GS-19 anther; Down: 20℃ and 16 h light /8 h dark treatment GS-19 anther
-->
2.3.3 不育和可育株花粉粒的观察 开花期取不育和可育株进行花药扫描电镜观察（图5）,发现不育株（20℃）花药干瘪变形,从表面看不到花粉粒,但是剥开花药,发现极少数败育的花粉粒,败育花粉粒为不规则形,凹陷明显。可育株（5℃）花药饱满,明显看到大量的花粉粒,花粉粒呈椭圆形,表面光滑,饱满。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图52种温度处理GS-19成熟花粉粒扫描电镜观察
A：开花期花药（15℃）;B：开花期花药（20℃）;C：单个花粉粒（15℃）;D：单个花粉粒（20℃）
-->Fig. 5Scanning electron microscope observation on the mature pollen grain of GS-19 in two temperature treatments
A: Flowering stage anther (15℃); B: Flowering stage anther (20℃); C: Single pollen grain (15℃); D: Single pollen grain (20℃)
-->
2.4 GS-19的透射电镜观察
通过透射电镜观察,发现不育系GS-19的花药发育受阻于花粉母细胞到四分体时期,属于花粉母细胞败育类型。花药发育早期,不育系GS-19不育和可育株在细胞超微结构上没有差异,花药发育完全正常,分化形成了表皮、药室内壁、中层等结构,绒毡层和造孢细胞之间没有明显的分界线,形成不规则多边形的造孢细胞,能看到细胞核,细胞质浓厚,看不到明显的液泡（图6-A、E）。随着造孢细胞分化,形成了花粉母细胞,此时可育株的花药能明显看到一圈排列整齐的长方形绒毡层,绒毡层细胞核较大,核仁染色深。花粉母细胞被绒毡层包裹,其细胞大,形状不规则,核大且染色较深（图6-B）。不育株花药也能形成绒毡层和花粉母细胞,部分花粉母细胞没有细胞核（图6-F）。小孢子分化形成了被着色深的绒毡层包裹的四分体孢子,可育株的四分体孢子外壁能明显看到深色密点状包裹带,其上出现大量的发状物质。四分体孢子中含有大量的细胞器,细胞内含物逐渐增多至布满整个细胞,染色深且均匀（图6-C）。不育株只能形成拟“四分体孢子”,和可育株一样,外侧同样出现了深色密点状包裹带,包裹带上出现了大量的深色发状物质,但是四分体孢子的细胞器显著减少,内含物降解,出现液泡吞噬现象,导致花药败育（图6-G）。四分体孢子继续发育,可育株能形成成熟花粉粒,花粉粒近圆形,内壁物质显著增厚,形成了萌发孔,内含物丰富且染色深,绒毡层细胞完全降解消失（图6-D）。但是不育株的拟“四分体孢子”不能正常发育,液泡解体,只剩下壁外侧有发状电子致密带,出现没有活力的“空腔”花粉粒现象（图6-H）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图6花椰菜温敏雄性不育系GS-19花药败育超微结构图
A：可育、孢原细胞;B：可育、花粉母细胞;C：可育、单核花粉粒;D：可育、成熟花粉粒;E：不育、孢原细胞; F：不育、花粉母细胞;G：不育、单核花粉粒;H：不育、成熟花粉粒;Ep：外表皮;Sc：造孢细胞;En：药室内壁;MMC：花粉母细胞;T：绒毡层;Msp：小孢子,PG：成熟花粉粒
-->Fig. 6Ultrastructure of anther development of GS-19
A: Fertile, sporogenous cell; B: Fertile, pollen mother cell; C: Fertile, mononuclear pollen; D: Fertile, mature pollen; E: Sterile, sporogenous cell; F: Sterile, pollen mother cell; G: Sterile, mononuclear pollen; H: Sterile, mature pollen; Sc: Sporogenous cell; Ep: Epidermis; En: Endothecium; MMC: Pollen mother cell; T: Tapetum; Msp: Microspore; PG: Mature pollen grain
-->
2.5 转录组分析
2.5.1 Unigene 的功能注释相关结果分析 通过BLAST程序,对所组装获得不育系GS-19的Unigene进行7大数据库的比对（表1）。结果表明,功能数据库共注释到67 930个Unigene,7大数据库比对到相似序列数目存在明显差异,比对到的相似序列数从13 198—52 191个,其中Nt数据库比对到相似序列数最多,为52 191个,Nr数据库比对到相似序列次之,为46 447个,KOG数据库比对相似序列最少,为13 198个。Nr功能注释到的匹配物种中,油菜Unigene最多（33 108）,然后依次为芜菁（8 841）、拟南芥（643）、芥蓝（634）、山嵛菜（626）等。从匹配物种中发现,不育系GS-19属于十字花科作物,匹配率最高的也是十字花科的油菜和芜菁,从亲缘关系远近也可以证明这一点。Table 1
表1
表1花椰菜温敏雄性不育系GS-19的Unigenes功能注释
Table 1Function annotation of the Unigenes in GS-19
| 注释成功的数据库 Annotated in data base | Unigenes数目 Number of Unigenes | 百分率 Percentage (%) |
|---|---|---|
| NR | 46447 | 68.37 |
| NT | 52191 | 76.83 |
| KO | 14778 | 21.75 |
| SwissProt | 31759 | 46.75 |
| PFAM | 25184 | 37.07 |
| GO | 25336 | 37.29 |
| KOG | 13198 | 19.42 |
| 总数 Total | 67930 | 100 |
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GO注释到25 336个Unigene（表2）,分为细胞组分、分子功能、生物学过程3个本体共55个功能组;KOG注释到13 198个Unigene（表3）,分为26类,注释到最多的是基因功能预测,共2 264个,其次为翻译后修饰,蛋白质折叠,分子伴侣（1 835个）,最少的是未知蛋白（1个）;KEGG注释到14 778个Unigene（表4）,分细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、代谢及有机系统5大类共19个代谢途径,其中涉及较多的有碳水化合物（1 350个）,翻译（1 275个）,折叠、分类和降解（1 016个）等,较少的为多糖生物合成与代谢（161个）,膜输送、膜转运（60个）。
Table 2
表2
表2花椰菜温敏雄性不育系GS-19 Unigene的GO分类
Table 2GO functional categories of the cauliflower thermo-sensitive male sterile line GS-19 Unigene
| GO ID | GO Term (Lev1) | GO Term (Lev2) | 基因数目Gene number |
|---|---|---|---|
| GO:0005576 | 细胞成分 Cellular Component | 胞外区 Extracellular region | 298 |
| GO:0030054 | 细胞连接 Cell junction | 23 | |
| GO:0019012 | 病毒子 Virion | 490 | |
| GO:0005623 | 细胞Cell | 7350 | |
| GO:0044420 | 细胞外基质成分Extracellular matrix component | 2 | |
| GO:0044421 | 胞外区部分Extracellular region part | 269 | |
| GO:0016020 | 薄膜Membrane | 3932 | |
| GO:0044215 | 其他有机体Other organism | 124 | |
| GO:0032991 | 高分子复合物Macromolecular complex | 4803 | |
| GO:0045202 | 突触 Synapse | 2 | |
| GO:0044217 | 其他器官部分Other organism part | 124 | |
| GO:0044456 | synapse part Synapse part | 2 | |
| GO:0055044 | 共质体Symplast | 7 | |
| GO:0044423 | 病毒组分Virion part | 490 | |
| GO:0044464 | 细胞组分Cell part | 7349 | |
| GO:0043226 | 细胞器Organelle | 4876 | |
| GO:0031974 | 膜蛋白Membrane-enclosed lumen | 667 | |
| GO:0044422 | 细胞器组分Organelle part | 2667 | |
| GO:0044425 | 薄膜组分Membrane part | 3619 | |
| GO:0031012 | 细胞外基质Extracellular matrix | 126 | |
| GO:0005488 | 分子功能 Molecular Function | 结合活性 Binding | 14174 |
| GO:0003824 | 催化活性 Catalytic activity | 11235 | |
| GO:0016209 | 抗氧化剂活性 Antioxidant activity | 125 | |
| GO:0005215 | 转运活性 Transporter activity | 1627 | |
| GO:0016530 | 金属伴侣蛋白活性 Metallochaperone activity | 5 | |
| GO:0005198 | 结构分子活性 Structural molecule activity | 674 | |
| GO:0001071 | 核酸结合转录因子活性Nucleic acid binding transcription factor activity | 915 | |
| GO:0098772 | 分子功能调节器Molecular function regulator | 625 | |
| GO:0000988 | 结合蛋白转录因子活性Transcription factor activity, protein binding | 233 | |
| GO:0060089 | 分子传感器活性Molecular transducer activity | 379 | |
| GO:0065007 | 生物学过程 Biological Process | 生物调节Biological regulation | 5018 |
| GO:0098743 | 细胞聚集Cell aggregation | 1 | |
| GO:0051179 | 定位Localization | 3934 | |
| GO:0001906 | 细胞死亡Cell killing | 20 | |
| GO:0040007 | 生长Growth | 39 | |
| GO:0071840 | 细胞组织的组成或合成Cellular component organization or biogenesis | 2556 | |
| GO:0048519 | 生物过程负调控Negative regulation of biological process | 223 | |
| GO:0051704 | 多生物过程Multi-organism process | 1174 | |
| GO:0008152 | 代谢过程Metabolic process | 13162 | |
| GO:0009987 | 细胞程序Cellular process | 13985 | |
| GO:0023052 | 信号Signaling | 1689 | |
| GO ID | GO Term (Lev1) | GO Term (Lev2) | 基因数目Gene number |
| GO:0044848 | 生物学阶段Biological phase | 22 | |
| GO:0002376 | 免疫系统的过程Immune system process | 184 | |
| GO:0044699 | 单一的生物过程Single-organism process | 10280 | |
| GO:0050789 | 生物学过程调节Regulation of biological process | 4649 | |
| GO:0032501 | 多细胞生物过程Multicellular organismal process | 562 | |
| GO:0000003 | 再生作用Reproduction | 251 | |
| GO:0048511 | 周期过程Rhythmic process | 19 | |
| GO:0022414 | 生殖过程Reproductive process | 167 | |
| GO:0022610 | 生物学粘连Biological adhesion | 179 | |
| GO:0040011 | 运动Locomotion | 231 | |
| GO:0048518 | 生物过程的正调控Positive regulation of biological process | 303 | |
| GO:0050896 | 刺激反应Response to stimulus | 3105 | |
| GO:0032502 | 发育过程Developmental process | 423 | |
| GO:0007610 | 行为Behavior | 28 |
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Table 3
表3
表3花椰菜温敏雄性不育系GS-19 Unigene的KOG系统分类
Table 3KOG classification of the cauliflower thermo-sensitive male sterile line GS-19 Unigene
| 组Group | 注释的基因个数 Annotated genes |
|---|---|
| RNA 加工与修饰RNA processing and modification | 697 |
| 染色质结构与动力学Chromatin structure and dynamics | 244 |
| 能源生产与转化Energy production and conversion | 549 |
| 细胞周期调控,细胞分裂,染色体分割Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning | 398 |
| 氨基酸转运与代谢Amino acid transport and metabolism | 578 |
| 核苷酸转运和代谢Nucleotide transport and metabolism | 178 |
| 碳水化合物转运和代谢Carbohydrate transport and metabolism | 630 |
| 辅酶转运与代谢Coenzyme transport and metabolism | 146 |
| 脂质转运与代谢Lipid transport and metabolism | 588 |
| 翻译,核糖体结构和生物合成Translation, ribosomal structure and biogenesis | 931 |
| 翻译Transcription | 830 |
| 复制、重组和修复Replication, recombination and repair | 383 |
| 细胞壁/膜/膜的发生Cell wall/membrane/envelope biogenesis | 155 |
| 细胞运动Cell motility | 3 |
| 翻译后修饰,蛋白质折叠,分子伴侣Posttranslational modification, protein turnover, chaperones | 1835 |
| 无机离子转运与代谢Inorganic ion transport and metabolism | 443 |
| 次生代谢产物的合成、转运和代谢Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism | 587 |
| 基因功能预测General function prediction only | 2264 |
| 未知功能Function unknown | 510 |
| 信号传导机制Signal transduction mechanisms | 1398 |
| 细胞内的贩运,分泌和囊泡运输Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport | 859 |
| 保护机制Defense mechanisms | 102 |
| 真核细胞的细胞外结构Extracellular structures | 48 |
| 未知蛋白Unamed protein | 1 |
| 核结构Nuclear structure | 58 |
| 细胞骨架Cytoskeleton | 411 |
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Table 4
表4
表4花椰菜温敏雄性不育系GS-19Unigene的KEGG代谢途径分析
Table 4KEGG analysis of metabolic pathway of the cauliflower thermo-sensitive male sterile line GS-19 Unigene
| 代谢通路 Pathway hierarchy 1 | 代谢通路 Pathway hierarchy 2 | 基因数目 Gene number |
|---|---|---|
| 细胞过程 Cellular Processes | 运输和代谢 Transport and catabolism | 701 |
| 环境信息处理 Environmental information processing | 膜输送、膜转运 Membrane transport | 60 |
| 信号转导 Signal transduction | 633 | |
| 遗传信息处理 Genetic information processing | 折叠、排序和降解 Folding, sorting and degradation | 1016 |
| 复制和修复 Replication and repair | 272 | |
| 转录 Transcription | 468 | |
| 翻译 Translation | 1275 | |
| 代谢 Metabolism | 氨基酸代谢 Amino acid metabolism | 816 |
| 其他次生代谢产物的生物合成 Biosynthesis of other secondary metabolites | 560 | |
| 碳水化合物代谢 Carbohydrate metabolism | 1350 | |
| 能量代谢 Energy metabolism | 591 | |
| 多糖生物合成与代谢 Glycan biosynthesis and metabolism | 161 | |
| 类脂（化合）物代谢 Lipid metabolism | 723 | |
| 辅助因子和维生素代谢 Metabolism of cofactors and vitamins | 360 | |
| 其他氨基酸的代谢 Metabolism of other amino acids | 374 | |
| 萜类和酮类化合物的代谢 Metabolism of terpenoids and polyketides | 414 | |
| 核苷酸代谢 Nucleotide metabolism | 344 | |
| 重复 Overview | 882 | |
| 有机系统 Organismal systems | 环境适应 Environmental adaptation | 740 |
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2.5.2 差异表达分析 本试验中发现不育系GS-19不育株的上调表达基因表达水平高于可育株的基因表达水平。如图7所示,在TMS（GS-19不育株花蕾）和TMF（GS-19可育株花蕾）之间发现的67 931 Unigenes中有2 170个基因差异表达,其中1 078个基因上调表达和1 092个基因下调表达。每个比较组合都会得到一个差异基因集,将所有比较组合的差异基因集的并集在每个试验组/样品中的的FPKM（Fragment Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）值,就得到了TMS和TMF的聚类分析结果（图8）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图7GS-19基因差异表达分析火山图
蓝色圆点表示无显著性差异的基因,红色圆点表示有显著性差异的上调基因,绿色圆点表示有显著性差异的下调基因
-->Fig. 7Differentially expressed in GS-19
Blue dots indicate no significant difference sense, the red dots indicate significant difference up-regulated genes, the green dots indicate significant difference down regulated genes
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图8GS-19差异基因聚类图
红色表示高表达,蓝色表示低表达。颜色从红到蓝,表示log10(FPKM+1)从大到小
-->Fig. 8Differential gene cluster map in GS-19
Red indicates high expression and blue indicates low expression. The color from red to blue indicates log10 (FPKM±1) from large to small.
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3 讨论
本研究发现花椰菜温敏雄性不育系GS-19的育性受温度控制,高温（20℃）条件下表现为不育,低温（15℃）条件下完全可育,与前人在甘蓝型油菜温敏核不育系SP2S[14]、TE5A[15]、细胞质雄性不育系392A[13]的育性转换研究结果相同,都表现为高温不育、低温育性恢复。但在油菜温敏雄性不育系Huiyou50S的育性转换研究结果正好与本研究结果相反,表现出低温不育、高温可育的现象[34]。为进一步对温敏雄性不育系GS-19利用,在制种过程中要找到适宜区域,注意监控温度条件,避免影响杂种种子的纯度。花器形态特征是雄性不育和可育区别的直接表型,大部分研究表明雄性不育的花明显小于可育株的花,不育花器形态有花冠退化型、雄蕊萎缩型、花粉败育型3种[35-36]。本研究发现,高温条件下温敏不育系GS-19的花器显著小于低温下温敏核不育系GS-19,尤其是花的发育后期,不育株花器的雄蕊都萎缩于雌蕊基部,柱头外露,花药干瘪,与前人研究中的雄蕊萎缩型表型一致。童旭宏等[37]观察了陆地棉的G22A、H109A和1793A 3个不育系,均表现花瓣小、花丝短,柱头明显外露,败育彻底,无花粉;张体德等[38]发现芝麻细胞核雄性不育系ms86-1的花器也是不育株小于可育株,这些研究结果都与本研究结果相同。
随着花椰菜雄性不育系的发现,花药发育的细胞学研究也显得非常重要。目前,雄性不育败育研究主要集中在油菜、小麦、水稻等大田作物中,主要有无花粉囊型、花粉母细胞败育型和单核败育型3种,已经研究发现的典型无花囊型油菜不育系有533S[39]、宜3A[40]、212A[41]、Shaan-GMS[42]、9012[43]、BnaC.Tic40[44]、BnMs3[45]等。本研究发现在花蕾发育早期（≤1 mm）时,低温条件下的温敏雄性不育系GS-19处于孢原时期和造孢时期,能分化形成造孢细胞和壁细胞,该时期高温条件下的GS-19的花药发育也正常。随着花蕾的继续发育（>1 mm）,高温条件下温敏雄性不育系GS-19不育株的花粉母细胞和可育株一样,也能进行正常减数分裂,但形成的四分体孢子不正常,出现拟四分体孢子现象,细胞器显著减少,内含物降解,出现液泡吞噬现象,导致败育,属于花粉母细胞败育类型,与温敏核不育系小麦BNS[12]和BNS366[46]、甘蓝Ogura CMS[47]的败育类型一致,此外,水稻[45]、小麦[48]、高粱[49]、大豆[50]、红菜薹[51]等作物的雄性不育系也是因为减数分裂过程出现问题,导致花粉母细胞不能形成四分体,也与本试验不育类型一致。但是一些其他的温敏雄性不育水稻、小麦、甘蓝型油菜的花药发育的细胞学观察发现,这些败育类型属于单核败育型[10,34,52]。推断GS-19是一个具有重要利用价值的花椰菜温敏雄性不育系,其不育发生的细胞学研究结果,对于揭示不育发生的细胞学机制和杂交制种具有重要的指导意义。
通过基因功能注释,可以明确基因的功能,也可以了解基因的保守结构域,基因自身表达条件和潜在的代谢途径[53]。本研究通过GO数据库,对温敏雄性不育系GS-19 Unigene进行基因生物学特征功能分类,发现37 220个GO条目归属于细胞组分中的20个功能组;29 992个GO条目归属于分子功能中的10个功能组,62 204个GO条目归属于生物学过程中的25个功能组,明显看出GO分析雄性不育相关转录组数据量大,相关差异表达基因集聚在代谢中的多个通路,初步证明花椰菜温敏雄性不育产生机理的复杂性。前人研究发现植物代谢过程中的花粉壁形成、类黄酮合成等过程都与植物雄性不育形成过程中的花粉发育密切相关[54],细胞程序性死亡也与植物雄性不育关系密切[55],这些研究结果与本研究结果相似。相反,大豆的细胞质雄性不育研究中,发现参与胚发育过程的基因数量最多[56];大蒜细胞质雄性不育的花青素代谢相关基因在差异表达基因中数量较多[57],说明败育方式差异会导致雄性不育表现出特有差异基因富集的功能通路。
基因组和转录组数据的缺乏大大限制花椰菜温敏雄性不育系的分子机理方面的相关研究。目前,对温敏雄性不育的转录组分析研究发现,遗传背景、败育时期和方式等多方面因素都会影响基因的表达水平,MEI等[58]在萝卜2个核背景存在差异的同一细胞质雄性不育材料的转录组分析中,发现与其相对应的保持系差异表达基因数分别为3 843和2 041个,这些基因都是与不育特性密切相关的基因;AN等[59]发现甘蓝型油菜细胞质雄性不育系Pol不育株中的基因上调表达数目显著高于可育株。本研究发现,在不育株花蕾和可育株花蕾中有2 170个基因差异表达,其中1 078个上调表达和1 092个下调表达,下调表达主要出现在不育材料中,上调表达主要出现在可育材料中,与QU等[60]在油菜细胞核雄性不育系中的研究结果相一致,可育材料中的差异基因以上调表达为主。但是与MEI等[58]和AN等[59]的研究结果有一定差异,可能与基因型有很大的关系,这些研究都说明了基因的表达量及表达的上、下调关系与遗传背景和差异基因的功能密切相关,因此,可以通过对基因表达水平变化的分析,来预测和研究其基因功能的变化。
4 结论
花椰菜温敏雄性不育系GS-19育性转换受温度控制。GS-19不育与可育株花器差异显著,不育株的花器明显小于可育株。超微结构观察发现GS-19不育株的花药发育过程有造胞细胞和花粉母细胞的分化,形成正常花粉囊,不产生花粉粒或者产生微量的无生活力的花粉粒,花药发育受阻于花粉母细胞到四分体时期,形成了花粉粒外壁发育异常的拟“四分体孢子”,随着小孢子发育,拟“四分体孢子”逐渐降解,只剩下花粉空壳,属于花粉母细胞败育类型。转录组分析发现,GS-19共获得了67 930个Unigene, GO注释到25 336个Unigene;KOG注释到13 198个Unigene;KEGG注释到14 778个Unigene。GS-19不育株花蕾和可育株花蕾中有2 170个基因差异表达,1 078个上调表达和1 092个下调表达。The authors have declared that no competing interests exist.
