0 引言
【研究意义】叶用莴苣（Lactuca sative L.）为菊科莴苣属一年或二年生草本植物。由于其叶形美观、营养丰富、所含热量低,受到消费者青睐,是中国发展较快的绿叶蔬菜之一,在提高蔬菜自给率,保证周年供应中占有重要地位。叶用莴苣性喜冷凉气候,生长适温为15—20℃,对高温胁迫反应敏感而强烈,超过30℃则生长不良,导致抽薹,降低食用品质。在许多蔬菜中也都存在热害和“先期抽薹”现象,由于蔬菜受到热害,抽薹会失去食用价值,经济效益降低,甚至会造成严重的减产或绝收[1-2]。尤其是近年来,极端高温天气和持续高温状况的不断出现,给植物的生长发育和生产带来了巨大挑战,进一步研究热激蛋白的功能具有重要意义。【前人研究进展】植物在长时间的进化中形成了一套属于自己防御逆境胁迫的机制,应对高温时,植物也有相应的抵御机制。在高于正常生长温度5℃以上的温度即热激下,生物体大部分正常蛋白质的合成和mRNA的转录被抑制,同时迅速大量合成一些新的蛋白质称之为热激蛋白[3]。根据分子量大小将热激蛋白（HSPs）分为6个家族,Hsp100家族、Hsp90家族、Hsp70家族、Hsp60家族、Hsp40家族和小分子Hsp家族,其中Hsp70是在生物体内分布最广、进化上最保守、研究最多的一类热激蛋白[4],广泛存在于微生物和真核生物的细胞之中,在细胞核、细胞质、内质网、线粒体和叶绿体内均有存在[5]。目前关于Hsp70的分子伴侣作用模式研究最清楚的是大肠杆菌DnaK（HSC70的一种）,其蛋白结构的研究已取得一些成果[6-7]。HSP与植物耐热性相关已在大豆[8]、烟草[9]、马铃薯[10]等相关研究中得到验证。目前在番茄中至少含有22个Hsp70家族成员的基因、拟南芥中发现至少18个,菠菜中至少有12个,小麦中有2个等[11-12]。高温胁迫条件下Hsp70能结合部分折叠和变性的蛋白质,防止其聚集,协助变性蛋白质重新折叠,保护细胞免受损害,也能促进蛋白质折叠成正确的构象[13-14],且在正常环境条件下热激蛋白的量占细胞内蛋白总量的5%,但受到环境刺激特别是高温胁迫下会大量合成,从而达到占蛋白总量的15%[15]。有研究发现,在胁迫环境下,Hsp70s起上调作用,参与变性蛋白的重新折叠,维持细胞环境稳态和保护组织结果免受伤害[16-19]。在拟南芥细胞质中的HSC70-1过量表达可有效提高转基因植株的耐热性[20];SCAFARO等[21]在研究水稻时也证实热激蛋白Hsp70与植物耐热性的相关性。QI等[22]研究证明水稻线粒体HSP70的过表达抑制了高温和氧化引起的细胞凋亡,并且这种抑制作用是通过维持线粒体膜电位差的稳定和抑制活性氧的扩散实现的。在玉米中获得一个Hsp70基因ZmHsp70,该基因在受到42℃热激诱导和4℃冷胁迫时表达量均有增加,且在冷胁迫4 h时表达量最大[23]。胡秀丽等[24]研究表明Hsp70对干旱胁迫也有一定的抵抗作用。【本研究切入点】深入研究植物Hsp70在逆境条件下的功能,对正确认识胁迫信号的传导、抗逆相关基因的调控以及提高作物的抗逆性有着重要的指导意义和应用价值。动物中Hsp70研究起步较早,功能也较为透彻,现研究证明,Hsp70具有以下功能：协助新生蛋白的折叠,参与细胞内蛋白质的转运[25],参与免疫复合物的形成和分解[26]和降解冗余蛋白。然而,植物Hsp70的生理功能研究起步较晚。目前,Hsp70在植物中的胁迫应答机理、分子伴侣的作用及其在提高植物抗逆性的功能尚不明确。其中叶用莴苣Hsp70的相关研究较少。【拟解决的关键问题】以叶用莴苣为对象,通过克隆获得Hsp70家族基因,分析其在高温处理下的表达差异。基因瞬时沉默后,观察高温对其mRNA表达的影响和茎长变化,为进一步阐明叶用莴苣耐热性的机理提供参考。1 材料与方法
1.1 试验材料与试剂、菌株
从300个叶用莴苣种质资源中,大田筛选出具有典型抽薹特性的2个品种,即热敏品种‘P-S11’和耐热品种‘G-S59’。每个品种各称取1 g种子,种子24 h催芽后播种于穴盘,待幼苗长到4—5片叶时,定植后放入培养箱,培养条件：温度25℃,光照12 000 lx,光照/黑暗时间为16 h/8 h。在光照培养箱中对幼苗进行温度处理,处理温度分别为25℃（对照）、37℃、42℃,处理时间为0、15、30、60、120、180、240和300 min,取其第3、4片叶,-80℃保存备用。总RNA快速提取试剂盒购于艾德莱生物公司;高保真LA taq酶、克隆载体pMD19-T Vector、DH5α感受态细胞、RACE试剂盒购于宝生物工程有限公司;Xbal I酶和Kpn I酶、T4连接酶购于NEB生物公司;pTRV、GV3101农杆菌载体由北京农学院果树系惠赠。
1.2 方法
1.2.1 叶用莴苣LsHsp70-2711的克隆 在GenBank中查找与基因同源性较高、已公布植物的Hsp70保守片段,并利用DNAMAN软件设计简并引物进行Hsp70-2711保守序列的扩增。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离,利用DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带,回收产物与pMD19-T载体连接,转化DH5α大肠杆菌,阳性克隆送华大公司测序。1.2.2 叶用莴苣LsHsp70-2711全长的获得 测序结果于NCBI上进行比对,确定与其他植物HSP70的同源性,测序结果得到的中间片段分别设计基因5′端和3′端引物：27-5′GSP1、27-5′ GSP2和27-3′GSP1、27-3′GSP2。引物5′端cDNA的合成和3′端cDNA的合成按照5'-Full RACE Kit和3'-Full RACE Kit试剂盒说明书进行。UPM通用引物由RACE试剂盒提供。
1.2.3 LsHsp70-2711表达分析 根据宝生物公司Real Master Mix（SYBR Green）PCR试剂盒操作步骤进行,标准品cDNA和待测样品均设置3次重复。内参及LsHsp70-2711的引物序列由Primer Premier软件设计,目的基因特异性引物：2711-Y F、2711-Y R。按照以下程序进行实时定量反应：94℃预变性2 min,94℃变性 20 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,40次循环,每次循环第3步进行荧光采集,最后95℃变性1 min,退火至55℃（每隔10 s上升0.15℃）后保温1 min,接着检测其荧光值,绘制熔点曲线。对‘G-S59’和‘P-S11’两个品种不同温度、不同时间处理的叶片组织进行LsHsp70-2711实时荧光定量分析。以热敏品种‘P-S11’在25℃下的叶片表达量为1,采用2-△△Ct法计算并作图。
1.2.4 LsHsp70-2711 VIGS基因沉默体系 选取LsHsp70-2711开放阅读框中500 bp左右的片段设计引物2711-V F和2711-V R。从叶用莴苣‘P-S11’cDNA中克隆出500 bp左右片段。将克隆得到的质粒和pTRV2空载体分别双酶切（Xbal I内切酶、Kpn I内切酶）。T4连接酶连接,转化后筛选出阳性菌落。最后双酶切鉴定,测序。将鉴定好的重组质粒转入农杆菌GV3101中,并配置侵染液。
选取长至4片叶的‘P-S11’品种,用无菌注射器对叶片进行注射。干旱处理：将侵染第3周植株从营养土中取出,轻轻抖动根部去除土壤,在干燥的滤纸上室温静置2 h。热胁迫处理：侵染3周后,取植株在37℃下处理1 h,然后25℃正常培养。取侵染后第3周、2 h干旱处理和37℃热胁迫处理植株嫩叶的cDNA,用特异引物TRV（表1）,PCR扩增,检测TRV病毒。同时用引物2711-V（表1）对叶用莴苣LsHsp70-2711做RT-PCR。通过软件Quantity One根据条带的明暗程度进行分析。为观察基因沉默植株形态变化,分别测量侵染3、4周未热胁迫及热胁迫处理一周后的植株茎长。
Table 1
表1
表1叶用莴苣LsHsp70-2711克隆、表达分析和Vigs载体构建所用引物
Table 1Primers used for cloning,construction of vector and gene expression of LsHsp70-2711
| 引物名称 Primer name | 引物顺序（5′-3′） Primer sequence（5′-3′） |
|---|---|
| 27-1F | 5′-GAATGCCGTCGTCACTGTCC-3′ |
| 27-1 R | 5′-GAAGATTGAGAACCGCTTGTG-3′ |
| 27-2 F | 5′-GCCGGTGGTGTGATGACTGT-3′ |
| 27-2 R | 5′-CTAAGATGTATCAAGGTGCTGG-3′ |
| 27-5′GSP1 | 5′-GAACTCTTGAACGAAATGGTTGACC -3′ |
| 27-5′ GSP2 | 5′-GTCGTTGAAGTAAGCAGGGACAGT -3′ |
| 27-3′GSP1 | 5′-TGATAAGGGGAGGTTGTCGAAG -3′ |
| 27-3′GSP2 | 5′-TTGGAGGATAAGTTGAAGGAG -3′ |
| 2711-Y F | 5'-GACTTGTTGCTATTGGATGTCA-3' |
| 2711-Y R | 5'-TATCCCTCGTTCTTGTCCTTTC-3' |
| 2711-V F | 5'-GCTCTAGACGCTTTCTTCTACTGCTCAG-3' |
| 2711-V R | 5'-CGGGGTACCCTTGTCCTTTCCCCTTCG-3' |
| TRV F | 5'-TTACAGGTTATTTGGGCTAG-3' |
| TRV R | 5'-CCGGGTTCAATTCCTTATC-3' |
| Action | 5'-GGAATGGGACAGAAGGAT-3′ |
| Action | 5'-CAGTCAGGAGAACAGGGT-3′ |
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1.3 数据处理及分析
利用Excel软件统计数据并绘制图表,SPSS进行方差分析。2 结果
2.1 LsHsp70-2711的克隆
通过测序获得两条长度分别为822 bp和1 065 bp的中间片段,拼接后在NCBI上进行同源性比较的结果表明,与水母雪莲花、番茄、黄瓜等植物的同源性均达79%以上,初步推断所得片段属于Hsp70基因家族,拼接得到1 424 bp长度的中间片段。后再通过5'RACE和3'RACE技术获得Hsp70-2711的5'端和3'端序列,开放阅读框长度为2 154 bp,多次拼接后最终得到Hsp70-2711基因cDNA全长序列为2 226 bp,命名该基因为LsHsp70-2711。用DNAMAN软件对所得Hsp70-2711全长cDNA序列进行翻译及分析,结果表明,该基因编码一个718个氨基酸完整开放阅读框。2.2 叶用莴苣LsHsp70-2711的蛋白质理化性质和序列分析
使用InterProScan在线软件对基因编码的氨基酸序列进行理化性质分析。结果表明,LsHsp70-2711分子量约为79.69 kD,理论等电点是8.58,总负电荷残基数（Asp+Glu）：90,总正电荷残基数（Arg+Lys）：97,在氨基酸组成中所占百分比最大的是甘氨酸Gly（G）10.3%,最小的是组氨酸His（H）1.4%,预测半衰期2 min（Escherichia coli,in vivo）、2 min（yeast,in vivo）,不稳定指数是35.72,小于40,所以属于稳定蛋白。总平均亲水性系数是-0.363,因此预测为亲水性蛋白。2.3 LsHsp70-2711蛋白同源性分析
将所得氨基酸序列在NCBI上用BLAST在线软件进行同源性比对,LsHsp70-2711与其他几种植物的Hsp70氨基酸同源性在90%以上,进一步推测本试验所得到的基因序列属于Hsp70基因家族。采用DNAMAN软件分别将氨基序列与其他几种植物进行多重序列比对。利用MEGA 5.0软件,通过NCBI的在线BLAST比对,将数据库中已近登陆的其他物种的Hsp70氨基酸序列与本研究得到的叶用莴苣的LsHsp70-2711氨基酸序列进行系统进化树分析。结果表明,叶用莴苣与水母雪莲和紫茎泽兰属于同一分支即亲缘关系与其他植物相比更近（图1）,这一结果同在NCBI的比对结果相一致。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1叶用莴苣LsHsp70-2711与其他植物Hsp70氨基酸系统进化树
-->Fig. 1Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of plant LsHsp70-2711
-->
2.4 亚细胞定位预测
通过在线软件Wolf psort对LsHsp70-2711蛋白进行亚细胞定位。结果显示：细胞质（6）、叶绿体（2）、线粒体（3）、内质网（2）。进一步利用在线预测软件 TargrtP 1.1对LsHsp70-2711 蛋白进行亚细胞定位,二者结果预测显示均主要定位在细胞质中。由此判断,LsHsp70-2711蛋白主要定位于细胞质中。2.5 LsHsp70-2711基因的表达分析
iCycleriQTM自动测出的内参基因18S rRNA的PCR扩增效率和相关系数分别为97.8 %和0.999;LsHsp70-2711扩增效率和相关系数分别为108.1 %和0.996。经熔点曲线分析,18S rRNA 和LsHsp70- 2711两个基因各自都只有一个Tm值,分别为87℃和80.5℃。图2为LsHsp70-2711在叶用莴苣热敏品种‘P-S11’中的表达结果,热激处理15—300 min时,37℃处理组LsHsp70-2711的表达量是25℃的对照组的10倍以上,42℃处理组LsHsp70-2711的表达量是对照组的2倍以上;37℃热激60 min的表达量是30 min的2.1倍,是120 min的4.1倍;42℃热激15 min的表达量是热激30 min的9.8倍。分析可知,与25℃对照相比,在37℃热激胁迫15 min时,LsHsp70-2711在叶用莴苣品种‘P-S11’中的表达量迅速升高,同时随着热激处理时间的延长而表现先升高后降低的趋势;42℃热激处理在15 min时出现最大值,随后变化趋势不明显。两处理表达量均明显高于对照,说明此基因表达受高温胁迫影响。LsHsp70-2711表达量的最大值出现在37℃、60 min,说明这个基因对两个高温处理均作出响应,其中对37℃的高温胁迫更显著和更敏感。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2LsHsp70-2711在叶用莴苣热敏品种P-S11中的表达量分析
-->Fig. 2Expression analysis of LsHsp70-2711 of heat-sensitive type P-S11
-->
图3为LsHsp70-2711在叶用莴苣耐热品种‘G-S59’中的表达结果,37℃热激下,30 min时LsHsp70-2711的表达量达到最高,是15 min的13.5倍,60 min 的2.3倍;42℃热激下,60 min时LsHsp70-2711的表达量达到最高,是30 min的1.7倍,120 min的8倍。与对照相比,在37℃和42℃的热激处理下,LsHsp70-2711在‘G-S59’的表达趋势大致为先升高后降低,且表达量上也均明显高于对照,表达趋势与在品种‘P-S11’中的表达类似。LsHsp70-2711表达量的最大值出现在42℃、60 min。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3LsHsp70-2711在叶用莴苣耐热品种G-S59中的表达量分析
-->Fig. 3Expression analysis of LsHsp70-2711 of heat-resistant type G-S59
-->
通过图2和图3对比发现,在‘P-S11’和‘G-S59’中最大值出现时相对应处理条件分别是37℃的60 min和42℃的60 min,这一结果也证明在相同时间下‘G-S59’比‘P-S11’更耐热。在‘P-S11’中42℃处理下的表达量只在15 min、240 min、300 min时比37℃处理时稍高,其他时间下都比37℃处理时低;而在‘G-S59’中42℃处理的表达量几乎都比37℃下的处理高,说明热敏品种‘P-S11’比耐热品种‘G-S59’对高温刺激更加敏感,更易受到高温胁迫的伤害。此结果与试验过程中观察到的在相同热激处理条件下,‘P-S11’比‘G-S59’更早出现萎蔫和萎蔫程度更严重的现象相符合。表明LsHsp70-2711的表达受到高温诱导,且该基因在耐热品种中的表达高于热敏品种,据此推测LsHsp70-2711的表达与耐热性有一定的相关性。
2.6 LsHsp70-2711 VIGS基因沉默体系
2.6.1 载体构建及农杆菌转化 利用LsHsp70-2711的特异性引物,以叶用莴苣的cDNA为模板扩增出500 bp左右的片段。测序结果与LsHsp70-2711同源性100%,扩增出的片段即为所需基因片段。将克隆获得的质粒和pTRV2空载体分别双酶切,T4连接酶连接。Xbal I和Kpn I双酶切验证,确定重组质粒中含有LsHsp70-2711片段。将阳性质粒转入农杆菌GV3101,用LsHsp70-2711片段特异引物PCR验证,获得500 bp左右的片段,表达载体已成功转入到农杆菌GV3101中。2.6.2 分子检测 以空白对照和侵染植株的cDNA为模板,用TRV的特异引物进行PCR扩增。侵染植株的叶片中检测出600 bp左右的条带（图4）,未侵染 TRV 病毒的植株叶片中没有检测出条带,结果表明,能检测到病毒特异性条带的植株叶片,说明TRV病毒已成功侵入植株中。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4叶用莴苣TRV病毒检测
-->Fig. 4Detection of TRV virus in lettuce
-->
2.6.3 侵染病毒的叶用莴苣LsHsp70-2711相对表达量分析 利用RT-PCR技术对不同沉默植株LsHsp70- 2711cDNA的表达水平进行相对定量分析,运用Quantity One软件,以Action为参照。结果表明,侵染3周后的阳性植株LsHsp70-2711表达量在mRNA水平上均有所降低。阳性植株中LsHsp70- 2711表达量和阴性对照相比较侵染后基因的相对表达量下降了60%,37℃处理1 h的阳性植株与阴性植株相比下降了48%。在2 h干旱处理的叶用莴苣LsHsp70-2711的相对表达量中,阳性植株的表达量比对照植株低33%,干旱阳性植株比未处理的阳性植株低10%。高温处理和干旱处理相比,高温处理对LsHsp70- 2711的表达影响更明显。以上分析表明,构建的叶用莴苣VIGS体系能有效降低LsHsp70-2711转录水平的表达量;热激处理后的植株表达量高于未处理植株,可推测LsHsp70-2711与叶用莴苣耐热性相关;干旱处理的植株表达量低于未处理植株,可见干旱对LsHsp70-2711的表达有抑制作用。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图5侵染后叶用莴苣LsHsp70-2711相对表达量
-->Fig. 5Relative expression of LsHsp70-2711 in lettuce leaves
-->
2.6.4 侵染病毒的叶用莴苣的表型性状 从侵染第3周开始对照植株和阳性植株茎长都有显著伸长。从图6可以看出,第3周阴性对照茎长略长于空白对照,但两者间没有明显差异。阴性对照与阳性植株的茎长却有显著差异。第4周差异的显著性与第3周相似,其中第3周到第4周期间叶用莴苣的茎长有明显的伸长。侵染3周及热胁迫处理的阳性植株与对照植株茎长相比都有明显增长（图7、8）。结合处理间的数据可知,不同处理期的阳性植株茎长均显著长于对照植株,同时阳性植株LsHsp70-2711的相对表达量也明显低于对照植株。由此推测,基因沉默抑制了LsHsp70-2711的表达,使叶用莴苣茎长明显伸长,降低了叶用莴苣抵抗高温的能力,LsHsp70-2711可能在叶用莴苣耐热方面发挥重要作用。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图6侵染3、4周及热胁迫处理叶用莴苣的茎长
-->Fig. 6Stem length of lettuce in third, fourth week and heat stress
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图7侵染3周后茎长长度
-->Fig. 7Stem of the infected leaf after three weeks
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图8热胁迫7 d后茎长长度
-->Fig. 8Stem of heat stress after 7 days
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3 讨论
目前研究表明,植物中Hsp70基因家族成员广泛参与植物的逆境胁迫和代谢调控[27]。将本研究所得基因的氨基酸序列与其他物种Hsp70的氨基酸序列进行同源性比对分析发现同源性均在90%以上,推测本研究克隆获得的叶用莴苣基因序列属于Hsp70基因家族。亚细胞定位预测结果显示,LsHsp70-2711蛋白主要定位于细胞质中,预测结果与卢承琼等[28]研究结果相同。宋洪兵等[29]通过实时定量PCR表达分析表明,不结球白菜BcHSP70-1基因的表达量在不同耐热性的栽培种中有较大差异。SRIKANTHBABU等[30]研究指出,经过高温胁迫诱导的豌豆幼苗内Hsp70的mRNA量增高,而且经过直接高温胁迫后的豌豆幼苗中Hsp70转录物比经过热驯化的幼苗积累量少,且恢复生长的速度也没有经过热驯化后的幼苗快,这也说明Hsp70对提高植物的耐热性起到一定作用。此研究结果与本研究结果相似,在一定高温处理下叶用莴苣LsHsp70-2711过量表达,说明其与叶用莴苣的耐热性相关。在叶用莴苣热敏型品种‘P-S11’中,LsHsp70-2711对37℃的响应程度显著高于42℃,在耐热型品种‘G-S59’中LsHsp70-2711是对42℃时的响应程度显著高于37℃,且耐热品种‘G-S59’比热敏品种‘P-S11’更耐高温胁迫。LsHsp70-2711沉默效率较高,侵染3周的基因沉默植株表达量显著低于对照植株,热胁迫处理和干旱处理的沉默阳性植株表达量也显著低于对照植株。在形态方面,热胁迫处理和不处理的阳性植株茎长都显著大于对照植株,这与基因表达量结果相同。相对而言,叶用莴苣中LsHsp70-2711的表达在高温处理比干旱处理更明显。因此,从基因的表达量和形态变化上可以看出,LsHsp70-2711与叶用莴苣的耐热性相关性较大,干旱也会有抑制作用。下一步计划通过遗传转化方法,获得LsHsp70-2711转基因植株,分析基因表达情况和功能鉴定,同时结合LsHsp70-2711蛋白研究,进一步深化认识植物响应高温胁迫进行适应性生长的分子机制。
4 结论
从叶用莴苣叶片中克隆到Hsp70的同源基因,命名为LsHsp70-2711。该基因开放阅读框长度为2 154 bp,编码718个氨基酸。qRT-PCR表明LsHsp70-2711的表达受高温诱导,且该基因在耐热品种中的表达高于热敏品种,推断LsHsp70-2711的表达与耐热性有一定相关性。VIGS基因沉默体系构建证明LsHsp70-2711的沉默降低了叶用莴苣抵抗高温的能力,热胁迫阳性植株在表达量和表型上都显著有别于对照植株,表明LsHsp70-2711与叶用莴苣耐热性相关。The authors have declared that no competing interests exist.
