0 引言
【研究意义】捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是反刍动物主要的胃肠道线虫之一,属毛圆科血矛属,成虫主要寄生于牛羊的真胃中。其引起的疾病以消瘦、贫血以及慢性消耗性症状为主,在感染严重的情况下可引起大批死亡[1]。该病在中国呈全国性流行,感染率在26.4%—80%之间[2-3]。目前捻转血矛线虫病的防控仍然是以药物预防为主,但线虫耐药问题的日益严重[4],因此迫切需要新型抗线虫药物缓解现状。近年来,药物靶标的筛选已成为药物开发的主流方向[5],而药物靶标的功能分析是其中重要的一环。理想的药物靶标通常存在于病原体感染、存活以及繁殖过程中所必需,而与宿主有明显区别的代谢通路中[6]。寄生线虫需氧的营自由生活与微氧的寄生生活两个阶段决定了其具有不同的脂肪酸代谢与能量代谢方式;尤其寄生生活阶段,线虫在宿主体外发生的脂肪酸β-氧化等生理过程将会因宿主体内的微氧环境而受到抑制,糖酵解成为寄生阶段线虫获能的主要方式[7-8]。因而线虫独特的脂肪酸代谢机制为新型药物的研发提供了潜在的药物靶位点。【前人研究进展】寄生线虫寄生阶段不能通过实验室进行模拟,使得有关真核生物代谢通路的机制研究均不能在其体内有效开展。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）主要通过滞育信息素感知外界环境,决定生长发育的方向[9-10]。其中,过氧化酶体的脂肪酸β-氧化过程是滞育信息素合成的主要途径[11]。长链脂肪酸或超长链脂肪酸依次在酰基辅酶A氧化酶ACOX-1、水合酶MAO-1、β-羟烷基辅酶A脱氢酶Ce-DHS-28及硫解酶Ce-DAF-22[12]催化的级联反应下逐步水解并生成滞育信息素。DAF-22作为脂肪酸代谢中过氧化物酶体β-氧化的关键酶,对秀丽隐杆线虫的生存非常重要,若此过程不能进行即不能产生相应的滞育素来感知外界环境[12-14]。在这一过程中,Ce-DAF-22主要是将由脱氢酶Ce-DHS-28催化生成的 β-酮脂酰辅酶 A 中间体硫解[15]。Ce-DAF-22功能缺失的线虫突变株不能合成滞育信息素,且虫体内出现大量的脂肪酸积聚,呈现病态[16]。已有研究报道分离自捻转血矛线虫体内的Hc-DAF-22是DAF-22的同源类似物,初步的研究表明Hc-daf-22能够一定程度上补偿秀丽隐杆线虫因daf-22缺失引起的生理缺陷[17],猜测Hc-daf-22在捻转血矛线虫体内可能具有与daf-22相似的功能能明显改变该线虫的滞育表型,而且这个改变伴随有线虫体内脂肪颗粒积聚量的变化。而越来越来多的实验表明Hc-DAF-22可能作为关键酶参与了线虫的长链脂肪酸代谢,控制着线虫的发育[18]。分析发现Hc-DAF-22的N末端具有典型的参与长链脂肪酸代谢的 I 型脂肪酸硫解酶（即3-酮脂酰辅酶A硫解酶）功能域,在C末端具有典型的酰基辅酶A转移酶的保守功能域,推测具有类似于Ce-DFA-22硫解酶活性的潜力。【本研究切入点】目前对捻转血矛线虫Hc-daf-22研究较多,对其Hc-DAF-22蛋白活性研究较少,本研究拟在已有研究基础上生物体外利用酶学相关技术研究Hc-DAF-22的硫解酶活性。【拟解决的关键问题】为进一步明确Hc-daf-22的可能的生物学功能,通过对原核表达的Hc-DAF-22蛋白进行了体外酶活试验,确定Hc-DAF-22蛋白的硫解酶活性,为进一步研究Hc-DAF-22蛋白的生物学功能奠定了基础。1 材料与方法
试验于2015年5月至2016年12月在浙江大学预防兽医研究所寄生虫病理生物学研究室进行。1.1 虫体、菌株与质粒
捻转血矛线虫ZJ株成虫由浙江省动物预防医学重点实验室分离,鉴定并保存;质粒pET-22b(+)vector、菌株E. coli TOP10和E. coli BL21（DE3）由浙江省动物预防医学重点实验室制备并保存;和质粒pMD19-T vector购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）。1.2 试剂与试剂盒
T4 DNA连接酶、TaKaRa LA TaqTM酶、限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ等购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）。质粒抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购自Axygen公司。乙酰乙酰辅酶a、辅酶a均购自Sigma公司;Millipore超滤管、Bio-Rad蛋白浓度测定试剂盒购自Promega公司;Ni-NTA亲和色谱树脂购自Qiagen公司。1.3 捻转血矛线虫Hc-daf-22基因的克隆
根据NCBI已公布的H. contortus ZJ株Hc-daf-22基因序列（GenBank登录号：HQ738470.1）设计特异性引物,具体引物序列为Hc-daf-22-F: CGCGAATTC TAAATGGGTAAATCAAAAGTATATGT（下划线为限制性内切酶EcoRⅠ的识别位点）,Hc-daf-22-R: GCCGTCGACGATTTTCGCTTTGAGCATTT（下划线为SalⅠ的识别位点）,引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成。以捻转血矛线虫RNA反转录的cDNA为模板,用LA TaqTM酶扩增,PCR条件：94℃ 5 min;94℃ 30 s;62℃ 30 s;72℃ 90 s;32个循环;72℃延伸10 min。PCR产物连接至pMD19-T载体,再将连接产物转入E. coli TOP10感受态细胞中,菌液PCR鉴定阳性菌落,将阳性菌液送至上海博尚生物技术有限公司测序分析。1.4 捻转血矛线虫Hc-DAF-22表达载体的构建及原核表达
选取测序正确的pMD19-T-daf22质粒与pET-22b质粒,同时用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后回收目的片段与载体,用T4 DNA连接酶进行连接,继而转入E. coli TOP10感受态细胞,挑取克隆经PCR鉴定后,阳性克隆抽提质粒后用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定。双酶切鉴定正确的重组质粒转化至表达型大肠杆菌株BL21（DE3）,鉴定为阳性克隆的菌种于20%甘油中-80℃保存。将BL21接种于200 mL（Amp 100mg·L-1）LB培养基中,30℃培养3h左右,至菌液OD600为0.6左右时,加入IPTG至终浓度为0.1 mmol·L-1。诱导表达4 h,完成后将培养基在4℃以8 000×g 离心10 min, 弃上清,用50 mmol·L-1 PBS 缓冲液（pH=7.4）重悬细胞,冰浴条件下超声波破碎细胞。细胞破碎完成后,12 000×g,4℃离心30 min,收集上清。分别取10 μL上清液与沉淀液进行SDS-PAGE电泳检测表达情况。
1.5 捻转血矛线虫Hc-DAF-22蛋白的分离纯化
收集含DAF-22蛋白组分的细胞破碎上清液,加入到用PBS（pH=7.4）预先平衡的镍琼脂糖凝胶柱中,控制流速1 mL·min-1。经PBS平衡后用含不同浓度咪唑的缓冲液进行阶段洗脱,流速2 mL·min-1,收集洗脱液。含有目的蛋白的洗脱成分用超滤管过滤,收集除盐浓缩后的蛋白,SDS-PAGE检测蛋白回收情况。验证后,将纯化的Hc-DAF-22蛋白经SDS-PAGE电泳后,转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上,经5%脱脂乳封闭,以抗His血清为一抗,羊抗兔HRP-IgG（1﹕ 4 000）为二抗,通过DAB底物显色进行Western Blot鉴定。按照Bio-Rad公司蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。1.6 酶活标准曲线的绘制
天然状态下的乙酰乙酰CoA（AcAc-CoA）分子会发生酮-烯醇互变形成烯醇化合物,该烯醇化合物能与Mg2+结合后在303 nm处形成特征吸收峰（ε303=16.5 mM-1cm-1）[19]。将乙酰乙酰辅酶A（AcAc- CoA）配制成0、3、6、9、12、15 μmol·L-1等4个浓度梯度分别加入20 mmol·L-1 MgCl2。测定不同浓度在303 nm 波长处的吸光值,根据吸光值与AcAc-CoA浓度关系绘制AcAc-CoA标准曲线,按照AcAc-CoA标准曲线计算出反应产物浓度。
1.7 Hc-DAF-22蛋白酶活测定
我们利用AcAc-CoA烯醇化合物这一特征和硫解酶体外测活体系（50 mmol·L-1 Tris-Cl pH8.1,20 mmol·L-1 MgCl2,60 μmol·L-1 CoA,10 μmol·L-1 AcAc- CoA,加入约0.1 μg蛋白）,通过记录反应过程中由于底物（AcAc-CoA）的减少而引起303 nm波长下的吸光值的变化,从而计算出硫解反应的初始反应速率。酶促反应的方程式如下所示：
1.7.1 Hc-DAF-22蛋白最适温度及最适pH的确定 在相同条件下,取AcAc-CoA底物浓度为10 μmol·L-1的反应体系（50 mmol·L-1 Tris-Cl pH8.1,20 mmol·L-1 MgCl2,60 μmol·L-1 CoA,10 μmol·L-1 AcAc-CoA,加入约0.1 μg蛋白于室温起始反应）,调节反应体系的反应温度,设置温度梯度为32.0、33.0、35.0、37.0、38.0、39.0、40.0℃。震荡反应30min,反应完成后,测定不同温度条件下反应体系的 OD303值。同理,在测得的最适温度条件下,调节反应体系的pH,设置pH梯度为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0,反应完成后测定不同pH条件下反应体系的OD303值。
1.7.2 Hc-DAF-22蛋白Km与Vmax的确定 在最适pH和最适温度条件下,在其他反应体系一致的情况下,AcAc-CoA浓度分别设置为15、30、40、100、150 μmol·L-1的底物溶液中分别加入0.1 μg重组蛋白溶液,进行多次酶促反应。每隔1 min测定一次反应体系的OD303值。根据酶促反应数据计算出初始反应速率,进一步计算得到初始反应速率倒数1/v与底物浓度倒数1/[S],然后以1/[S]对1/v作图,根据直线斜率和截距得出米氏常数Km与Vmax[20]。
2 结果
2.1 Hc-daf-22基因的克隆及其鉴定
以捻转血矛线虫成虫mRNA逆转录的cDNA为模板,PCR扩增Hc-daf-22。1%琼脂糖凝胶电泳分析显示,在1 500 bp附近有单一明显的条带,大小与预期片段一致（图1-A）,测序结果与NCBI已公布的H. contortus ZJ株Hc-daf-22基因序列比对基因相似度为99.9%。选择pET-22b-Hc-daf22阳性克隆用EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切鉴定。酶切后,获得约1 500 bp的片段与约4 000 bp的片段,与预期结果相符（图1-B）,证明Hc-daf22已正确转入pET-22b中。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1Hc-daf-22序列扩增结果及pET-22b-Hc-daf-22酶切鉴定
-->Fig. 1Cloning of Hc-daf-22 gene fragment and identification of pET-22b-Hc-daf-22 by digestion
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2Hc-DAF-22重组蛋白在大肠杆菌BL21菌株中的诱导表达情况
-->Fig. 2Hc-DAF-22 protein expressed in E. coli strains BL21
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2.2 Hc-DAF-22蛋白的表达,纯化及其鉴定
2.2.1 Hc-DAF-22蛋白诱导表达 将带有Hc-daf-22- pET-22b重组质粒的E. coli BL21菌液扩大培养,经IPTG诱导表达4 h,离心菌液,50 mmol·L-1浓度的PBS溶液重悬菌体溶液,冰浴超声破碎后分别进行SDS- PAGE分析。根据Hc-daf-22-pET-22b质粒的载体图,利用EditSeq软件预测融合表达蛋白分子量约为59 kD,SDS-PAGE结果显示蛋白条带大小与软件预测的结果一致,在上清和沉淀中均有表达,呈部分可溶（图3）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3Hc-DAF-22重组蛋白纯化后的SDS-PAGE分析及Western Blot鉴定
-->Fig. 3SDS-PAGE analysis of purified protein and Western blot analysis
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2.2.2 Hc-DAF-22蛋白分离纯化及鉴定 收集亲和色谱纯化后的目标蛋白,SDS-PAGE检测蛋白纯化情况。经纯化超滤的重组蛋白如图3-A,蛋白大小与预期一致为59 kD,且浓度较高无杂带。重组蛋白以抗His血清作为一抗Western Blot鉴定,结果显示蛋白大小与预期一致为59 kD（图3-B）。蛋白浓度测定按照蛋白浓度测定试剂盒进行,测得蛋白浓度为1.70 μg·μL-1。说明纯化的可溶性蛋白浓度较高,可用于后续酶活性测定。
2.3 Hc-DAF-22蛋白酶活性测定
2.3.1 乙酰乙酰辅酶a标准曲线的绘制 按照文献[19]所述,以底物乙酰乙酰辅酶a为标准物,测定其不同浓度对应的吸光值,绘制浓度标准曲线。如图4-A所示,绘制的标准曲线R2=0.99289,满足试验要求。试验中可通过OD值的变化判断AcAc-CoA的反应量,进而推测Hc-DAF-22催化下的反应速率。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4Hc-DAF-22蛋白酶活测定相关数据
-->Fig. 4Enzyme activity deternimation of Hc-DAF-22
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2.3.2 Hc-DAF-22蛋白酶活性反应最适温度确定 在反应体系与其他反应条件一致的情况下,如图4-B所示,在37℃反应条件下,Hc-DAF-22蛋白活性最高,说明其最佳反应温度为37℃。并且在32—39℃温度区间,蛋白酶活性先升高后降低,且保持在80%以上;当温度达40℃时,其蛋白活性仅剩40%左右,说明40℃对蛋白酶活性有较大影响,该蛋白酶不耐高温。
2.3.3 Hc-DAF-22蛋白酶活性反应最适pH确定 在37℃反应温度下,不同pH条件下测定酶活,数据如图4-C所示。可知,pH从中性到碱性的变化过程中,酶的活性先升高后降低,在pH=8.0的弱碱性环境中达到最大活性。因此,说明Hc-DAF-22蛋白偏好在弱碱环境中发挥活性,当pH为8.0时,该蛋白酶活性最强;当pH继续升高时,该酶活性不断下降,在pH为10时,酶活性接近0,说明强碱对酶活性有抑制性作用。
2.3.4 不同底物浓度下,Hc-DAF-22酶活性测定 测定不同底物浓度下Hc-DAF-22酶反应速率,运用浓度速度双倒数做图,结果如图4-D所示。根据方程计算,可得Vmax=1 784 nmol·L-1·min-1,Km=33.765 μmol·L-1。
3 讨论
目前,关于寄生性线虫脂肪酸代谢通路研究较少,但已有研究在捻转血矛线虫发现与秀丽线虫硫解酶基（Ce-daf-22）具有高同源性的新基因Hc-daf-22,预测编码的氨基酸同源性为83%[20]。因此,推测捻转血矛线虫存在与秀丽线虫相似的过氧化物酶体β-氧化过程。本试验成功克隆捻转血矛线虫Hc-daf-22,并在大肠杆菌原核表达系统中表达。选择pET-22b作为表达载体,在低温条件下诱导有利于融合蛋白的表达,在一定程度上可增加表达蛋白的可溶性[21],本研究获得pET-22b- Hc-daf-22可溶性重组蛋白。在模式生物C. elegans体内,Ce-DAF-22通过参与过氧化酶体长链脂肪酸代谢途径从而影响脂肪颗粒的体内积聚而改变虫体的发育方向[22-23]。分析发现Hc-DAF-22的N末端具有典型的参与长链脂肪酸代谢的I型脂肪酸硫解酶（即3-酮脂酰辅酶A硫解酶）功能域,在C末端具有典型的酰基辅酶A转移酶的保守功能域,具有类似于Ce-DAF-22硫解酶活性的潜力[24]。由此推测在H. contortus体内同样存在与上述C. elegans相似的脂肪酸代谢途径,而 Hc-DAF-22具有长链脂肪酸硫解酶活性,参与线虫生活方式的某些剧变过程,参与决定虫体进入寄生阶段后的发育方向,而参与滞育形成只是其影响虫体生长发育的表现之一[25]。本试验参照C. elegans硫解酶测定方法[26]对Hc-daf-22硫解酶活性进行体外测定,了解Hc-DAF-22硫解酶活性及其他生化特性,并比较秀丽线虫与捻转血矛线虫DAF-22硫解酶活性差异。体外酶活测定试验结果显示,Hc-DAF-22 最佳反应pH为8.0,此结果与李志杰[27]研究秀丽线虫Ce-DAF-22蛋白酶活所得结果一致,且哺乳动物同源蛋白酮脂酰辅酶A硫解酶最适反应pH为8.3[28],说明该硫解酶最适反应pH一致,均在弱碱环境下反应活性最高。本试验测得,Hc-DAF-22最佳酶活反应温度为37℃,在相同反应时间内,37℃蛋白可完全反应,其最佳反应温度与环境温度及宿主体温相比,与捻转血矛线虫所寄生宿主牛羊体温更为接近,说明该蛋白在寄生阶段酶活反应效率较高,推测捻转血矛线虫在寄生阶段因能量需求更大,脂肪酸代谢比自由生活阶段强烈[29]。另一方面已有研究表明在Hc-daf-22基因在虫体滞育阶段差异表达,达脱鞘L3幼虫（ExL3）与L4阶段呈高丰度表达[21],因此推测与Hc-daf-22在寄生阶段参与H. contortus的滞育形成有关。
本试验采用了经典的硫解酶Mg2+测定法,首次测定得捻转血矛线虫DAF-22蛋白硫解酶活性参数Vmax=1 784 nmol·L-1·min-1,Km=33.765 μmol·L-1。李志杰等[27]测得Ce-DAF-22蛋白硫解酶活参数为Vmax= 2 810 nmol·L-1·min-1,Km=13 μmol·L-1;JIA等[30]测得鼠过氧化物酶体3-酮脂酰辅酶A硫解酶硫解酶活参数为Vmax=30 000 nmol·L-1·min-1,Km=21 μmol·L-1。与这些同源蛋白相比,捻转血矛线虫DAF-22蛋白,酶活性与Ce-DAF-22接近但仍偏小;与鼠过氧化物酶体3-酮脂酰辅酶A硫解酶相比,酶活性为鼠硫解酶的十分之一左右。总体来说,捻转血矛线虫DAF-22蛋白酶活性相对较低,所需反应较长,其Km较高,达最大反应速度时所需的底物浓度相对较高。
4 结论
捻转血矛线虫DAF-22蛋白是过氧化物酶体脂肪酸β氧化的关键酶之一,本研究在利用E. coli BL21对HC-DAF-22进行了表达,经纯化、复性后,该重组蛋白能够对乙酰乙酰辅酶A体现出一定的催化活性,Vmax和Km值分别是33.765 μmol·L-1和1 784 nmol·L-1·min-1,其最适反应pH为8.0,最佳反应温度为37℃,结果表明Hc-DAF-22具有一定硫解酶活性,但与秀丽线虫同源蛋白相比硫解酶活性较低。The authors have declared that no competing interests exist.
