0 引言
【研究意义】荞麦是蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum）[1]一年生双子叶植物,有苦荞（F．tataricu）和甜荞（F．esculentum）2个栽培种[2]。荞麦起源于中国,分布区域广泛[3]。甜荞生育期短（生育期70—80 d）,对种植环境要求低,是备荒救灾、添闲补缺最理想、最经济的优势作物。甜荞营养价值高,营养元素全面,富含生物类黄酮和芦丁等[4-6]。【前人研究进展】倒伏、落粒、机械化程度低和连作障碍是甜荞大田生产上出现的主要问题[7-11]。倒伏是导致甜荞减产的重要因素,在自然灾害严重的季节,甜荞严重倒伏导致减产甚至绝收。近年来荞麦种植面积持续减少,其中,2014年荞麦种植面积不到1991年的二分之一[12]。研究发现,抗倒伏和作物茎秆木质素含量紧密相关[13-16],木质素是植物体中仅次于纤维素的酚类聚合体,占植物体干重的16%—30%[17],是细胞壁的重要组成部分,填充于纤维素框架中增强植物体的机械强度[18]。木质素增强了植物抗旱、抗涝、抗寒,尤其是抗倒伏等非生物胁迫的能力[19]。国内外****研究发现,木质素提高了小麦[20-21]、油菜[22]、大豆[23]等粮食作物的茎秆抗倒伏能力;陈晓光[24]研究表明,不同小麦品种的茎秆木质素含量存在明显差异,茎秆抗倒伏能力强的品种其木质素含量高,茎秆木质素含量可作为小麦品种抗倒伏性评价的一个重要指标。木质素主要由G、S和H型3种木质素单体组成。不同物种中木质素含量及组成各不相同,双子叶植物的木质素主要是由G型木质素单体和S型木质素单体组成;而单子叶植物则是由G、S和H型木质素单体组成[25]。师竹娟[26]通过提高甘蓝型油菜中G型木质素单体含量增强植物的抗病性和抗倒伏能力。BAUCHER等[17]通过转基因的方法改变被子植物S/G（S型木质素单体/G型木质素单体）的比率,提高被子植物的抗倒伏性。【本研究切入点】前人对木质素进行了大量研究,但甜荞木质素及其单体的合成特征尚不清楚。【拟解决的关键问题】本研究以3个抗倒伏能力不同的甜荞品种为试验材料,研究其木质素和木质素单体的合成特征,为甜荞的抗倒伏栽培和育种提供理论依据。1 材料与方法
1.1 试验设计
试验于2015年在重庆市西南大学歇马科研基地进行。该区属亚热带季风性湿润气候,土壤为砂壤土。供试品种3个,分别是酉荞2号（高抗倒伏、YQ2）、信农1号（中抗倒伏、XN1）和乌克兰大粒荞（易倒伏、UD）[9]。8月25日播种,随机区组设计,小区面积10 m2（5 m×2 m）,行距33 cm,种植6行,小区间隔50 cm,3次重复。人工条播,三叶期定基本苗90万株/hm2,试验地四周播种3行保护行,常规管理。1.2 测定内容与方法
1.2.1 样品制备 分别在荞麦分枝期、盛花期和乳熟期取样,每个小区随机选取20株长势一致未倒伏的植株,取其中10株剪取茎秆第2节间,-80℃冰箱保存,用于木质素含量的测定。另外10株剪取茎秆第2节间于60℃烘干,用粉碎机打成粉末,过60目筛,用于木质素单体的测定。1.2.2 木质素及木质素单体含量测定
木质素含量测定参照陈晓光[24]和林葵等[27]的方法。
木质素单体测定参照ROLANDO等[28]的方法进行改进：称取5 mg茎秆的风干样品置于15 mL玻璃瓶中,加入1 mL新鲜配制的反应液（0.025 mL BF3和0.1 mL EtSH溶于0.875 mL二氧杂环乙烷）,置于100℃恒温烘箱中反应4 h（每隔1 h轻轻摇动反应瓶）。反应结束后将反应瓶置于冰盒中冰浴5 min,停止反应,然后加入0.3 mL浓度为0.4 mol ·L-1的NaHCO3调pH=4。再加2 mL超纯水、0.2 mL浓度为0.5 mg·mL-1的内标二十四烷（溶于乙酸乙酯）和0.8 mL的乙酸乙酯,充分涡旋,静置10 min,吸取上层的有机相300 μL,用氮吹仪于35℃吹干。得到的油状物重新溶于200 μL的丙酮中,氮吹仪于35℃吹干,重复2次,最后将油状物溶于500 μL的乙酸乙酯。用0.22 μm有机滤膜过滤,加入100 μL TMS、20 μL吡啶和100 μL N,O-双（三甲硅基）乙酰胺,25℃静置2 h。取2μL进行GC分析,重复6次,取其平均值。色谱条件：HP-5MS型的石英毛细管色谱柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）。FID检测器：载气为高纯氮气,载气流速1 mL·min-1,进样口温度260℃;采用分流比进样模式,进样量2 μL。柱子升温程序：初始温度130℃保持3 min,以3℃·min-1升温至250℃,保留5 min。质谱条件：EI离子源,离子源温度200℃,电子能量70 eV,接口温度250℃;溶剂延迟30 min。
1.2.3 茎秆抗折力和抗倒伏指数测定 分别在荞麦分枝期、盛花期和乳熟期于田间随机选取5株长势一致未倒伏的植株,贴近地表用剪刀剪取植株,用于测定茎秆重心高度、鲜重、茎秆抗折力和倒伏指数。
茎秆重心高度：用米尺准确量取茎秆基部至该茎
（含叶、叶鞘和种子）平衡支点的距离,即为茎秆重心高度;
茎秆鲜重：天平称取植株鲜重;
茎秆抗折力：取茎基部第二节间,置于SH-100数显示拉力计,将植株拉断瞬间的数值计为茎秆抗折力,单位g;
倒伏指数(cm g·g-1) = (茎秆重心高度×茎秆鲜重)/茎秆抗折力。
1.3 数据处理与分析
利用Microsoft Excel 2007进行数据处理,DPS7.05软件进行方差分析和显著性检验。2 结果
2.1 茎秆抗折力和倒伏指数
分枝期到乳熟期,各甜荞品种茎秆抗折力均先增大后减小,在盛花期达最大值（表1）。在同一生育期,高抗倒伏品种的茎秆抗折力显著中抗倒伏品种和易倒伏品种。相同生育时期,易倒伏品种的倒伏指数显著高于中抗倒伏和高抗倒伏品种。各品种倒伏指数变化趋势略有差异,分枝期到乳熟期,高抗倒伏和易倒伏品种的倒伏指数先升高后降低,在盛花期达到最大值;中抗倒伏品种的倒伏指数逐渐增加,在乳熟期达到最大值。Table 1
表1
表1不同甜荞品种茎秆抗折力和倒伏指数
Table 1The analysis of culm snapping resistance and lodging index of different common buckwheat cultivars
| 品种 Cultivar | 茎秆抗折力 culm snapping resistance (g) | 倒伏指数 Lodging index (cm g·g-1) | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 分枝期 Branching stage | 盛花期 Full bloom stage | 乳熟期 Milk ripe stage | 分枝期 Branching stage | 盛花期 Full bloom stage | 乳熟期 Milk ripe stage | |
| 酉荞2号 YQ2 | 452.24±35.70a | 854.70±8.94a | 751.75±18.16a | 0.25±0.03c | 0.54±0.03c | 0.43±0.06c |
| 信农1号 XN1 | 336.13±31.48b | 563.27±17.10b | 420.65±32.20b | 0.57±0.06b | 0.75±0.02b | 0.77±0.03b |
| 乌克兰大粒荞 UD | 197.52±15.90c | 370.51±9.98c | 353.7±15.40c | 2.06±0.18a | 2.79±0.13a | 2.67±0.06a |
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2.2 茎秆木质素含量
甜荞茎秆木质素含量从分枝期到乳熟期逐渐增加,乳熟期木质素含量达到最大值。同一生育时期,3个品种木质素含量呈差异极显著（表2）,高抗倒伏品种木质素含量显著高于中抗倒伏和易倒伏品种。高抗倒伏、中抗倒伏和易倒伏品种从分枝期到盛花期,木质素含量分别增加0.956、0.407和0.422 OD·g-1 FW;盛花期到乳熟期,木质素含量分别增加0.424、0.57和0.082 OD·g-1 FW。Table 2
表2
表23个时期不同甜荞品种茎秆木质素含量
Table 2Lignin content of culm in different buckwheat cultivars at three stages (OD·g-1 FW)
| 品种 Cultivar | 分枝期 Branching stage | 盛花期 Full bloom stage | 乳熟期 Milk ripe stage |
|---|---|---|---|
| 酉荞2号 YQ2 | 1.243±0.029aA | 2.199±0.028aA | 2.623±0.034aA |
| 信农1号 XN1 | 0.754±0.042bB | 1.161±0.048cB | 1.731±0.065bB |
| 乌克兰大粒荞 UD | 0.456±0.033cC | 0.872±0.044dC | 0.954±0.056cC |
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2.3 茎秆木质素单体含量
甜荞茎秆硫代酸解所得产物经GC-MS分析之后,H、G和S型木质素衍生的木质素单体依据分子离子峰做定性鉴定（图1—图3）。测定的木质素单体含量见表3。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1甜荞分枝期主要气相谱峰
A、B、C分别代表酉荞2号、信农1号、乌克兰大粒荞的硫代硫酸解产物;IS：内标,H、G、S分别代表H、G、S型木质素。下同
-->Fig. 1Typical gas chromatography flame ionization detector (FID) traces for common buckwheat at branching stage
Thioacidolysis products A, B, C represent YQ2, XN1 and UD, respectively. IS: Internal standard; H: p-hydroxyphenyl monomer; G: Guaiacyl monomer; S: Syringly monomer. The same as below
-->
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2甜荞盛花期主要气相谱峰
-->Fig. 2Typical gas chromatography flame ionization detector (FID) traces for common buckwheat at full bloom stage
-->
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3甜荞乳熟期主要气相谱峰
-->Fig. 3Typical gas chromatography flame ionization detector (FID) traces for common buckwheat at milk ripe stage
-->
相同生育时期甜荞茎秆总木质素单体含量为酉荞2号>信农1号>乌克兰大粒荞。各甜荞品种总木质素单体含量从分枝期到乳熟期逐渐增加。分枝期到乳熟期酉荞2号、信农1号和乌克兰大粒荞总木质素单体分别增加29.35、45.32和30.63 μmol·g-1,增幅达38.9%、108.3%和89.2%。
在各生育时期,甜荞S型木质素单体含量最高,G型木质素次之,H型木质素单体含量最低。G型和S型的木质素单体从分枝期到乳熟期逐渐增加。同一生育时期,酉荞2号S、G和H型的单体含量均最高,信农1号次之,乌克兰大粒荞均最低。分枝期到乳熟期,酉荞2号、信农1号和乌克兰大粒荞的G型木质素单体增幅分别为126.3%、284.1%和142.0%;S型木质素单体增幅分别为15.1%,64.8%和72.7%。H型的木质素单体含量从分枝期到乳熟期不断降低,酉荞2号、信农1号和乌克兰大粒荞降低的幅度分别为20.5%、24.1%和23.5%。分枝期到乳熟期,各甜荞品种的S/G比率逐渐降低。
Table 3
表3
表33个时期不同甜荞品种茎秆木质素单体含量
Table 3Lignin monomer content of culm in different buckwheat cultivars at three stages
| 样品 Sample | H、G和S单体的硫代酸解产量 Thioacidolysis yield in H, G and S monomers (μmol·g-1) | 总单体 Total monomer yield (μmol·g-1) | S/G | ||
|---|---|---|---|---|---|
| H | G | S | |||
| BYQ2 | 2.29±0.25 | 17.92±2.14 | 54.17±4.36 | 75.38 | 3.02 |
| BXN1 | 1.45±0.14 | 8.89±1.23 | 31.5±3.59 | 41.84 | 3.54 |
| BUD | 1.32±0.11 | 10.01±1.04 | 23.01±3.15 | 34.34 | 2.3 |
| FYQ2 | 2.06±0.25 | 30.29±3.89 | 56.84±5.25 | 89.19 | 1.87 |
| FXN1 | 1.36±0.15 | 22.35±2.74 | 43.91±3.95 | 67.62 | 1.96 |
| FUD | 1.21±0.12 | 13.09±1.08 | 25.31±2.11 | 39.61 | 1.93 |
| MYQ2 | 1.82±0.24 | 40.55±4.09 | 62.36±6.54 | 104.73 | 1.54 |
| MXN1 | 1.1±0.13 | 34.15±4.11 | 51.91±5.58 | 87.16 | 1.52 |
| MUD | 1.01±0.09 | 24.22±2.89 | 39.74±4.16 | 64.97 | 1.64 |
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3 讨论
3.1 茎秆抗倒伏和木质素含量
木质素在植物细胞壁广泛存在,具有增加细胞壁硬度、加强细胞壁的机械支持力和抗压强度、促进机械组织的形成等作用。彭佃亮[29]研究表明,小麦茎秆基部第二节间的木质素积累量与节间的抗折强度及茎秆抗倒伏指数呈显著正相关,而与小麦在成熟期倒伏面积大小呈显著负相关,这说明茎秆中木质素积累量的提高能提高小麦茎秆的抗折力,茎秆木质素含量高能显著增强小麦的抗倒伏性能进而降低小麦倒伏发生的风险。陈晓光[24]研究发现,茎秆抗倒伏指数与木质素含量呈显著正相关,高氮肥处理小麦茎秆木质素合成相关的酶活性降低,茎秆木质素含量、抗折力和抗倒伏指数降低。黄杰恒[30]对甘蓝型油菜的研究发现,油菜茎秆木质素的含量与茎秆抗折力间均存在显著或极显著的正相关关系,说明茎杆木质素含量愈高,茎秆的机械强度愈强,抗折性也愈强。本研究中,各生育时期高抗倒伏甜荞木质素含量和茎秆抗折力均大于中抗倒伏和易倒伏品种。这与小麦、甘蓝型油菜等的研究结果一致。酉荞2号、信农1号和乌克兰大粒荞从盛花期到乳熟期木质素增加量分别是分枝期到盛花期增加量的44.35%、140.05%和19.43%;信农1号增幅最大,乌克兰大粒荞次之,酉荞2号最小。分枝期酉荞2号木质素含量（1.243 OD·g-1 FW）大于成熟期乌克兰大粒荞木质素含量（0.954 OD·g-1 FW）,也大于盛花期信农1号木质素含量（1.161 OD·g-1 FW）,略小于成熟期信农1号木质素含量（1.731 OD·g-1 FW）。说明分枝期是高抗倒伏甜荞积累木质素的关键时期。酉荞2号、信农1号和乌克兰大粒荞盛花期茎秆抗折力最大,乳熟期木质素含量最高。信农1号乳熟期倒伏指数最大,酉荞2号和乌克兰大粒荞盛花期倒伏指数最大。这种现象出现的原因可能是盛花期和乳熟期甜荞生殖生长旺盛,植株鲜重和重心高度增加,导致倒伏指数大。茎秆抗折力不仅与木质素还与茎秆粗度,节间长度等因素有关[9],因此木质素含量最高的时期茎秆抗折力不一定大。3.2 木质素单体的合成特点
GC-MS是分析木质素H-G-S组分相对含量的实用的工具。木质素裂解产生相对简单的酚类化合物的混合物,这些混合物由乙醚分解和特定的碳碳连接,这些酚类化合物从木质素聚合物中保留它们的替代模式,因此可以从木质素单元中确定化合物H-G-S的相对含量。JORGE等[31]报道,蓝桉中H型木质素单体是最先储存的,其次是G型,最后是S型。本研究中,各甜荞品种,S/G比率和H型的单体数量从分枝期至乳熟期不断下降,结果表明,H型木质素单体是首先沉积类型,其次是S型,然后G型,这与前人对其他作物的研究结果有差别;MAZUMDER等[32]报道在尚未木质化的纤维中,S/G比率随植物成熟不断增加;ROBINSON等[33]报道,野生型杨树的S/G比率为70/30时许多落叶性被子植物的一个典型比率。此外,黄杰恒[30]研究表明,甘蓝型油菜的木质素单体主要由S型和G型单体组成;蕾薹期至青荚期,甘蓝型油菜木质素单体比例S/G呈上升趋势,不同时期间达到极显著差异,说明S型木质素单体占总木质素单体的比例越来越高。本研究结果表明,甜荞茎秆S和G型木质素单体含量高,H型木质素单体含量低,并且乳熟期H型木质素单体分别占酉荞2号、信农1号和乌克兰大粒荞总木质素单体的1.73%、1.26%和1.55%,说明甜荞木质素单体主要为S-G型。这与甘蓝型油菜的研究结果一致。甜荞S/G比率随着生育时期不断降低,说明随着生育时期G型木质素单体占总木质素单体的比例越来越高。这与黄杰恒[30]对油菜木质素素单体的研究结果有差异,说明不同作物之间木质素单体的合成特征有区别。分枝期,高抗倒伏品种S型木质素单体含量高,是中抗倒伏品种的1.72倍、易倒伏品种的2.35倍,差异明显;分枝期到成熟期,高抗倒伏品种S型木质素单体增幅小于中抗倒伏品种和易倒伏品种。表明分枝期是高抗倒伏甜荞大量积累S型木质素单体的关键时期。
4 结论
甜荞茎秆木质素单体主要为S-G型。高抗倒伏品种木质素及其单体的合成特征主要是：各生育时期木质素、总木质素单体、G型、S型和H型木质素单体含量高于中抗倒伏和易倒伏品种;分枝期大量积累S型木质素单体,分枝期到乳熟期主要积累G型木质素单体。
The authors have declared that no competing interests exist.
