0 引言
【研究意义】玉米大斑病（northern leaf blight of corn）是玉米上的重要叶部病害,现已遍布美洲、欧洲、亚洲、非洲和大洋洲等玉米产区。在中国以东北、华北、西北和南方山区的冷凉玉米产区较易流行,发生严重的年份感病品种减产可达50%以上[1-3]。该病害由玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）引起,病菌可通过分生孢子实现病害的远距离传播[4],其分生孢子具有抵抗高温、低温、干燥和营养缺乏等不良环境的能力,当遇到适宜的环境和寄主条件时分生孢子可以萌发并侵染寄主,导致病害的发生[5-7]。因此,探索影响分生孢子产生的外界条件、分析调控分生孢子产生的分子机制对于病害防治具有重要意义。【前人研究进展】在实验室培养条件下,不同的培养条件对分生孢子的产生具有显著的影响。如在辣椒炭疽病菌（Gloeosprium piperatum）中,在PDA培养基上25℃左右菌丝生长旺盛,30℃有利于其分生孢子的产生;光照培养或黑暗培养对菌落直径的影响不大,而光照培养有利于分生孢子的产生[8]。烟草赤星病菌（Alternaria alternata）中,葡萄糖是最好的碳源,有机氮远比无机氮好,Czapek培养基对孢子形成最适宜[9]。笔者实验室前期研究表明,在玉米大斑病菌中,分生孢子萌发的适宜pH为5.0—7.0,蔗糖、葡萄糖、D-果搪、玉米叶汁均能促进分生孢子萌发,光对分生孢子萌发影响并不显著[10],但对影响分生孢子产生的因素未做系统研究。GATA转录因子家族是一类含有锌指结构的基因家族,可特异性识别DNA分子中的GATA motif,从而启动靶基因的转录过程。研究发现,GATA转录因子家族广泛存在于动物、植物及真菌中并影响许多生物过程。如在脊椎动物中发现了6种GATA结合蛋白,分为GATA1/2/3和GATA4/5/6两大类,前者参与红细胞、淋巴组织及性腺的发育,后者控制心脏、肠及外胚等组织器官的分化及发育过程[11];在植物中GATA转录因子广泛参与了光响应调控、叶绿素合成以及碳氮代谢等与作物产量密切相关的生物学过程[12];在植物病原真菌中有关GATA的报道较少,如在水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）研究中发现,GATA转录因子家族基因0349D2的敲除突变体MGG-01426.6中分生孢子产量显著降低,表明该基因与分生孢子产生密切相关[13]。【本研究切入点】近年来,笔者课题组一直致力于利用RNAi（RNA interference）、ATMT（Agrobacterium tumefaciens mediated transformation）农杆菌介导的基因敲除技术分析玉米大斑病菌MAPK（mitogen activated protein kinase）级联途径关键基因的功能[14-16]。在研究过程中以分生孢子作为转化的起始材料,发现分生孢子产生的数量及活力对遗传转化的效率至关重要。但该病菌在人工培养条件下特别是在经过继代培养后出现生长缓慢、分生孢子产量大大降低等现象,这已成为制约研究工作的瓶颈[17]。而在玉米大斑病菌中发现GATA转录因子家族含有5个基因,且其蛋白结构均含有锌指结构,但该家族基因是否与分生孢子形成相关尚不明确。【拟解决的关键问题】明确影响玉米大斑病菌分生孢子产生的关键因素,并探索GATA转录因子家族在病菌分生孢子形成时期的表达特征。为玉米大斑病菌功能基因的研究提供分生孢子材料,并为深入研究调控病菌分生孢子产生的分子机制打下基础。1 材料与方法
试验于2015—2016年在河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室完成。1.1 供试菌株
玉米大斑病菌野生型菌株01-23,由河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室保存。1.2 野生型菌株菌种的培养
将玉米大斑病菌野生型菌株01-23接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）,于25℃恒温培养箱中培养8—10 d备用（均25 mL/皿）。用于分生孢子产生条件探究的试验均设定3个重复。1.3 不同培养条件对分生孢子产量的影响
1.3.1 培养基对分生孢子产生的影响 选用乳糖酪蛋白琼脂培养基（lactose casein agar,LCA）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar,PDA）、玉米茎秆葡萄糖琼脂培养基（corn stalk dextrose agar,CTDA）（玉米茎秆200 g,葡萄糖20 g,琼脂粉15 g,纯净水定容至1 L）、玉米茎秆琼脂培养基（corn stalk agar,CTA）、玉米叶片葡萄糖琼脂培养基（corn leaf dextrose agar,CLDA）（玉米叶片200 g,葡萄糖20 g,琼脂粉15 g,纯净水定容至1 L）、玉米叶片琼脂培养基（corn leaf agar,CLA）、玉米籽粒葡萄糖琼脂培养基（corn niblet dextrose agar,CDA）（玉米籽粒200 g,葡萄糖20 g,琼脂粉15 g,纯净水定容至1 L）、玉米籽粒琼脂培养基（corn niblet agar,CA）、玉米粉葡萄糖琼脂培养基（corn starch dextrose agar,CSDA）（玉米粉200 g,葡萄糖20 g,琼脂粉15 g,纯净水定容至1 L）、玉米粉琼脂培养基（corn starch agar,CSA）、查氏培养基（Czapek）、基本培养基（minimal medium,MM）、水琼脂培养基（water agar,WA）,共13种培养基,25℃恒温黑暗培养15—20 d[18]。1.3.2 碳源对分生孢子产量的影响 以LCA为基础培养基,分别用等量的碳源替换乳糖,碳源依次为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖,共5种碳源,25℃恒温黑暗培养20 d[19-20]。
1.3.3 氮源对分生孢子产量的影响 以LCA为基础培养基,以5 g·L-1的量分别添加不同氮源：牛肉膏、蛋白胨、NH4Cl、KNO3、(NH4)2SO4、NH4NO3,共7种培养基,25℃恒温黑暗培养20 d[21]。
1.3.4 温度对分生孢子产量的影响 以LCA为基础培养基,分别在15、20、25、30、35℃共5个温度梯度下黑暗培养20 d[22]。
1.3.5 光照对分生孢子产量的影响 以LCA为基础培养基,分别使用24 h黑暗,12 h黑暗12 h光照（1 500、3 000、6 000、9 000 lx共4种不同光照强度梯度）,24 h光照（最佳光照强度6 000 lx下）,在这3种不同光照方式处理下25℃恒温培养20 d [19]。
1.3.6 pH对分生孢子产量的影响 以LCA为基础培养基（pH为6）,用HCl和NaOH将LCA培养基pH依次调至4、5、6、7、8、9,25℃恒温黑暗培养20 d[22]。
1.4 分生孢子产量的测定
取出已培养好的病菌平板,在每个培养皿中加入10 mL无菌水,制备分生孢子悬浮液,运用血球计数法测定分生孢子的量并计算每毫升中分生孢子数量,每个试验设定3个重复。1.5 与分生孢子产生相关基因相对表达量
材料的收集：将病菌野生型菌株01-23接种在PDA培养基上,培养7 d后用去尖枪头刮取培养基表面,并收集菌丝;将病菌野生型菌株01-23接种于LCA培养基,25℃ 6 000 lx光照强度下12 h黑暗12 h光照培养20 d,之后在平皿中加入10 mL无菌水,用去尖枪头轻刮培养基表面,将孢悬液经3层纱布过滤,除去菌丝体,收集分生孢子。总RNA的提取及第一链cDNA的合成：利用UNIQ-10柱式Trizol总RNA提取试剂盒提取玉米大斑病菌菌丝及LCA培养基上所产生分生孢子的总RNA,按照张鑫等[23]的方法合成第一链cDNA。
qRT-PCR分析：用Roche Light Cycler 96实时荧光定量PCR仪对菌丝及分生孢子时期cDNA为材料对GATA转录因子家族5个基因进行qRT-PCR分析[24],PCR反应的扩增体系（20 μL）为Template（cDNA）2.0 μL;2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL;引物F（10 µmol·L-1）0.4 μL;引物R（10 µmol·L-1）0.4 μL;ddH2O 7.2 μL。PCR程序：①95℃ 5 min;②95℃ 10 s,58℃ 20 s,72℃ 15 s（45个循环）。引物设计见表1。
Table 1
表1
表1GATA转录因子家族基因表达水平分析所用引物
Table 1Primers used in GATA family of transcription factors relative gene expression analysis in S. turcica
| 引物Primer | 正向引物序列 Sequence of sense primer (5′-3′) | 反向引物序列 Sequence of anti-sense primer (5′-3′) |
|---|---|---|
| GATA1 | AAGTGCCATCCCTGCGT | GGTGAGTGCCGTGAAGTTTG |
| GATA2 | AGTTGCCCAATGCTGAG | TGTCGCTGCTCTGTGTG |
| GATA3 | GCCTGAGTGGCGAAAAG | TGTGCCTTGCTGCTTCT |
| GATA4 | AACGCCTACTCGTCAACC | ACGACAAACGCACAGGA |
| GATA5 | CCAGGCGGACGCAAGAG | CCGTCTGCATCGGGGTG |
| 18S | GCATTTGCCAAGGATGTTTTC | GACGGTATCTGATCGTCTTCGAT |
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2 结果
2.1 不同培养基对病菌分生孢子产生的影响
将病菌菌株01-23分别接种在13种不同培养基上,培养15 d后观察发现在每种培养基上均有分生孢子产生,但其产量不同。其中LCA、PDA、CLDA、CTDA等4种培养基分生孢子产量相对较多,依次为9.22×104、8.56×104、6.00×104、5.56×104个/mL。其余9种培养基CLA、MM、Czapek、CTA、CSDA、CDA、CA、CSA、WA产孢量较少,依次为4.00×104、3.11×104、2.22×104、1.67×104、1.22×104、7.78×103、6.67×103、5.56×103、1.11×103个/mL。进一步培养20 d后观察发现,在PDA、LCA、CTDA、CLDA 4种培养基中分生孢子产量显著增加且均产生黑色分生孢子团,产孢量依次分别为1.32×105、1.41×105、1.59×105、1.63×105个/mL;而其余9种培养基CLA、MM、Czapek、CTA、CSDA、CDA、CA、CSA、WA产孢量无显著增加（图1）。因此,CLDA为玉米大斑病菌分生孢子产生的最佳培养基。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1不同培养基对玉米大斑病菌分生孢子产生的影响
-->Fig. 1Effect of different media on conidium yield in S. turcica
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2.2 碳源、氮源对病菌分生孢子产生的影响
用不同碳源等量替换LCA培养基中的乳糖,分别用不同碳源培养基培养菌株01-23,结果发现以乳糖为碳源的LCA培养基产孢量最多,培养20 d后产孢量为1.42×105个/mL,果糖次之（图2）。在LCA中添加不同氮源培养后发现添加KNO3的培养基中产孢量高达1.88×105个/mL（图3）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2碳源对玉米大斑病菌分生孢子产生的影响
-->Fig. 2Effect of carbon sources on conidium yield in S. turcica
1：乳糖Lactose;2：葡萄糖Dextrose;3：蔗糖Sucrose;4：果糖Fructose;5：麦芽糖Maltose
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3氮源对分生孢子产生的影响
-->Fig. 3Effect of nitrogen sources on conidium yield in S. turcica
1：不添加No add;2：牛肉膏Beef extract;3：蛋白胨Peptone;4：NH4Cl;5：KNO3;6：(NH4)2SO4;7：NH4NO3
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2.3 温度对病菌分生孢子产生的影响
培养温度过低或过高都不利于分生孢子的产生,在15、35℃均不产生分生孢子,仅在20、25、30℃能够产生孢子;其中在20、30℃的产孢量较少,分别为4.00×104、2.22×103个/mL,在25℃时产孢量较多,可达1.41×105个/mL（图4）。因此,25℃为病菌分生孢子产生的最适温度。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4不同温度对分生孢子产生的影响
-->Fig. 4Effect of temperature on conidium yield in S. turcica
1：15℃;2：20℃;3：25℃;4：30℃;5：35℃
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2.4 光照对病菌分生孢子产生的影响
在全部光照培养条件下（6 000 lx）显著抑制分生孢子的产生,分生孢子产量为2.23×104个/mL;在全部黑暗培养条件下分生孢子的产量为1.42×105个/mL;在12 h黑暗、12 h光照培养条件下,1 500、3 000 lx光照条件分生孢子的产量分别为1.48×105、1.51×105个/mL;12 h光暗交替培养,光照强度为6 000 lx条件下病菌分生孢子产量为1.72×105个/mL,与完全黑暗培养条件相比分生孢子的产量显著增加;同样在12 h黑暗、12 h光照培养条件下光照强度为9 000 lx时分生孢子的产量仅为1.20×105个/mL（图5）。结果表明,光照不是分生孢子产生的必要因素,但12 h光照12 h黑暗且光照强度为6 000 lx能显著提高分生孢子产量。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图5光照对分生孢子产生的影响
-->Fig. 5Effect of light treatment on conidium yield in S. turcica
1：24 h黑暗 24 h dark;2—5：12 h黑暗12 h光照（光照强度依次为 1 500、3 000、6 000、9 000 lx） 12 h dark and 12 h light (light intensity were 1 500, 3 000, 6 000, 9 000 lx）;6：24 h光照（最佳光强下6 000 lx）24 h light (under optimum light intensity 6 000 lx)
-->
2.5 pH对病菌分生孢子产生的影响
将玉米大斑病菌接种到6种不同pH下的LCA培养基上,25℃恒温培养20 d后,测定pH为4、5、6、7、8、9的培养条件下分生孢子的产量,分别为1.78× 104、1.31×105、1.41×105、1.53×105、1.69×105、9.22×104个/mL,其中pH为8时产孢量最多,表明弱碱性有益于玉米大斑病菌分生孢子的产生（图6）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图6pH对分生孢子产生的影响
-->Fig. 6Effect of pH on conidium yield in S. turcica
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2.6 GATA转录因子家族基因相对表达量分析
利用qRT-PCR技术比较GATA家族基因在分生孢子形成时期与菌丝时期的表达水平变化。设定菌丝时期基因的表达量为1,分析分生孢子形成时期基因的相对表达水平。结果发现,在分生孢子形成时期GATA2表达水平明显上调,是菌丝形成时期表达量的30.6倍（P<0.05）;其余4个基因相对表达量均显著降低,GATA1、GATA3、GATA4、GATA5的表达水平分别降低了92%、100%、97%、97%（图7）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图7GATA转录因子家族基因相对表达量
-->Fig. 7GATA transcription factor family gene relative expression level analysis in S. turcica
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3 讨论
在对西瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）分生孢子产生条件的研究中发现,西瓜茎叶煎汁培养基是病菌产孢的最佳培养基,可使产孢量达到7.15×109个/mL,是PSA等传统培养基产孢量的104倍左右[18]。本研究选用13种不同培养基诱导玉米大斑病菌分生孢子的产生,发现使用玉米籽粒葡萄糖琼脂培养基（CDA）、玉米籽粒琼脂培养基（CA）及水琼脂培养基（WA）3种培养基产孢量较低,≤8.89×103个/mL,PDA培养基产孢量为1.32×105个/mL,而玉米叶片葡萄糖琼脂培养基（CLDA）最有利于分生孢子的产生,产孢量达到1.63×105个/mL,使用含有玉米叶片的CLDA培养基与使用普通PDA培养基相比产孢量差异显著。在西瓜炭疽病菌及玉米大斑病菌的分生孢子诱导中均发现类似的现象,即使用含有寄主材料的培养基可以显著提高分生孢子的产量,推测寄主中可能含有某种特殊成分,如某些维生素、激素、碳源、氨基酸或无机盐离子等是分生孢子产生所需要的。光对病菌分生孢子的产生具有重要影响,如在苹果轮纹病菌（Physollospora piricola）中发现,完全黑暗条件下不能形成分生孢子器;12 h光照12 h黑暗交替培养只能形成分生孢子器,不能形成分生孢子;完全光照下既能形成孢子器又能产生分生孢子,且仅在完全光照条件下才能够产生分生孢子[25]。对中国被毛孢（Hirsutella sinensis）的研究发现,蓝光照射下分生孢子产量最多,显著高于其他光照条件,而红光对产孢影响不明显[26]。本研究发现,在全光照培养条件下（6 000 lx）显著抑制分生孢子的产生;12 h黑暗12 h光照培养条件与全黑暗培养相比,9 000 lx抑制分生孢子的产生,6 000 lx促进分生孢子的产生,表明在玉米大斑病菌中不同光照强度对分生孢子产生具有不同的影响。由此可见,在不同的植物病原真菌中,光照时间、光照强度、光质对病菌分生孢子的产生均具有不同程度的影响。
在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中,通过4个GATA-因子蛋白在转录及调控氮源利用过程中起重要作用。如NCR（nitrogen catabolite repression）是酿酒酵母对环境中氮源选择性的基础,而GATA转录因子家族成员基因GAT1的表达使NCR处于敏感状态,Gat1p通过参与NCR敏感基因的转录,从而影响病菌对氮源的选择[27-28];粗糙脉孢（Neurospora crassa）中GATA转录因子家族成员WC1/WC2是一种光感测因子,参与染色体重塑和基因的激活,从而影响该病菌的生长发育及生理过程[29];在稻瘟病菌中,GATA转录因子家族成员基因0349D2的突变菌株（MGG-01426.6）分生孢子产量显著降低[13]。本研究发现,在玉米大斑病菌分生孢子形成时期,GATA转录因子家族家族成员GATA2表达量为菌丝时期表达量的30.6倍,说明该基因参与调控病菌的分生孢子形成,这与在稻瘟病菌中的研究结果相一致。另外,通过文献查询结合本试验结果,笔者发现在植物、动物及真菌等不同的物种中,GATA家族成员数目不同,其成员所参与的代谢过程也不尽相同,目前尚不能仅仅根据基因的结构对基因的功能进行系统分类,因此需深入研究并积累更多的试验数据才可以阐明这类基因家族具体功能。从本研究结果来看,在玉米大斑病菌中GATA2与病菌分生孢子产生的关系较为密切,其余该家族基因主要参与病菌的菌丝发育过程,但基因的具体功能还不清晰,因此下一步将创制该家族基因的敲除突变体,通过比较突变体与野生型基因的差异来明确基因的功能。
4 结论
利用单因素分析法确定了影响玉米大斑病菌分生孢子产量的最佳因素为玉米叶片葡萄糖琼脂培养基,乳糖,25℃,pH 8.0,光暗交替各12 h,光照强度为6 000 lx,在培养基中添加KNO3可显著提高分生孢子产量。根据GATA转录因子家族5个基因相对表达分析结果,推测GATA2可能主要参与病菌的分生孢子形成,其余家族成员（GATA1、GATA3、GATA4、GATA5）主要参与病菌的菌丝发育。The authors have declared that no competing interests exist.
