0 引言
【研究意义】Zn作为一种微量元素在动植物的生长过程中至关重要,而过量的Zn又会对动植物和人体健康造成一定的威胁与损害[1]。近年来中国农田土壤锌（Zn）污染正以不同尺度的趋势快速蔓延[2-3],资料显示,中国Zn污染土壤超标率达0.9%。虽然中国最新颁布的食品安全标准中删除了Zn的限量标准值[4],但由Zn污染产生的生态环境风险已引起广泛关注。目前,在环境风险评价中,对污染物评价终点的选取具有较大的偶然性,从而增加了污染物风险评价结果的不确定性[5],因此,不同测试终点的毒理学评价对于Zn污染土壤的环境风险评价具有重要意义。【前人研究进展】近年来,随着中国土壤重金属污染形势的发展,针对重金属污染土壤的生态风险评价成为新的研究热点。相比而言,国外重金属污染土壤的风险评价研究较早。20世纪90年代开始,美国、英国、加拿大、澳大利亚等欧美发达国家在土壤生态风险评价领域开展了系列的研究,制定和颁布了许多行业标准、规范和技术框架[6-7],而国内的研究起步相对较晚,在土壤重金属污染的生态风险评价理论和方法方面总体比较薄弱[8-10]。目前,国内有部分****针对土壤重金属的风险评价进行了研究,并取得一些进展[9, 11-13]。总体而言,目前国内针对重金属污染土壤的生态风险评价主要集中在利用不同指数法对污染土壤进行的污染等级划分、污染来源调查等[14-15],大部分情况下没有能够与土壤利用相结合,特别是在农田土壤的评价中,忽略了土壤和农产品质量之间的联系;而基于不同抑制率的毒理学阈值研究,凸显了土壤-作物系统根际环境的重要性。本文采用的不同类型土壤-大麦系统方法较常用的溶液培养法,其与作物实际生长条件更为接近,对重金属污染土壤进行有效评价和土壤环境质量标准修订更具参考价值。根细胞是重金属进入植物体进行吸收、转运的第一道屏障[16],从植物地上部生物量及植物体重金属吸收测定评价而言,重金属胁迫对植物根系发育的毒性研究对于探明重金属污染土壤的生态系统退化作用、机理和过程及地下生态风险有重要意义[17]。【本研究切入点】本文从污染土壤中Zn对植物根系发育的不同微形态指标出发,利用最新的环境风险评价方法,测定Zn污染胁迫对植物根系发育的不同毒性阈值,量化Zn毒性阈值与土壤性质间的关系,以期为Zn污染土壤的风险评价提供依据。【拟解决的关键问题】通过对不同植物根系发育的微形态指标测试,获得Zn污染对植物根系发育的敏感性测定指标,基于不同性质土壤中大麦Zn毒性的阈值,建立基于Zn对大麦根系毒性阈值的预测模型,为中国Zn污染土壤的风险评价提供科学依据。1 材料与方法
1.1 供试土壤和大麦
根据土壤地带性分布特征,采集了8个不同地区的典型农田表层（0—20 cm）土壤。土壤性质测试[18]结果见表1,土壤样品在室内风干后去除杂物,并过2 mm的尼龙筛备用。供试大麦（Hordeum vulgare L.）购自中国农业科学院,品种为HS41-1。Table 1
表1
表1供试土壤的基本理化性质
Table 1Basic physic-chemical properties of the tested soils
| 采集地点 Soil site | 经纬度 Longitude, Latitude | pH (H2O 1:2.5) | 阳离子交换量 Cation exchange capacity (cmol·kg-1) | 有机碳 Organic carbon (OC) (%) | 黏粒含量 Clay content (<2 µm) (%) | Zn背景含量Background Zn (mg·kg-1) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 海口（砖红壤） Haikou (Latosol) | 19°55′N, 111°29′E | 4.93 | 8.75 | 1.51 | 66.1 | 57.4 |
| 祁阳（红壤） Qiyang (Red Soil) | 26°45′N, 111°52′E | 5.31 | 7.47 | 0.87 | 46.1 | 75.6 |
| 嘉兴（水稻土） Jiaxing (Paddy soil) | 30°77′N, 120°76′E | 6.72 | 19.33 | 1.42 | 41.2 | 90.6 |
| 杭州（水稻土） Hangzhou (Paddy soil) | 30°26′N, 120°25′E | 6.80 | 12.82 | 2.46 | 38.9 | 119.3 |
| 广州（红壤） Guangzhou (Red soil) | 23°10′N, 113°18′E | 7.27 | 8.30 | 1.47 | 25.3 | 33.6 |
| 公主岭（黑土） Gongzhuling (Black soil) | 42°40′N, 124°88′E | 7.82 | 28.80 | 2.17 | 44.6 | 62.8 |
| 石家庄（潮土） Shijiazhuang (Fluvo-aquic soil) | 38°03′N, 114°26′E | 8.19 | 11.71 | 1.01 | 21.4 | 53.8 |
| 廊坊（潮土） Langfang (Fluvo-aquic soil) | 39°31′N, 116°44′E | 8.84 | 6.36 | 0.60 | 10.1 | 33.8 |
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1.2 试验方法
1.2.1 不同浓度外源Zn污染土壤制备 根据剂量-效应预试验结果,以土壤中Zn对植物毒性抑制率达到90%为依据,不同土壤添加不同的Zn浓度。不同pH土壤添加方法如下：Zn以ZnCl2溶液的形式添加,pH<5.0时,添加剂量为0、50、100、200、400、600、800、1 000 mg·kg-1;pH为5.0—7.0时为0、100、200、400、600、800、1 200、1 600 mg·kg-1;pH>7.0时,添加剂量为0、200、400、600、800、200、1 600、2 400 mg·kg-1。根据重金属在不同性质土壤中平衡反应的时间[19],本试验中外源Zn平衡28 d后进行盆栽试验;试验在人工气候箱中进行培养,控制光照条件为12 000 lx,温度为（25±2）℃。试验设置3组重复,每盆装土300 g,栽培时间为21 d。1.2.2 大麦根系指标测定方法 将大麦根部清洗干净并保持其完整性,然后利用STD1600 Epson数字化扫描仪进行图像扫描,利用WinRHIZO软件对扫描图像进行分析,获得大麦根的总表面积、平均直径、根尖数及总根长等数据。
1.3 数据处理
常用的剂量-效应曲线有Log-normal、Weibull、Gamma等,其中Log-logistic函数因其拟合参数均与实际生物效应有关而被广泛采用[20-21],本研究采用Log-logistic剂量-效应函数模型进行阈值的计算：y=$\frac{y_0}{1+e
{(b(x-M))}}$ （1）
式中,y代表评价终点（如根面积、根总长等）相对于对照的百分比（%）;x为log10（Zn的添加浓度）;y0为对照的反应率（%）;M为log10（EC50/EC10）,其中,EC50/EC10为与对照相比各评价终点受到50%与10%抑制时土壤中Zn的含量。
1.4 统计分析
数据采用Excel 2010、SPSS 19.0、Origin 9.0等软件进行分析。2 结果
2.1 基于大麦总根长测试终点的Zn毒性剂量效应曲线
不同污染土壤中,基于Zn污染对大麦根尖数、总根长、根表面积和根平均直径的测定值,利用Log-logistic函数拟合出Zn对不同大麦根微形态的剂量-效应曲线,并在此基础上经过计算获得基于不同测试终点的ECx（x=10,50）值。从测定数据结果看出,不同根微形态测试指标中,根尖数指标最为敏感。在植物根系发育中,相对于总根长、根表面积和根平均直径指标而言,根尖生长时对外部环境的胁迫更为敏感[22]。图1为基于大麦根根尖数的Zn对大麦毒性的剂量-效应关系曲线,大麦根总长、根表面积和根平均直径的剂量-效应曲线没有列出。由图1可看出,Zn对大麦根尖发育的毒性随着土壤中Zn浓度的升高而增加,表现为相对根尖数的降低,而不同性质土壤中,相同浓度Zn对大麦根尖发育产生的毒性效应有显著差异。总体而言,在产生相同毒性的条件下,土壤pH及有机碳含量较低的土壤的剂量-效应拟合曲线越靠左,也即土壤中Zn的阈值越小,这说明土壤中Zn的毒性越高。在有机质含量较高的2种土壤（公主岭黑土与杭州水稻土）中,在Zn低浓度（<200 mg·kg-1）条件下,产生了低剂量刺激效应,最大刺激效应（相对根尖数%）达到112%。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1土壤中Zn对大麦根尖毒性的剂量-效应关系曲线
-->Fig.1Dose-responsive curve of Zn to barley total root tips in different soils
-->
2.2 基于不同测试指标的ECx值及其比较
表2为不同性质土壤中Zn对大麦根尖数毒性的阈值及其95%置信区间。由表2可知,不同性质土壤测定的Zn对大麦根尖数的毒性阈值差异较大。不同性质土壤中,EC10与EC50范围分别为106—386 mg·kg-1,469—953 mg·kg-1,最大和最小分别相差2.64倍和1.03倍,最小EC10的土壤为祁阳的红壤,而最大值为碱性的潮土（河北廊坊）;EC50的情况与EC10的类似。基于大麦根系的根总长、根表面积及平均直径的测定结果没有单独列出,只在图2中列出不同测试终点的结果比较。根据上述8种土壤中Zn的生物毒性剂量-效应曲线拟合结果,得到基于4种不同根微形态指标的毒性阈值EC10和EC50（图2）。图2表明,8种不同土壤中各根微形态指标毒性阈值差异较大,例如根尖数、根总长、根表面积及根平均直径对应的EC10的范围分别为：106—386、186—434、192—499和136—405 mg·kg-1,平均值分别为：228、295、335和261 mg·kg-1,而EC50的范围分别为：519—983、579—1123、598—1 223和540—1 130 mg·kg-1,平均值分别为：702、779、837和739 mg·kg-1。在2种不同抑制率（EC10、EC50）测定结果中,均以根尖数毒性阈值的均值为最小,而以根表面积测定的阈值最大,说明在不同的根系微形态测定指标中,植物根尖发育受污染物胁迫反应最为敏感。
Table 2
表2
表2不同土壤中Zn对大麦根尖数的毒性阈值及其95%置信区间
Table 2Toxicity threshold (EC10 and EC50) of Zn in soils derived from the number of barley root tips and its 95% confidence intervals (mg·kg-1)
| 土壤地点 Soil site | 土壤类型 Soil type | EC10 | 95%置信区间 95% confidence interval | EC50 | 95%置信区间 95% confidence interval |
|---|---|---|---|---|---|
| 廊坊 Langfang | 潮土 Fluvo-aquic soil | 386 | 200-627 | 953 | 817-1102 |
| 石家庄Shijiazhuang | 潮土Fluvo-aquic soil | 311 | 198-453 | 789 | 711-1016 |
| 公主岭Gongzhuling | 黑土Black soil | 275 | 177-401 | 730 | 649-941 |
| 广州Guangzhou | 红壤Red soil | 258 | 159-386 | 691 | 598-864 |
| 杭州Hangzhou | 水稻土Paddy soil | 224 | 131-331 | 672 | 583-811 |
| 嘉兴Jiaxing | 水稻土Paddy soil | 147 | 124-302 | 582 | 506-785 |
| 祁阳Qiyang | 红壤Red soil | 118 | 101-236 | 557 | 471-646 |
| 海口Haikou | 砖红壤Latosol | 106 | 65-201 | 469 | 351-593 |
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2基于不同测试终点测定的土壤中Zn毒性阈值
×：最大值和最小值;I：10%-90%置信区间值;□：25%—75%置信区间值;—：中值;口：平均值
-->Fig. 2Comparison of toxicity thresholds (EC50, EC10) of Zn in soils and its x% (x=10, 90) confidence interval as determined by different test endpoints (mg·kg-1)
×: The maximum and minimum value; I: Values of 10%-90% confidence interval; □: Values of 25%-75% confidence interval; —: Mid-value; 口: Mean value
RT50：根尖数EC50 EC50 to number of root tips;RD50： 根平均直径EC50 EC50 to the average diameter of root;RL50：根总长 EC50 EC50 to total root length;RS50：根表面积EC50 EC50 to root surface area;RT10：根尖数EC10 EC10 to number of root tips;RD10：根平均直径EC10 EC10 to the average diameter of root;RL10：根总长EC10 EC10 to total root length;RS10：根表面积EC10 C10 to rootsurface area
-->
2.3 基于不同根微形态进行Zn毒性阈值测定结果的差异性
2.3.1 敏感性差异 不同测定指标对Zn毒性的敏感性差异对于重金属环境风险评价具有重要意义[21]。本文将不同测定指标对重金属的敏感性定义为：在同一种土壤中,不同测定指标对应的毒性阈值ECx的差异,ECx越小,则敏感性越强,反之,ECx越大,则敏感性就越弱。由图2可知,在EC10、EC50测定的结果中,4种根微形态对土壤Zn毒性的敏感性从强到弱（毒性阈值ECx由小到大）依次为：根尖数>根平均直径>根总长>根表面积。2.3.2 变异性差异 不同测试终点的变异性是污染物环境风险评价的主要影响因子之一。土壤Zn对重金属不同根微形态毒性阈值的平均值及对应的变异性系数如表3所示。不同微形态对应的EC10均值大小顺序为：根尖数<根平均直径<根总长<根表面积,不同测试终点的变异性系数中,EC10的根平均直径测定变异系数最大;EC50测定平均值的顺序与EC10的相同,但变异性系数并没有明显规律,表现为根平均直径的最大,根尖数的最小。通过比较还发现,EC10的变异系数要普遍大于EC50的测定结果。在利用Log-logistic函数拟合出的“S”型剂量-效应曲线获得毒性阈值EC10、EC50过程中,EC10位于较为平缓的曲线上段即斜率较小,生态反应率随物质浓度的增大缓慢降低,而EC50位于陡直的曲线中段,物质浓度稍有增减即可引起生态反应率剧烈的变化,故EC10较EC50通常具有更大的变异性[23]。
Table 3
表3
表3不同根微形态对Zn毒性的敏感性及其毒性阈值的变异系数
Table 3Comparison of different mean toxicity thresholds (EC10, EC50) and the variation coefficient
| 根微形态 Root micromorphology | EC50平均值 Mean value (mg·kg-1) | EC50变异系数 Coefficient of variation (EC50) | EC10平均值 Mean value (mg·kg-1) | EC10变异系数 Coefficient of variation EC10 |
|---|---|---|---|---|
| 根尖数Number of root tiops | 702 | 0.200 | 228 | 0.335 |
| 根平均直径Average diameter of root | 739 | 0.232 | 261 | 0.367 |
| 根总长Total root length | 779 | 0.209 | 295 | 0.285 |
| 根表面积Root surface area | 836 | 0.225 | 335 | 0.276 |
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2.4 基于根尖毒性的土壤中Zn毒性预测模型
污染土壤中重金属毒性阈值与土壤主要性质间的关系及其预测模型,是进行重金属污染土壤管理和风险评价的基础。表4为基于大麦根尖毒性测试终点的EC50值与土壤性质间相关性分析结果,土壤pH、阳离子交换量（CEC）及有机碳（OC）含量与土壤中Zn的毒性阈值ECx呈现出正相关关系。影响土壤中Zn的毒性阈值ECx最重要的因子为土壤pH,其他依次OC、CEC。由表4知,pH与大麦根尖数毒性阈值EC50的偏相关系数高达0.879,OC的相关系数为0.434,此研究结果与前人的研究结论相似 [21]。同样的,大麦的根表面积、平均直径等指标与土壤性质及Zn的毒性阈值间也有类似的相关关系。Table 4
表4
表4基于土壤主控因子与Zn毒性阈值的多元回归方程
Table 4The multiple regression equation of soil properties affecting toxicity thresholds of Zn in soils (partial correlation coefficients and prediction models)
| 回归方程 Regression equation | 决定系数 Correlation coefficient (R2) |
|---|---|
| Log(EC50) = 0.308pH+4.820 | 0.620 |
| Log(EC50) =0.304pH+ 0.108OC+4.685 | 0.696 |
| Log(EC50) = 0.305pH + 0.004CEC +0.114OC+4.683 | 0.723 |
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3 讨论
随着对污染土壤风险管理要求的不断提高,针对重金属污染土壤的环境风险评价中,生态风险评价的内容也在不断的深入。经济合作与发展组织（OECD）对污染土壤的风险评价提出了更高层次的风险评价[24],要求毒性测试中要包含尽量多的测试物种和测试终点、增加敏感的测试终点,而且指标的选择也不能是简单的死亡,因为研究表明,一个物种的不同组织器官对毒物的敏感性存在着较大的差异[20]。有研究表明[20-21],Zn作为植物生长必须的元素之一,在较低浓度时能促进生物生长代谢,而当浓度较高时,又会对植物产生一定毒害作用,例如抑制植物根系对土壤营养元素的吸收,干扰Fe元素的代谢进而导致植物缺Fe性失绿等。污染土壤中重金属的毒性受多种因子控制,包括土壤pH、阳离子交换量（CEC）及土壤中胶体的种类和数量等。目前,针对Zn污染土壤的环境风险研究中,Zn污染带来的生态风险是关注的热点,而在不同的生态测试终点中,根系微形态的毒性测试是植物生长毒性测试的主要指标之一。在重金属污染土壤中,探明植物根系发育的不同测试终点（如根尖数、根长、根面积与根直径等）对重金属的毒性胁迫反应间是否存在敏感性差异以及敏感性顺序对重金属污染土壤的生态风险评价具有重要意义。本研究选择大麦作为模式作物,基于剂量-效应关系模型测定了Zn胁迫条件下大麦根尖数、根长、根面积与根直径的毒性反应,不同测试指标间的敏感性顺序结果表明,在4种不同的根系微形态指标中,植物根系的根尖对Zn毒性最为敏感,其次为根平均直径、总根长和根表面积,此结果为Zn污染土壤毒性测试增加敏感的测试终点提供了重要的参考依据。根系是重金属进入植物的首要屏障,土壤重金属对植物的毒害最先由根部开始。研究发现,在重金属Zn污染土壤中,植物根尖对Zn2+毒性最为敏感,受到伤害也最明显,其次是侧根发育受到抑制[21-22, 24]。本文对8种不同性质土壤中Zn胁迫对大麦根系微形态毒性测试结果与上述报道基本一致。有****通过重金属砷对小麦生长影响的研究发现,随着砷浓度增加,小麦出现次生根数减少,根体积变小,根干重减轻等症状,这可能是由于砷影响了小麦根的正常伸长和下扎的缘故[25];在植物根冠中,根细胞膜对外界环境变化比较敏感,其稳定性是细胞进行正常新陈代谢的基础。重金属的胁迫可以增加细胞膜的通透性,使细胞内电解质等外渗,进而降低细胞的活性甚至导致死亡,最终影响到植物根系的生长[26];有研究表明,重金属能够对细胞的超微结构产生一定损伤,例如有研究者人曾用一定浓度重金属离子溶液处理车前草,发现细胞出现叶绿体类囊体膨胀,外膜断裂,核膜破裂等情况[27]。
污染土壤中,重金属的植物有效性受多种土壤性质的影响,其中包括pH、有机质及阳离子交换量等。本文所选用的8种土壤中,不同土壤性质具有明显差异。其中,海口、祁阳二个地点土壤为酸性土壤,嘉兴、杭州为中性土壤,而广州、公主岭等为碱性土壤。土壤pH与有机质含量是影响重金属生物毒性的两个重要因素。土壤中pH升高,土壤溶液中能够与重金属竞争吸附点位的H+、Fe2+、Al3+、Mg2+等阳离子含量降低,而土壤中水合氧化物、黏土矿物及有机质等的负电荷含量增加,土壤吸附与保持重金属离子的能力随之加强,重金属的生物有效性也就随之下降[28];土壤有机质主要是通过络合作用对重金属的生物有效性产生影响的[27]。因而通常在有机质含量较高的土壤中,重金属的生物有效性就相对较低,即有机质含量与重金属的生物有效性呈负相关关系。所以,在其他条件一致情况下,有机质含量越高的土壤,重金属的毒性阈值也就越高,这与本实验结果一致。在进行不同性质土壤中重金属风险评价中,基于不同性质的重金属毒性阈值预测模型对评估污染土壤中重金属生态风险具有重要意义。本文基于根不同微形态毒性测定结果表明,土壤性质可以影响Zn的植物毒性,其中影响土壤中Zn毒性阈值变化的主要理化因子为土壤pH,而土壤阳离子交换量（CEC）和土壤有机碳含量（OC）影响相对较小。因此,在评价土壤中Zn对植物的毒性时,除Zn浓度外,还需考虑土壤本身性质之间的差异,应根据土壤性质的不同制定相应的评价指标体系。
4 结论
4.1
外源添加Zn进行Zn对大麦根生长毒性测试结果表明,土壤Zn对不同根微形态的毒性阈值存在较大差异,以EC10测定结果为例,根尖数测定结果均值最低,其次为根平均直径和总根长,根表面积的最高,EC50测定结果与之类似。4.2
不同根微形态对Zn毒性的敏感性顺序为根尖数>根平均直径>总根长>根表面积,即根尖数对土壤Zn毒性最敏感。此外,EC10测定结果的变异系数要普遍大于EC50的测定结果。4.2
相关关系分析表明,土壤pH、有机碳（OC）、阳离子交换量（CEC）与Zn的毒性阈值ECx（x=10,50）呈正相关关系,其中土壤pH为最重要的影响因子,偏相关系数均达到极显著水平（P<0.01）,其次为OC、CEC,基于土壤pH、OC、CEC等主要因子可以较好预测土壤中Zn的毒性阈值。The authors have declared that no competing interests exist.
