0 引言
【研究意义】转Bt基因抗虫棉（Bt棉）已在中国大面积生产上广泛应用[1-2],其自身合成的杀虫蛋白能有效地减轻棉铃虫等相关害虫的危害[3],从而减少农药用量。这样既节省了植棉用工和成本,又减轻了农药对环境的污染,具有良好的经济效益和生态效益[4]。因此,保证Bt棉植株杀虫蛋白安全高效表达至关重要。【前人研究进展】迄今为止,国内外一致认为Bt棉的杀虫蛋白表达不稳定[5-7],其中,不良环境条件是重要的影响因素[8-9]。前人已证实土壤水分亏缺（干旱）对Bt棉叶片杀虫蛋白表达量有较大影响[10-11],如2005年和2006年中国河北、山东部分地区都出现抗虫棉抗性减弱,棉铃虫危害加重现象,后经分析这可能与当地6月出现的干旱少雨有关[12]。CARTER等[13]和BENEDICT等[14]发现当6月和7月降水量较少时,造成土壤含水量降低,土壤水分压力会降低植株中总可溶性蛋白和杀虫蛋白的含量。干旱胁迫可导致棉苗组织内可变态（活性态、功能态）DNA和稳定态DNA降解失活,产生大量的DNA残余片段,从而使功能蛋白和结构蛋白合成过程受抑。以上研究结果与Bt棉生产上出现的抗虫性失效具有一定吻合。【本研究切入点】前人研究取样的材料是以叶片为主,而棉铃是棉花的主要产量器官,也是棉铃虫危害主要取食的对象,用叶片抗虫性结果不能完全反映棉铃等生殖器官对棉铃虫的抗性。棉铃虫危害棉铃时,首先取食铃壳,因此,棉铃铃壳中杀虫蛋白含量反映了棉铃的抗虫性。但土壤水分亏缺对Bt棉棉铃尤其是铃壳中杀虫蛋白含量的影响和机理鲜见报道。【拟解决的关键问题】在长江流域地区,经常会发生伏旱不良天气[15],引起不同程度的土壤水分亏缺。本研究通过对土壤水分亏缺造成Bt棉杀虫蛋白含量及Bt基因表达、氮代谢酶活性的影响,进一步明确土壤水分亏缺逆境对Bt棉抗虫的机理,可为逆境下合理防治棉铃虫提供科学依据。1 材料与方法
1.1 试验材料与试验设计
试验于2014—2015年在扬州大学江苏省遗传栽培生理重点实验室进行。以转Bt基因（Cry1Ac）抗虫棉品种泗抗1号（常规种）、泗抗3号（杂交种）为材料,分别以代号SK1和SK3表示。试验为盆栽棉花,所用盆钵直径35 cm,高30 cm,每盆装土20 kg,将取自大田的土壤自然风干、过筛去杂后装盆,用水沉实。供试土壤为砂壤土,含有机质18.8 g·kg-1、水解氮134.7 mg·kg-1、速效磷22.5 mg·kg-1和速效钾81.3 mg·kg-1。供试土壤最大田间持水量为23.5%。采用营养钵育苗移栽,两年均于4月7日播种,5月20日移栽盆中,每天保持盆中土壤含水量接近田间持水量,定期浇水,肥料与其他管理措施按照当地高产栽培要求进行。
2014年于盛铃期,设置5个土壤水分处理：G1、G2、G3、G4和CK,其土壤含水量分别为最大持水量的15%、30%、45%、60%和75%。2015年设置4个处理：G2、G3、G4和CK。每处理4盆,即4次重复。
所有处理于盛花期前10 d控制浇水,如遇下雨,将处理盆钵移入室内。使用WET土壤三参数速测仪监测土壤水分,用称重法控制土壤水分,即当监测发现土壤水分低于设计值时,于早晨、中午、傍晚进行定量补水。
2014年7月20日和2015年7月22日选取长势一致的棉花植株,标记内围1—2果节位当日花,于花后10 d进行水分处理,胁迫4 d后,取样标记的棉铃,液氮速冻后放入-72℃超低温冰箱中保存待测。
1.2 Bt蛋白含量的测定
应用酶联免疫法（ELISA）进行,试剂盒由中国农业大学提供。测定方法参见文献[16]。1.3 实时荧光定量PCR
1.3.1 植物总RNA的提取和纯化 用TIANGEN公司的植物RNA提取试剂盒提取和纯化植物总RNA,具体步骤根据产品提供的程序进行。1.3.2 反转录 用TIANGEN公司的Quant cDNA第一链合成试剂盒,在无RNA酶的0.2 mL PCR薄壁管中加入5 μL RNA样品、2.5 μL Oligo（dT）和9.625 μL RNase-freeddH2O,70℃变性5 min,然后迅速置于冰上冷却5 min,依次加入表1组分,体系为25 μL（可按比例做其他体系）在PCR仪上进行42℃反应60 min。
Table 1
表1
表1反转录体系各组分及其体积
Table 1The compositions of reverse transcription system and their volume
| 组分 Compositions | 体积 Volume (μL) |
|---|---|
| 5×MLV RT reaction buffer | 5 |
| dNTPs | 1.25 |
| RRI (RNase infibitor) | 0.625 |
| MLV reverse transcriptase | 1 |
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1.3.3 实时荧光定量PCR 用TaKaRa公司SYBR Green Ⅰ（Molecular probes）作为实时荧光定量PCR的荧光指示探针,在ABI7500 Real-Time PCR System扩增仪上进行。Bt引物序列为Bt-F：5′-GTTCT GCCCAAGGTATCGAA-3′和Bt-R：5′-GCAACGATA CGTTGTTGTGG-3′。
Table 2
表2
表2水分亏缺处理铃壳中杀虫蛋白方差分析及新复极差显著性测验
Table 2ANOVA and SSR text of the content of insecticidal protein in boll shell
| 水分亏缺 Water deficit | 杀虫蛋白含量 Insecticidal protein content (ng·g-1FW) | 品种 Cultivars | 杀虫蛋白含量 Insecticidal protein content (ng·g-1FW) | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 2014 | 2015 | 2014 | 2015 | |||
| CK | 188.97a | 335.75a | SK1 | 110.47a | 217.63a | |
| G4 | 124.79b | 269.11b | SK3 | 108.31a | 210.12a | |
| G3 | 91.27c | 174.79c | ||||
| G2 | 76.89d | 75.85d | ||||
| G1 | 65.04e | — | ||||
| F值 F-value | 520.77 | 143.41 | F值 F-value | 0.59 | 4.87 | |
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综上所述,土壤含水量为最大持水量的60%可能是Bt棉铃壳中杀虫蛋白含量大幅下降的土壤水分亏缺临界值,且SK1下降幅度小于SK3。
2.2 土壤水分亏缺对铃壳中Bt表达的影响
进一步分析相关基因表达（图2）发现,G4处理胁迫96 h后,SK1和SK3铃壳中Bt表达量均显著提高。与各自对照相比,泗抗1号、泗抗3号Bt表达量分别增加48.6%和22.1%。说明土壤水分亏缺条件下,Bt棉Bt表达量均有不同程度提高,且常规种SK1提高幅度高于杂交种SK3。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1水分亏缺处理对铃壳中杀虫蛋白含量的影响
-->Fig. 1Effects of water deficit on the content of insecticidal protein in boll shell
-->
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2水分亏缺胁迫96 h对铃壳中Bt表达量的影响
-->Fig. 2Effects of 96 h under the treatment of water deficit on expression level of Bt gene in boll shell
-->
方差分析（表3）表明,与对照（CK）相比,土壤水分亏缺处理（G4）可显著提高铃壳中Bt表达量,提高幅度达40.0%。品种间相比,常规种（SK1）Bt表达量较杂交种（SK3）高。
Table 3
表3
表3水分亏缺处理铃壳中Bt表达量方差分析及新复极差显著性测验（2015）
Table 3ANOVA and SSR test of the expression level of Bt gene in boll shell
| 水分亏缺 Water deficit | Bt表达量 Expression level | 品种 Cultivars | Bt表达量 Expression level | |
|---|---|---|---|---|
| CK | 0.89b | SK1 | 1.25a | |
| G4 | 1.21a | SK3 | 0.85b | |
| F值F-value | 46.62 | F值F-value | 72.58 |
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2.3 氮代谢生理特征
2.3.1 NR和GPT活性 在不同水分亏缺处理下,SK1 和SK3铃壳中氮代谢合成相关的NR和GPT活性表现出相似趋势。与各自对照相比,SK1和SK3在土壤水分亏缺（G4）条件下,铃壳中NR和GPT活性均显著下降。其中SK1NR和GPT酶活性分别下降19.1%和17.2%;SK3则分别下降24.8%和15.6%（表4）。方差分析表明（表4）,土壤水分亏缺处理（G4）可显著降低Bt棉铃壳中氮代谢相关合成酶（NR和GPT）活性。而品种间相比,NR活性间差异不显著,但SK3的GPT活性显著高于SK1。
Table 4
表4
表4水分亏缺处理铃壳中硝酸还原酶和GPT酶活性影响及方差分析（2015）
Table 4Effect of water deficit on theactivities of nitrate reductase and GPT in boll shell and ANOVA
| 品种 Cultivars | 处理Treatment | 硝酸还原酶活性 The nitrate reductase activities (μmol·g-1·h-1) | GPT酶活性 The GPT activities (μmol·g-1·h-1) | |
|---|---|---|---|---|
| SK1 | CK | 3.82a | 15.1b | |
| G4 | 3.09b | 12.5c | ||
| G3 | 2.61b | 8.6d | ||
| G2 | 1.33c | 6.2e | ||
| SK3 | CK | 4.04a | 18.0a | |
| G4 | 3.04b | 15.2b | ||
| G3 | 2.88b | 12.6c | ||
| G2 | 1.32c | 8.7d | ||
| 方差分析ANOVA | 水分亏缺 Water deficit | CK | 3.93a | 16.6a |
| G4 | 3.07b | 13.9b | ||
| G3 | 2.75b | 10.6c | ||
| G2 | 1.33c | 7.5d | ||
| F值F-value | 64.5 | 40.3 | ||
| 品种 Cultivars | SK1 | 2.71a | 10.6b | |
| SK3 | 2.82a | 13.6a | ||
| F值F-value | 1.6 | 7.2 | ||
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2.3.2 肽酶和蛋白酶活性 肽酶和蛋白酶变化趋势与Bt蛋白变化趋势正好相反（表5）。在土壤水分亏缺（G4）条件下,SK1和SK3铃壳中肽酶和蛋白酶活性均显著增加。且SK3增加幅度大于常规种SK1,其中SK1肽酶和蛋白酶活性分别比CK增加39.7%和65.2%;SK3则分别增加41.9%和92.9%。
表5进一步表明,土壤水分亏缺处理（G4）可显著降低Bt棉铃壳中氮代谢相关分解酶（肽酶和蛋白酶）活性。而品种间相比,SK3铃壳中2种酶活性均显著高于SK1。说明在土壤含水量为土壤最大持水量的60%条件下,铃壳中蛋白质分解速度加快,且泗抗3号蛋白质分解速率明显高于泗抗1号。
Table 5
表5
表5水分亏缺处理铃壳中肽酶和蛋白酶活性影响及方差分析（2015）
Table 5Effect of water deficit on the activities of peptidase and protease in boll shell and ANOVA
| 品种 Cultivars | 处理 Treatment | 肽酶活性 The peptidase activities (μmol·g-1·h-1) | 蛋白酶活性 The protease activities (μg·g-1·h-1) | |
|---|---|---|---|---|
| SK1 | CK | 1.41e | 33.74f | |
| G4 | 1.97d | 55.74e | ||
| G3 | 2.15c | 70.12d | ||
| G2 | 3.45a | 104.85b | ||
| SK3 | CK | 1.60e | 43.68e | |
| G4 | 2.27c | 84.25c | ||
| G3 | 2.81b | 106.59b | ||
| G2 | 3.48a | 143.12a | ||
| 方差分析ANOVA | 水分亏缺 Water deficit | CK | 1.51c | 38.7d |
| G4 | 2.12b | 70.0c | ||
| G3 | 2.48b | 88.4b | ||
| G2 | 3.47a | 124.0a | ||
| F值F-value | 13.8 | 24.4 | ||
| 品种 Cultivars | SK1 | 2.25b | 66.1b | |
| SK3 | 2.54a | 94.4a | ||
| F值F-value | 19.6 | 42.3 | ||
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2.4 杀虫蛋白含量与氮代谢关系
相关分析（表6）表明,2个品种铃壳中NR活性、GPT活性与杀虫蛋白含量都存在显著或极显著正相关;而肽酶活性、蛋白酶活性则与杀虫蛋白含量呈极显著负相关,进一步说明,在土壤水分亏缺条件下,蛋白质合成减少（NR、GPT活性下降）,分解增加（肽酶、蛋白酶活性提高）,引起杀虫蛋白浓度下降。Table 6
表6
表6Bt水分亏缺下铃壳中杀虫蛋白含量与氮代谢关键酶活性相关系数
Table 6Correlation coefficients between insecticidal protein content and key enzyme activities in boll shell under water deficit stress
| 品种 Cultivars | 硝酸还原酶活性 The nitrate reductase activities | GPT活性 The GPT activities | 肽酶活性 The peptidase activities | 蛋白酶活性 The protease activities |
|---|---|---|---|---|
| SK1 | 0.999** | 0.963** | -0.990** | -0.999** |
| SK3 | 0.915* | 0.981** | -0.984** | -0.971** |
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3 讨论
前人研究表明,土壤水分亏缺对Bt棉杀虫蛋白含量有一定影响。其中王留明等[18]和BLAISE等[19]发现土壤水分亏缺可引起叶片和幼蕾中杀虫蛋白含量降低,但对棉铃影响则未明确指出。但MARTINS等[20]认为土壤含水量为最大持水量的25%—30%条件下,叶片和幼蕾杀虫性未有明显变化。本文通过研究不同程度土壤水分亏缺胁迫96 h条件下,棉铃铃壳中杀虫蛋白含量的变化发现：土壤水分亏缺可导致泗抗1号和泗抗3号铃壳中杀虫蛋白含量下降,且随着土壤水分亏缺程度的增加,下降幅度越大。2个类型品种均在土壤水分含量为最大持水量的60%处理下开始显著低于各自对照。由此推测,土壤水分含量为最大持水量的60%可能是引起棉铃杀虫蛋白含量下降的土壤水分临界值。因此,在Bt棉生产上,特别要注意在棉花花铃期可能出现的土壤水分含量低于土壤最大持水量60%的土壤墒情,这会引起生殖器官抗虫性的大幅度下降,从而引起棉铃虫危害程度的加大,对棉花生产造成损失。此外,常规种泗抗1号在土壤水分亏缺条件下,铃壳中杀虫蛋白含量下降幅度小于杂交种泗抗3号。在正常水分条件（土壤含水量为最大持水量的75%）下,泗抗3号铃壳中杀虫蛋白含量显著高于泗抗1号,但当土壤含水量下降到最大持水量的45%或更低时,泗抗1号则显著高于泗抗3号。上述结果说明,泗抗1号生殖器官中杀虫蛋白含量在土壤水分亏缺条件下稳定性高于泗抗3号,在干旱年份可选用抗旱性强的泗抗1号。逆境对Bt棉抗虫性下降机理,目前还未明确,但有以下几种推断：一种推断认为在逆境下,Bt的启动子甲基化失活,使得Bt表达关闭（Switch off）[21];第二种推断杀虫蛋白在不良环境下可能与棉株体内产生的单宁等物质结合而失活[22];第三种推断认为在逆境下,蛋白质合成下降,从而杀虫蛋白表达量也下降[23]。本研究发现,土壤水分含量为最大持水量60%胁迫96 h并未导致Bt棉供试品种铃壳中转录水平Bt表达量的下降,相反泗抗1号和泗抗3号铃壳中的Bt表达量还显著增加。这与第一种推断正好相反,笔者推测Bt表达关闭这一推断并不适用于土壤水分亏缺逆境。上述结果也表明了基因的转录和翻译是2个相对独立的过程,相关性较低[24-25]。但是蛋白质是生命活动的主要执行者,因此,蛋白质水平比基因表达研究能提供更直接和准确的信息[26]。从本研究结果来看,常规棉品种泗抗1号比杂交棉品种泗抗3号杀虫蛋白下降幅度小,且泗抗1号Bt表达水平的上升幅度大于泗抗3号。说明：第一,从mRNA到蛋白质合成是一个复杂的调控过程,尽管逆境条件下mRNA水平转录水平提高,但有可能翻译效率有所下降,也有可能翻译蛋白质降解加速,使得最终杀虫蛋白含量下降。这一点已由蛋白酶和肽酶活性大幅度增加得到进一步验证;第二,土壤水分亏缺条件下,棉铃中Bt表达量提高是植物本身对逆境的一种自我调控措施。而泗抗1号提高幅度较泗抗3号高,表明其对土壤水分亏缺胁迫适应能力强,最终表现为铃壳中杀虫蛋白含量下降程度低。
从氮代谢角度而言,前人研究发现,湿度胁迫下叶片中杀虫蛋白含量的下降与Bt杀虫蛋白合成能力下降、分解能力增强相关[27]。CHEN等[28-29]通过对不同类型Bt棉品种生育过程中毒蛋白含量变化的研究表明GPT活性、可溶性蛋白含量与Bt杀虫蛋白含量密切正相关,认为氮代谢活性影响Bt杀虫蛋白的表达。本文研究也表明,在土壤水分亏缺条件下,泗抗1号和泗抗3号铃壳中氮代谢相关合成酶（NR和GPT）活性降低,氮代谢相关分解酶（蛋白酶和肽酶）活性增加,且NR和GPT活性与杀虫蛋白含量呈显著或极显著正相关。蛋白酶和肽酶与杀虫蛋白含量呈极显著负相关。说明蛋白质合成减少,分解加快可能是导致土壤水分亏缺条件下Bt抗虫棉棉铃杀虫蛋白含量下降的原因。进一步分析发现,土壤水分亏缺条件下,氮代谢相关分解酶活性增加幅度明显高于相关合成酶减少幅度,这说明蛋白质分解加速可能是导致最终杀虫蛋白含量降低的主导因素,但此方面还应进一步验证。
综上所述,Bt棉在盛铃期受到土壤水分亏缺胁迫后引起铃壳中杀虫蛋白含量下降,抗虫性降低。棉花的盛铃阶段既是产量品质形成关键期,又经常遇到土壤水分含量低于最大持水量60%的情况。因此,在栽培上应通过选择对土壤水分亏缺逆境适应能力强的Bt棉品种,同时通过及时灌溉、施肥、喷施具有抗逆性作用的调节剂[30-31]等方式保持杀虫蛋白的高效稳定表达,提高Bt棉的抗虫性,为转Bt棉的优质高产栽培提供有效保证。
4 结论
水分亏缺胁迫96 h后,供试品种铃壳中杀虫蛋白含量显著下降。但在转录水平未发现Bt表达量降低。而在翻译水平,蛋白质分解酶（肽酶和蛋白酶）活性增加,且与杀虫蛋白含量呈极显著负相关;蛋白质合成酶（NR和GPT）活性减弱,且与杀虫蛋白含量呈显著或极显著正相关。表明水分亏缺条件下,杀虫蛋白含量下降原因并不在于基因表达水平。其主要原因在于蛋白质分解加强,合成减弱。References
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The authors have declared that no competing interests exist.
