0 引言
【研究意义】电阻抗断层成像（electrical impedance tomography,EIT）是根据不同的生物组织或器官在不同的生理、病理条件下阻抗特性有所不同这一原理[1],通过向生物体注入激励电流（电压）,测量表面电压（电流）,应用成像算法计算出生物体内部的电阻抗分布,进而重构出生物体内部阻抗或阻抗变化量的二维或三维分布[2-3]。EIT技术具有无创无辐射、功能性成像、实时监护、设备简单、成本低及操作方便等特点[4-6],引起了医学成像、工业监测研究等方面的广泛关注[7],显示出极大的应用前景。而目前国内外EIT技术在植物方面的研究和应用尚属空白,开展EIT检测植物抗逆性研究,重点攻关,将有利于中国在植物抗逆性研究领域的发展与竞争,其广泛的社会效益和潜在的经济效益显而易见。【前人研究进展】早在20世纪20年代,地质学家通过给地层注入电流,观察不同地层阻抗特性的不同而确定地下矿藏的分布,首次涉及到EIT技术测量原理[5,8]。1978年,Henderson和Webster将EIT技术应用到肺水肿的研究中,做出第一幅阻抗图像[9]。1987年,英国Sheffield大学研究者提出了反投影算法并建立了著名的Mark I系统[10]。1995年,研究者在Mark I的基础上建立了第一个实时的供临床基础研究用的Mark II系统[7]。20世纪90年代以来,EIT技术迅速发展,进入EIT系统研究[11]时期,吸引着世界各国越来越多的科学研究工作者。希腊研究者在1995年做出了一个32电极数据采集系统[8,12],美、日等国也相继有EIT硬件系统用于临床数据采集的报道[7]。近年来,以色列研究人员设计便携式EIT系统,促进远程医疗的实用化[13]。国内在EIT领域的研究虽然起步较晚,但发展迅速,先后进行了一系列软件系统和硬件系统[14-15]、图像重构算法[16-18]研究以及脑部图像监护[19-20]、呼吸过程[21]、胃动力功能检测[22]等临床方面的成像结果。【本研究切入点】目前,EIT技术在国内外医学领域的研究正在向临床阶段过渡,但在植物抗逆领域的研究中未见报道。以EIT技术研究观赏植物抗寒性为切入点,获得测定观赏植物在抗寒锻炼期间在自然条件及冷冻处理下的EIT图像;以EIT图像获取的信息为突破口,发现检测植物抗寒性新技术手段。【拟解决的关键问题】应用EIT技术研究3个丰花月季品种的抗寒性,通过抗寒锻炼期间自然低温以及冷冻处理条件下枝条EIT图像的构建,提取图像重构值,用Logistic方程拟合计算半致死温度并与传统的电导法（electrolyte leakage,EL）相比较,结合电阻抗图谱（electrical impedance spectroscopy,EIS）参数来分析、比较品种间的抗寒性,以期为快速、非破坏性地检测植物抗寒性提供新的可借鉴方法,为选育和推广抗寒性强的丰花月季品种提供参考。1 材料与方法
试验于2015年9月至2016年1月进行,电阻抗断层成像的图像重构及数据采集在第四军医大学生物医学工程学院生物电磁成像研究室进行,电阻抗图谱和电解质渗出率测定在河北农业大学园艺学院观赏植物生理与育种实验室进行。1.1 试验材料
供试材料为河北农业大学标本园（38°50′N,115°26′E）内多年生丰花月季（Rosa hybrida Hort. ‘Floribunda’）品种‘红帽’（Hongmao）、‘柔情似水’（Rouqingsishui）、‘仙境’（Xianjing）,栽培条件一致,常规养护管理。2015年9月至2016年1月间隔40 d分4次取样,取样期间保定地区气温变化见图1。取样方法[23]：每个品种选取生长状况良好的月季8株,每株月季上取3—4个带叶枝,每次取样的位置是树体中部当年生枝条。将枝条用自来水冲洗3次,再用去离子水清洗3次,吸水纸吸干表面水分备用。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1取样期间保定气温变化
-->Fig. 1Changes of Baoding air temperature during sampling period
-->
1.2 温度处理
将枝条密封在聚乙烯袋中进行低温和冷冻处理,袋中喷少许去离子水以免材料过冷[24]。使用变温冰箱（Haier BCD-252WBCS,青岛）进行温度处理。以4℃为对照,设置6个不同的冷冻温度（表1）,降温速率为4℃·h-1,达到指定温度保持4 h,然后将材料放入4℃的冷藏室缓慢解冻24 h后用作电阻抗断层成像、电阻抗图谱及电导率测定。Table 1
表1
表14次冷冻处理温度设定
Table 1Temperatures in four controlled freezing tests
| 日期（年-月-日） Date (Year-Month-Day) | 温度 Temperature (℃) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 2015-9-25 | 4 | -4 | -8 | -12 | -16 | -22 | -30 |
| 2015-11-4 | 4 | -4 | -8 | -12 | -16 | -22 | -30 |
| 2015-12-12 | 4 | -6 | -12 | -18 | -22 | -26 | -35 |
| 2016-1-20 | 4 | -8 | -16 | -20 | -25 | -35 | -45 |
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1.3 电阻抗断层成像的图像重建及数据采集
EIT图像重构采用第四军医大学自主设计的数据采集系统[25]及EITMonitor图像重构软件[15]进行不同温度下枝条的电阻抗断层成像。多路开关（multiplexer,MUX）、模数转换模块（analog to digital converter,ADC）、微程序控制器（micro programmed control unit,MCU）等共同构成了数据采集系统,如图2-a所示[25]。此系统采用准对向驱动模式,应用数字合成方式产生激励源,同时将高速、高精度模数转换器集成到系统中,系统与主控计算机之间应用速度较高、插接方便的USB接口方式[26]。软件系统则主要是完成与硬件系统的接口、仿真成像、实测数据成像、图像处理和结果分析等功能[27]。图像重构过程由软件系统完成,目前较为常用的方法有反投影法、敏感性算法、扰动法、滤波反投影法、加权阻尼最小二乘法等算法,不同算法的成像质量有差异,本试验选用的是加权阻尼最小二乘法[18]这一算法,采用16个电极进行连续成像,成像速度约为1.25帧每秒。选取直径大于4 mm（过小影响成像质量）的粗细均匀一致的月季枝条进行EIT成像：将EIT图像监护系统的工作频率设为1 kHz,激励电流幅度设为250 μA（经反复试验得到的成像结果最佳的激励电流强度与频率）,以浓度为0.9%的生理盐水（阻抗不随频率变化）[18]为背景,放入内径为160 mm的有机玻璃容器中,容器壁上距容器底端25 mm的水平面等间距安置16个电极,电极直径10 mm（图2-b）,生理盐水没过电极平面10 mm,将长为70—90 mm的茎段竖直插入距容器边缘20 mm处,待液面完全平静后,采集10帧左右的数据进行成像。采用相对灰阶的方式显示EIT成像结果：在所得到的图像结果中,重构值小于0表示相应区域的电阻率降低,在伪彩色图像中以红色一侧的颜色来表示,图像中纯红色部分与重构的最小值相对应;重构值大于0则表示相应区域电阻率增加,以蓝色一侧的颜色来表示,纯蓝色部分与重构结果中的最大值相对应,此时重构结果的中值与图像中的纯绿色对应。同一位置重构结果的绝对值越大则算法认为该区域电阻率变化的程度越大[28]。
1.4 电阻抗图谱
每个处理中随机选取8段15 mm长的茎段样本用作电阻抗图谱测定。用测厚仪（Mitutoyo No.7331,Japan）测定直径,精确到0.01 mm。EIS测定用阻抗仪（Agilent E4980A,USA）,试验采用Ag/AgCl电极（RC1,WPI Ltd.,Sarasota,USA）,电极间距45 mm,在电极上加凝胶（PARKER：SIGNA GEL ELECTRODE GEL,USA）,使样本两横切面与凝胶接触（图2-c）。测定样本在42个频率（80 Hz—1 MHz）下的电阻值和容抗值,作出不同频率下电阻和容抗的变化曲线,即EIS。月季茎段的EIS为单弧,采用分布模型中的单-DCE（distributed circuit element）模型[29]。拟合的参数为电阻R（Ω）和R1（Ω）、弛豫时间τ、弛豫时间分布系数ψ;需计算的为胞外电阻率re（Ωm）、胞内电阻率ri（Ωm）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2数据采集系统结构框图
a：数据采集系统;b：有机玻璃容器;c：EIS测定系统
-->Fig. 2Block diagram of data acquisition system
a: Data acquisition system; b: Plexiglass container; c: EIS measurement system
-->
1.5 相对电导率
将每个处理温度下的茎段切取10 mm劈成两份放入试管,加12 mL去离子水,用保鲜膜将试管口封好,试验设4次重复。试管放入摇床中振荡24 h。用BANTE-950型电导仪（般特,上海）测定初始电导值C1和空白对照C空白1,并记录;C1测定完毕后,再用保鲜膜封口,将试管置于沸水中水浴20 min,自然冷却后再放入摇床中振荡24 h,测最终电导值C2和C空白2。通过公式（1）计算相对电导率（relative electrolyte leakage,REL）[30]。$REL=\frac{C_1-C{空白1}}{C_2-C{空白2}\times 100%} \ \ (1)$
1.6 统计分析
通过LEVM8.06软件[31]拟合得出EIS参数值,用Microsoft Excel 2003计算出REL,并将REL、EIS各参数及EIT重构值随温度变化用Microsoft Excel 2003作图,参照Logistic方程（2）,用SPSS22.0软件计算半致死温度,表征月季茎段的抗寒性,给出与Logistic方程的决定系数R2和线性相关系数r。统计EIS各参数（胞外电阻率re、胞内电阻率ri、弛豫时间τ、弛豫时间分布系数ψ）的变化,做相关分析,EIS各参数及方程（2）各参数的解释参见文献[32]。$y=\frac{A}{1+e^{B(C-x)}}+ D \ \ (2)$
2 结果
2.1 抗寒性变化
随着抗寒锻炼的进行,电导法求出的3个品种丰花月季的抗寒性均有不同程度的增强。取样期间,‘仙境’的半致死温度一直低于其他两个品种,表现出较高的抗寒性,在北方最为寒冷的1月份达-24.31℃。3个品种丰花月季抗寒性顺序为‘仙境’>‘柔情似水’>‘红帽’（表2）。Table 2
表2
表2电导法求出的3个丰花月季品种茎的半致死温度变化
Table 2Changes of semilethal temperature of three varieties of floribunda rose stems calculated by EL method
| 品种 Varieties | 日期（年-月-日） Date (Year-Month- Day) | 抗寒性 Frost hardiness (℃) | 95%置信区间 95% Confidence interval | 决定系数R2 Coefficient of determination | 线性相关系数r Correlation coefficient of linear equation | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 下限 Lower bound | 上限 Upper bound | |||||
| 红帽 Hongmao | 2015-9-25 | -10.432 | -11.802 | -9.061 | 0.975 | -0.837 |
| 2015-11-4 | -12.786 | -14.909 | -10.663 | 0.993 | -0.871 | |
| 2015-12-12 | -16.997 | -17.552 | -16.442 | 0.997 | -0.878 | |
| 2016-1-20 | -21.159 | -22.631 | -19.687 | 0.943 | -0.909 | |
| 柔情似水 Rouqingsishui | 2015-9-25 | -9.121 | -9.626 | -8.616 | 0.991 | -0.846 |
| 2015-11-4 | -12.567 | -14.267 | -10.867 | 0.992 | -0.869 | |
| 2015-12-12 | -14.627 | -15.654 | -13.599 | 0.998 | -0.857 | |
| 2016-1-20 | -23.791 | -25.619 | -21.962 | 0.957 | -0.921 | |
| 仙境 Xianjing | 2015-9-25 | -12.149 | -12.402 | -11.896 | 0.990 | -0.885 |
| 2015-11-4 | -13.300 | -13.925 | -12.675 | 0.996 | -0.854 | |
| 2015-12-12 | -17.281 | -18.665 | -15.898 | 0.991 | -0.875 | |
| 2016-1-20 | -24.313 | -27.785 | -20.840 | 0.927 | -0.933 | |
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2.2 EIT结果
每次取样每个品种的各个温度截取一帧的EIT图像（图3—6）,由图可知,茎段的EIT成像结果均可准确呈现放入枝条的位置与大小,放入枝条处呈现蓝色,此处重构值大于0,表明该区域电阻率是增大的,每幅图中纯蓝色与重构结果中的最大值相对应。由EIT重构值变化（图7）可知,3个品种丰花月季的EIT重构值随着温度的降低呈减小趋势,并且‘仙境’重构值在4次取样中基本都小于其他两个品种。以EIT重构值与Logistic方程可以很好地（R2>0.90）拟合出半致死温度（表3）,但在抗寒锻炼初期,‘仙境’9月的半致死温度较‘红帽’和‘柔情似水’低,‘红帽’11月的半致死温度较其他两个月季品种高。而抗寒锻炼后期的12月与1月,3个品种月季的半致死温度相差不大,但末期抗寒性顺序为‘红帽’>‘仙境’>‘柔情似水’。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图39月25日低温处理下3个丰花月季品种茎的EIT成像结果
-->Fig. 3EIT imaging of stems of three floribunda rose varieties after low temperature test on September 25
-->
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图411月4日低温处理下3个丰花月季品种茎的EIT成像结果
-->Fig. 4EIT imaging of stems of three floribunda rose varieties after low temperature test on November 4
-->
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图512月12日低温处理下3个丰花月季品种茎的EIT成像结果
-->Fig. 5EIT imaging of stems of three floribunda rose varieties under low temperature test on December 12
-->
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图61月20日低温处理下3个丰花月季品种茎的EIT成像结果
-->Fig. 6EIT imaging of stems of three floribunda rose varieties after low temperature test on January 20
-->
由表2、3可知,抗寒锻炼期间,由3个丰花月季品种茎的EIT重构值计算所得的半致死温度高于电导法所得,在抗寒锻炼初期,两者相差0.222—2.907℃,气温较低的12月,两种方法相差也不是很大（2.415—2.881℃）,在抗寒性最强的1月份,‘柔情似水’和‘仙境’通过EIT重构值计算所得的抗寒性明显低于EL所得,分别相差7.635℃和7.945℃,此时,抗寒性顺序与EL法所测有所不同。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图7低温处理后3个丰花月季品种茎的EIT重构值的变化
-->Fig. 7Changes of EIT reconstructed values in stems of three floribunda rose varieties after low temperature test
A：9月25日 September 25;B：11月4日 November 4;C：12月12日 December 12;D：1月20日 January 20
-->
Table 3
表3
表3EIT重构值测得3个丰花月季品种茎的半致死温度
Table 3Semilethal temperature of three varieties of floribunda rose stems measured by EIT reconstructed value
| 品种名称 Varieties | 日期（年-月-日） Date (Year-Month- Day) | 抗寒性 Frost hardiness (℃) | 95%置信区间 95% Confidence interval | 决定系数R2 Coefficient of determination | 线性相关系数r Correlation coefficient of linear equation | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 下限 Lower bound | 上限 Upper bound | |||||
| 红帽 Hongmao | 2015-9-25 | -8.510 | -12.321 | -4.699 | 0.990 | 0.954 |
| 2015-11-4 | -9.879 | -14.020 | -5.739 | 0.972 | 0.908 | |
| 2015-12-12 | -14.116 | -20.974 | -7.257 | 0.971 | 0.952 | |
| 2016-1-20 | -17.294 | -22.106 | -12.482 | 0.984 | 0.966 | |
| 柔情似水 Rouqingsishui | 2015-9-25 | -8.750 | -27.589 | 10.088 | 0.954 | 0.966 |
| 2015-11-4 | -12.333 | -17.461 | -7.204 | 0.985 | 0.977 | |
| 2015-12-12 | -12.212 | -17.974 | -6.450 | 0.975 | 0.956 | |
| 2016-1-20 | -16.155 | -27.353 | -4.957 | 0.992 | 0.991 | |
| 仙境 Xianjing | 2015-9-25 | -11.674 | -18.201 | -5.147 | 0.977 | 0.974 |
| 2015-11-4 | -13.078 | -24.645 | -1.511 | 0.959 | 0.972 | |
| 2015-12-12 | -14.507 | -24.865 | -4.150 | 0.918 | 0.937 | |
| 2016-1-20 | -16.368 | -20.016 | -12.719 | 0.993 | 0.949 | |
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2.3 EIS参数变化
由图8可知,抗寒锻炼期间,3个丰花月季品种在自然低温下茎的胞外电阻率re呈先上升后下降而后又上升的趋势;胞内电阻率ri变化趋势不一致,‘柔情似水’是一直上升的趋势,‘红帽’呈先上升后下降的趋势,‘仙境’的ri在12月12日显著（P<0.05）低于‘红帽’;τ呈现整体下降的趋势,在12月12日达到最低值,较9月25日下降了9.26—13.00 μs,总体上,‘红帽’高于其他两个品种;弛豫时间分布系数ψ 变化趋势不明显。2.4 冷冻温度处理下不同方法测定抗寒性的相关性
EIT重构值法和EIS参数法（re和τ）所得丰花月季茎的抗寒性与传统的电导法测定的抗寒性极显著相关（P<0.01）（表4）,表明EIT图像技术可以应用于植物抗寒性研究。2.5 未经冷冻处理EIS参数与EIT重构值的相关性
在抗寒锻炼期间,不经冷冻处理月季茎的EIS参数与EIT重构值有一定的相关性,其中,‘红帽’和‘仙境’的胞外电阻率re与EIT重构值有正相关关系（r>0.72）,‘柔情似水’和‘仙境’的弛豫时间τ同样和EIT重构值有正相关关系（r>0.63）（表5）。由回归方程可知,3个丰花月季品种的re和τ 的决定系数分别达0.59和0.88以上,表现出较高的可信度。可以将这两个参数作为EIT重构值的参考。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图8抗寒锻炼期间3个丰花月季品种茎的EIS参数变化
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）
-->Fig. 8Changes of EIS parameters in stems of three floribunda rose varieties during cold acclimation
Different small letters indicate significant difference (P<0.05)
-->
Table 4
表4
表4EIT重构值、EIS参数与EL法测定丰花月季茎的抗寒性的相关性
Table 4Correlation of the frost hardiness in stems of floribunda rose measured by EIT reconstructed values and EIS parameters with EL method
| EIT重构值 EIT reconstructed value | EIS参数 EIS parameters | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| re | ri | τ | ψ | ||
| 相关系数r Correlation coefficient | 0.921** | 0.891** | 0.219 | 0.833** | — |
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Table 5
表5
表5抗寒锻炼期间3个丰花月季品种茎的EIS参数与EIT重构值的相关性
Table 5Correlation of EIS parameters and EIT reconstructed values in stems of three floribunda rose varieties during cold acclimation
| 品种 Varieties | EIS参数 EIS parameters | 回归方程 Regression equation | 决定系数R2 Coefficient of determination | 线性相关系数r Correlation coefficient of linear equation |
|---|---|---|---|---|
| 红帽 Hongmao | re | y=0.0002x2-0.022x+0.648 | 0.928 | 0.727 |
| ri | y=-0.0057x2+0.0763x-0.1925 | 0.162 | — | |
| τ | y=-0.0014x2+0.041x-0.2219 | 0.993 | -0.377 | |
| ψ | y=-11.222x2+13.288x-3.86 | 0.489 | -0.464 | |
| 柔情似水 Rouqingsishui | re | y=-0.0003x2+0.0299x-0.7053 | 0.999 | -0.115 |
| ri | y=-0.0002x2-0.0016x+0.0899 | 0.308 | -0.554 | |
| τ | y=-0.0006x2+0.0185x-0.054 | 0.887 | 0.796 | |
| ψ | y=13.615x2-15.443x+4.433 | 0.993 | 0.988* | |
| 仙境 Xianjing | re | y=0.0002x2-0.0153x+0.4059 | 0.593 | 0.724 |
| ri | y=-0.0054x2+0.0724x-0.2016 | 0.865 | 0.819 | |
| τ | y=-0.0004x2+0.0105x-0.0254 | 0.999 | 0.636 | |
| ψ | y=-3.0634x2+3.5817x-1.0033 | 0.983 | 0.478 |
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3 讨论
本研究表明,冷冻温度处理下,用EIT重构值信息可以估测丰花月季茎的抗寒性。经低温处理后,茎段处于不同的状态,这对电流的传导有重要影响,通过逐步降低温度的方式确定EIT图像与重构值的变化,必然与细胞膜伤害有关。研究者认为[33]细胞对低频（f<1 kHz）有高的阻抗,低频电流只在胞外间隙流动,阻抗主要由胞外电阻组成,而本研究应用的是1 kHz的激励电流频率,很可能是胞外电阻组成阻抗。低温冰冻伤害来临时,细胞膜作为细胞与外界环境的物质交换和信息传递的重要界面[34],通透性改变,导致共质体离子渗出到质外体增多,于是有共质体和质外体离子浓度和细胞膜变化的介电特性之间新的稳态平衡,随着温度的降低,茎遭受冻害程度增加,则质外体电阻随之减小,于是会导致其电阻率明显低于对照组（4℃）,进而在EIT成像结果表现为放枝处重构结果的绝对值变小,且部分图像噪声污染严重,但并不影响EIT重构值的提取。EIT成像速度约为每秒1.25帧,测定时,在插入枝条后盐溶液稳定时截取一帧清晰的EIT图像,从图像中提取EIT重构值,通过重构值与温度变化曲线的Logistic方程拟合而得到植物的抗寒性,所用的测定时间为2 d（即冷冻处理后的第2天得到抗寒性结果）,大大短于传统电导法的4—5 d。所得半致死温度虽然高于传统电导法,但二者所得到的抗寒性有极显著的线性正相关关系（r=0.92）。本试验表明EIT技术可以敏感地探测到由低温引起的茎段电阻率变化,是一种和生物体的生理功能密切相关的检测方法,电阻抗断层成像技术可以作为一种较为快速地、有效地评估月季抗寒性的方法。电阻抗图谱反应的是组织的复阻抗频谱特性[35],是一种快速、非破坏性的获得关于植物茎的状况的方法。近年来,以等效电路模型拟合得到的EIS参数在植物非生物胁迫生理反应研究方面得到了广泛应用[36-39]。抗寒锻炼期间,3个品种丰花月季茎段的胞外电阻率re和弛豫时间τ 两个EIS参数变化表现出十分相似的结果,11月底低温突然来临,月季的茎不能及时稳定细胞膜结构以适应突然来临的低温环境,没有充分的养分积累,影响EIS参数的变化。这与之前研究发现的在分离的样本（根、针叶和茎）中,质外体电阻和弛豫时间（特征频率的倒数）随着冻害的增加而减小[40]的规律十分一致。EIT重构值与re和τ 的变化趋势较为一致,且与re和τ存在正相关关系（表5）,随着自然低温的发生,细胞膜膜透性的改变,膜内离子向胞外迁移等不可逆或部分不可逆变化,从而改变细胞的电学特性,导致EIT重构值、胞外电阻率和弛豫时间的变小。低温持续一段时间后,植物发生生长上和生理上的一些适应性变化来抵御低温,参数值有所回升,通过EIT重构值、re和τ 可以及时、准确、客观地反映细胞、组织的状态。
4 结论
经过人工冷冻处理以后,丰花月季枝条受到冻害,电阻抗断层成像技术（EIT）的图像重构值显著降低,可以通过重构值用Logistic方程拟合计算,得到抗寒性,但是所得抗寒性较传统电导法（EL）法低。自然低温下,3个丰花月季品种茎的胞外电阻率re和弛豫时间τ 2个电阻抗图谱参数分别呈现一致的变化规律,并且与EIT重构值有一定的相关性。样本经冷冻处理后,可以用茎的EIT图像重构值评价丰花月季的抗寒性。该方法可为快速、非破坏性地检测植物抗寒性提供新的参考。The authors have declared that no competing interests exist.
