0 引言
【研究意义】稻米品质的优劣对其商品价值具有重要影响。蒸煮品质是影响稻米口感的关键,成为是否满足优质稻米消费需求和影响国内外稻米市场的重要因素。其中,直链淀粉含量（amylose content,AC）、糊化温度（gelatinization temperature,GT）和胶稠度（gel consistency,GC）是稻米蒸煮品质的主要指标。近年来,利用黏度速测仪RVA进行淀粉糊化特性评价,已在中国育种实践中得到较好应用[1-2]。进一步解析RVA谱特征值与稻米蒸煮品质的相关性,对于全面评价水稻品质特性具有实践价值。此外,寻找与稻米蒸煮品质性状相关的优异等位基因及典型载体材料,探讨不同分子标记的组合对于品质性状的表型效应,对提高分子标记辅助选择（maker assisted selection,MAS）在品质育种中的应用效率具有重要意义。实现对个体基因型鉴定,高效预测表型值,有利提高稻米品质性状选择效率。【前人研究进展】稻米品质性状被认为是典型的质量-数量遗传性状,受多基因控制。显然,多位点的标记关联和效应分析是实现精确分子标记选择的前提。ZHAO等[3]通过标记与性状的关联分析,验证了粒形、垩白、淀粉合成相关QTL/基因的分子标记的可行性;KHARABINA-MASOULEH等[4]通过关联分析获得了31个与稻米蒸煮品质相关的淀粉合成基因SNP位点;邱先进等[5]利用全基因组关联分析解析籼稻垩白的遗传基础和挖掘影响垩白粒率和垩白度的优异等位基因。整体而言,虽然许多稻米品质相关QTL和功能基因,包括影响粒形、垩白性状的QTL[6-8]和淀粉合成相关基因[9-11]得到鉴定,但涉及等位基因组合以及优异等位变异的解析仍是有限。【本研究切入点】稻米品质性状的QTL定位和基因鉴定研究已有较多报道,水稻淀粉合成相关基因与稻米品质的关联分析[12-15]也获得重要进展,但对等位基因组合、优异等位变异及典型载体材料挖掘的研究尚不多。大量已报道的相关分子标记的可用性、变异效应以及贡献力并未明确。【拟解决的关键问题】本研究利用淀粉合成相关基因及稻米籽粒相关位点连锁的分子标记对代表性种质进行分型检测,并对多个稻米品质性状进行基于线性模型的等位基因贡献性检测,挖掘与稻米品质性状显著相关的标记和重要等位基因组合,为水稻品质改良奠定基础。1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为华南农业大学国家植物航天育种工程技术研究中心种质资源库所收集的国内外种质材料48份,其中,籼稻38份、粳稻9份和爪哇稻1份（表1）。Table 1
表1
表1本研究用到的水稻种质材料
Table 1Rice germplasm materials used in this study
| 序号ID | 名称Name | 来源Source | 亚群 Sub-population | 序号ID | 名称Name | 来源 Source | 亚群 Sub-population | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 玉针香 Yuzhenxiang | 中国湖南 Hunan, China | 籼型 Indica | 25 | 航恢1173 Hanghui 1173 | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | |
| 2 | 02428 | 中国江苏 Jiangsu, China | 粳型 Japonica | 26 | 秋B Qiu B | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | |
| 3 | 华航31号 Huahang 31 | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | 27 | 华占 Huazhan | 中国广西 Guangxi, China | 籼型 Indica | |
| 4 | 五山丝苗 Wushansimiao | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | 28 | 成恢727 Chenghui 727 | 中国浙江 Zhejiang, China | 籼型 Indica | |
| 5 | 沈农9816 Shennong 9816 | 中国辽宁 Liaoning, China | 粳型 Japonica | 29 | 9311 | 中国四川 Sichuan, China | 籼型 Indica | |
| 6 | 巴斯马蒂 370 Basmati 370 | 巴基斯坦 Pakistan | 籼型 Indica | 30 | 云南红谷 Yunnanhonggu | 中国江苏 Jiangsu, China | 籼型 Indica | |
| 7 | Kasalath | 日本 Japan | 籼型 Indica | 31 | 大粒种 Dalizhong | 中国云南 Yunnan, China | 籼型 Indica | |
| 8 | 华宽占 Huakuanzhan | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | 32 | 早粳占 Zaojingzhan | 中国云南 Yunnan, China | 籼型 Indica | |
| 9 | 象牙香占 Xiangyaxiangzhan | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | 33 | 沈农016 Shennong 016 | 中国辽宁 Liaoning, China | 粳型 Japonica | |
| 10 | Francis | 美国 United States | 爪哇型 Javanica | 34 | 武运粳23 Wuyunjing 23 | 中国江苏 Jiangsu, China | 粳型 Japonica | |
| 11 | 云粳22 Yunjing 22 | 中国云南 Yunnan, China | 粳型 Japonica | 35 | 南粳46 Nanjing 46 | 中国江苏 Jiangsu, China | 粳型 Japonica | |
| 12 | 泰丰B TaifengB | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | 36 | 甬优8号 Yongyou 8 | 中国浙江 Zhejiang, China | 粳型 Japonica | |
| 13 | 荆香糯 Jingxiangnuo | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | 37 | W030 | 中国江苏 Jiangsu, China | 粳型 Japonica | |
| 14 | 万里糯 Wanlinuo | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | 38 | 乡意浓1号 Xiangyinong 1 | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | |
| 15 | 洪晚籼924 Hongwanxian 924 | 中国江西 Jiangxi, China | 籼型 Indica | 39 | 禅城占 Chanchengzhan | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | |
| 16 | 桂育9号 Guiyu 9 | 中国广西 Guangxi, China | 籼型 Indica | 40 | 粤标5号 Yuebiao 5 | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | |
| 17 | 龙粳21 Longjing 21 | 中国黑龙江 Heilongjiang, China | 粳型 Japonica | 41 | 广源占15号 Guangyuanzhan 15 | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | |
| 18 | 美香占2号 Meixiangzhan 2 | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | 42 | 恒丰B Hengfeng B | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | |
| 19 | 湘晚籼13号 Xiangwanxian 13 | 中国湖南 Hunan, China | 籼型 Indica | 43 | 开平小优粒 Kaipingxiaoyouli | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | |
| 20 | 柳丰003 Liufeng 003 | 中国广西 Guangxi, China | 籼型 Indica | 44 | 软占 Ruanzhan | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | |
| 21 | 泸恢8558 Luhui 8258 | 中国四川 Sichuan, China | 籼型 Indica | 45 | 鹏稻2号 Pengdao 2 | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | |
| 22 | 九七香 Jiuqixiang | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | 46 | 黄广软占 Huangguangruanzhan | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | |
| 23 | 胜巴丝苗 Shengbashimiao | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | 47 | 桂禾丰 Guihefeng | 中国广西 Guangxi, China | 籼型 Indica | |
| 24 | 桂农占 Guinongzhan | 中国广东 Guangdong, China | 籼型 Indica | 48 | 桑兰稻 Sanglandao | 中国海南 Hainan,China | 籼型 Indica |
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1.2 稻米品质性状鉴定
供试材料于2015年晚季种植于国家植物航天育种工程技术研究中心试验基地（广州）。田间管理（水、肥、病虫害防治等）按当地大田常规栽培要求实施。按农业部部颁标准NY147-88[16]测定直链淀粉含量（AC）、胶稠度（GC）和碱消值（ASV）。淀粉RVA谱测定采用波通瑞华科学仪器（北京）有限公司生产的RVA（Rapid Visco Analyzer, Model 3D）快速测定淀粉粘滞特性,并用TCW（Thermal Cycle for Windows）配套软件分析。测定按AACC规程（1995 61-02）要求,即含水量为14.0%时,样品量3.00 g,蒸馏水25.00 mL。测定过程中罐内温度变化为50℃保持1 min,以12℃/min上升到95℃（3.75 min）,95℃保持2.5 min,以12℃/min下降到50℃（3.75 min）,50℃保持1.4 min。搅拌器在起始10 s内转动速度为960 r/min,以后保持在160 r/min。RVA谱特征用最高黏度（peak viscosity,PKV）、热浆黏度（hot paste viscosity,HPV）和冷胶黏度（cool paste viscosity,CPV）描述。在TCW程序中选用水稻的分析方法（ rice method）,其中,程序参数设置为： Temp At Visc Rate（2,7,1,36）,成糊温度（pasting temperature,PTm）按包劲松[17]的方法手工计算获得。黏度单位用“Rapid Visco Units（RVU）”或厘泊（centipoise,cp）表示。1.3 分子标记检测
采用CTAB法提取水稻材料叶片基因组DNA。试验筛选所涉及的分子标记包含一部分报道的淀粉合成相关基因的等位分子标记;以及稻米籽粒有关性状连锁的标记,涉及SNP、SSR和STS等标记类型。经初步筛选获得用于关联分析的多态性标记共154个（见电子附表）。所有引物均由金唯智生物技术有限公司合成。不同引物的PCR反应体系及扩增程序参照ZHAO等[3]方法。利用自动荧光毛细管电泳（Fragment Analyzer™）检测PCR扩增产物,并用PROSize 2.0软件对电泳结果进行分析,确定产物DNA片段长度,记录基因型信息。1.4 数据处理
利用Excel和SAS 9.3进行性状的统计分析。对于多元线性回归分析,将各位点的等位变异转化为虚拟变量,具体参照LEE等[18]的方法。利用Power Marker 3.25软件计算每个位点的等位基因数（number of alleles per locus）、基因多样性（gene diversity）和多态信息含量（polymorphism information content,PIC）。以Structure 2.3.1软件进行群体遗传结构的分析,估计最佳群体组群数K,其取值范围为1—10,将MCMC（markov chain monte carlo）开始时的不作数迭代（length of burn-in period）设为10 000次,再将不作数迭代后的MCMC设为10 000次,迭代次数（number of iterations）设置为5,计算Q参数。采用Tassel 3.0软件一般线性模型（general linear model,GLM）,以Q作为协变量,利用表型变异数据对标记逐一进行回归分析,并计算标记对表型变异的解释率。参考BRESEGHELLO[19]和文自翔等[20]方法计算标记位点等位变异的表型效应。2 结果
2.1 稻米品质相关性状的变异分析和RVA谱分析
通过稻米品质性状的调查,48份种质材料中检测到广泛的遗传变异。其中,AC为5.9%—27.5%、GC为24.5—142.5 mm、ASV为1.0—7.0;AC、GC和ASV的变异系数为26.5%—36.3%（表2）。说明所选材料表现出较高的表型多样性。Table 2
表2
表248份水稻材料的稻米品质性状值
Table 2Grain-quality traits of the 48 rice materials
| 品种 Varieties | 直链淀粉含量 Amylose content (%) | 胶稠度 Gel consistency (mm) | 碱消值 ASV | 品种 Varieties | 直链淀粉含量Amylose content (%) | 胶稠度 Gel consistency (mm) | 碱消值 ASV | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 玉针香 Yuzhenxiang | 14.9±0.2 | 85.0±0.0 | 6.1±0.1 | 早粳占 Zaojingzhan | 15.8±0.3 | 83.8±0.0 | 6.8±0.2 | |
| 02428 | 13.3±0.3 | 94.5±0.1 | 1.9±0.1 | 航恢1173 Hanghui 1173 | 15.3±0.6 | 89.0±0.0 | 6.3±0.1 | |
| 华航31号 Huahang 31 | 18.8±0.3 | 106.5±0.0 | 6.7±0.2 | 秋B Qiu B | 24.4±0.3 | 24.5±0.0 | 4.5±0.0 | |
| 五山丝苗 Wushansimiao | 13.9±1.0 | 49.5±0.1 | 7.0±0.0 | 华占 Huazhan | 14.9±0.3 | 98.7±0.0 | 1.0±0.0 | |
| 沈农9816 Shennong 9816 | 16.5±0.5 | 95.5±0.0 | 5.3±0.1 | 成恢727 Chenghui 727 | 17.1±0.3 | 116.0±0.0 | 1.0±0.0 | |
| 巴斯马蒂 370 Basmati 370 | 15.7±0.4 | 98.5±0.1 | 6.4±0.1 | 9311 | 27.5±0.4 | 50.0±0.0 | 7.0±0.0 | |
| Kasalath | 27.2±0.5 | 55.5±0.0 | 4.0±0.0 | 云南红谷 Yunnanhonggu | 14.3±0.3 | 127.0±0.2 | 1.2±0.0 | |
| 华宽占 Huakuanzhan | 19.1±0.3 | 103.5±0.0 | 6.7±0.0 | 大粒种 Dalizhong | 20.9±0.3 | 111.5±0.0 | 2.9±0.1 | |
| 象牙香占 Xiangyaxiangzhan | 17.4±0.7 | 104±0.1 | 7.0±0.0 | 沈农016 Shennong 016 | 15.4±0.2 | 127.5±0.1 | 5.6±0.1 | |
| Francis | 16.1±0.1 | 95.5±0.0 | 1.1±0.1 | 武运粳23 Wuyunjing 23 | 16.8±0.1 | 99.0±0.1 | 6.0±0.0 | |
| 云粳22 Yunjing 22 | 14.3±0.4 | 95.0±0.2 | 6.0±0.0 | 南粳46 Nanjing 46 | 10.7±0.0 | 142.5±0.1 | 4.7±0.0 | |
| 泰丰B TaifengB | 27.0±0.0 | 66.0±0.0 | 7.0±0.0 | 甬优8号 Yongyou 8 | 17.2±0.4 | 114.5±0.0 | 5.8±0.0 | |
| 荆香糯 Jingxiangnuo | 6.3±0.3 | 123.5±0.1 | 5.5±0.1 | W030 | 13.4±0.1 | 111.0±0.0 | 6.5±0.2 | |
| 万里糯 Wanlinuo | 5.9±0.2 | 120.0±0.2 | 6.2±0.0 | 乡意浓1号 Xiangyinong 1 | 17.0±0.1 | 81.5±0.0 | 5.9±0.1 | |
| 洪晚籼924 Hongwanxian 924 | 18.7±0.1 | 58.0±0.0 | 7.0±0.0 | 禅城占 Chanchengzhan | 24.2±0.0 | 54.5±0.4 | 6.5±0.2 | |
| 桂育9号 Guiyu 9 | 19.2±0.7 | 68.5±0.0 | 7.0±0.0 | 粤标5号 Yuebiao 5 | 18.7±0.3 | 142.0±0.1 | 6.0±0.0 | |
| 龙粳21 Longjing 21 | 15.8±0.1 | 92.0±0.0 | 6.2±0.2 | 广源占15号 Guangyuanzhan 15 | 14.7±0.3 | 114.0±0.4 | 6.7±0.0 | |
| 美香占2号 Meixiangzhan 2 | 16.8±0.3 | 104.5±0.1 | 7.0±0.0 | 恒丰B Hengfeng B | 14.8±0.3 | 110.5±0.1 | 1.0±0.0 | |
| 湘晚籼13号 Xiangwanxian 13 | 15.5±0.6 | 91.0±0.0 | 6.2±0.0 | 开平小优粒 Kaipingxiaoyouli | 15.2±0.4 | 112.5±0.4 | 7.0±0.0 | |
| 柳丰003 Liufeng 003 | 17.7±0.6 | 77.0±0.0 | 6.3±0.2 | 软占 Ruanzhan | 13.7±0.3 | 107.5±0.4 | 7.0±0.0 | |
| 泸恢8258 Luhui 8258 | 15.9±0.4 | 95.0±0.0 | 6.0±0.3 | 鹏稻2号 Pengdao 2 | 14.3±0.2 | 107.5±0.4 | 6.7±0.0 | |
| 九七香 Jiuqixiang | 14.6±0.4 | 97.0±0.0 | 1.0±0.0 | 黄广软占 Huangguangruanzhan | 15.9±0.0 | 103.5±0.1 | 6.7±0.2 | |
| 胜巴丝苗 Shengbashimiao | 15.8±0.1 | 79.3±0.0 | 6.5±0.0 | 桂禾丰 Guihefeng | 17.6±0.4 | 116.5±0.1 | 7.0±0.0 | |
| 桂农占 Guinongzhan | 26.8±0.1 | 51.5±0.0 | 7.0±0.0 | 桑兰稻 Sanglandao | 16.9±0.2 | 101.5±0.1 | 7.0±0.0 | |
| 变异系数 Coefficient of variation (%) | 26.5 | 26.5 | 36.3 |
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基于黏度速测仪测定的RVA谱主要反映水稻淀粉谱粘滞特性。根据与淀粉特性密切相关的蒸煮品质性状,即AC、GC和ASV,选取18份具有代表性的品种（表3）进行RVA谱特征值分析。结果表明,不同品种RVA谱及其特征值存在明显的差异。其中,消减值（setback,SBV）的变异系数最大,其次是回复值（consistence,CSV）和崩解值（breakdown,BDV）,其余RVA谱特征值的变异系数均较小。不同水稻品种间RVA谱特征值在PKV、HPV、CPV、PTm和峰值时间（peak time,PaT）上的差异不大,但BDV、SBV和CSV等指标表现明显差异,具有品种特异性。2份糯稻品种的峰值时间最短,为3.6和3.7 min;并且具有最小的SBV和CSV,明显区分于其他非糯种质。
Table 3
表3
表318个品种RVA谱特征值
Table 3RVA profile characteristics of 18 rice varieties
| 品种 Varieties | 特征值 RVU | 成糊温度 Pasting temperature (℃) | 峰值时间Peak time (min) | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 最高黏度 Peak viscosity (PKV) | 热浆黏度 Hot paste viscosity (HPV) | 冷胶黏度 Cool paste viscosity (CPV) | 崩解值 Breakdown (BDV) | 消减值 Setback (SBV) | 回复值 Consistence (CSV) | |||
| 玉针香 Yuzhenxiang | 402.8 | 165.3 | 305.0 | 237.5 | -97.8 | 139.7 | 68.2 | 5.5 |
| 02428 | 371.2 | 175.4 | 304.2 | 195.8 | -67.0 | 128.8 | 75.3 | 5.7 |
| 华航31号 Huahang 31 | 391.1 | 177.2 | 337.4 | 213.9 | -53.7 | 160.3 | 68.2 | 5.6 |
| 五山丝苗 Wushansimiao | 380.4 | 170.4 | 340.8 | 210.0 | -39.7 | 170.3 | 68.2 | 5.6 |
| 沈农9816 Shennong 9816 | 331.0 | 170.0 | 289.0 | 161.0 | -42.0 | 119.0 | 65.9 | 5.9 |
| 巴斯马蒂 370 Basmati 370 | 368.8 | 162.5 | 291.5 | 206.3 | -77.3 | 129.0 | 65.9 | 5.7 |
| Kasalath | 233.1 | 116.2 | 312.3 | 116.9 | 79.3 | 196.2 | 72.1 | 5.5 |
| 华宽占 Huakuanzhan | 367.4 | 152.1 | 293.4 | 215.3 | -74.0 | 141.3 | 66.7 | 5.6 |
| 象牙香占 Xiangyaxiangzhan | 396.8 | 188.9 | 340.9 | 207.8 | -55.8 | 152.0 | 66.7 | 5.5 |
| Francis | 367.9 | 160.6 | 323.1 | 207.3 | -44.8 | 162.5 | 76.2 | 5.5 |
| 云粳22 Yunjing 22 | 324.7 | 197.9 | 323.8 | 126.8 | -0.9 | 125.8 | 68.2 | 6.1 |
| 泰丰B TaifengB | 324.3 | 268.9 | 447.3 | 55.4 | 122.9 | 178.3 | 66.6 | 5.7 |
| 荆香糯 Jingxiangnuo | 312.5 | 143.0 | 177.2 | 169.5 | -135.3 | 34.2 | 65.0 | 3.7 |
| 万里糯 Wanlinuo | 306.5 | 146.3 | 178.0 | 160.2 | -128.5 | 31.7 | 65.9 | 3.6 |
| 洪晚籼924 Hongwanxian 924 | 340.9 | 180.9 | 359.5 | 160.0 | 18.6 | 178.6 | 68.9 | 5.9 |
| 桂育9号 Guiyu 9 | 371.8 | 171.5 | 333.8 | 200.3 | -38.0 | 162.3 | 66.6 | 5.5 |
| 龙粳21 Longjing 21 | 337.7 | 159.9 | 276.9 | 177.8 | -60.8 | 117.0 | 67.4 | 5.9 |
| 美香占2号 Meixiangzhan 2 | 338.1 | 183.6 | 338.8 | 154.5 | 0.8 | 155.3 | 66.6 | 5.5 |
| 变异系数 Coefficient of variation (%) | 11.75 | 17.89 | 19.66 | 25.16 | -168.52 | 32.00 | 4.63 | 12.52 |
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稻米品质性状与RVA谱特征值相关性分析（表4）发现,AC分别与CPV、SBV和CSV呈显著或极显著正相关,与PKV和BDV呈负相关。其中,AC与SBV相关系数达0.794。高直链淀粉的2份材料,Kasalath（AC 27.2%）和泰丰B（AC 27.0%）的SBV均为正值,远高于其他非糯材料。从表3和表4可以看出,不同品种因本身AC和GC的不同,RVA谱显著不同。糯稻品种（万里糯、荆香糯）RVA谱特征值表现为BDV较大,CPV小,SBV为负值且绝对值较大,达到PKV时间短;高直链淀粉含量和胶稠度较小的品种（Kasalath、泰丰B）RVA谱特征值表现为BDV较小,SBV较大。由此可 见,稻米品质中的AC和GC是影响RVA谱特征值的2个重要理化指标。此外,GC分别与SBV和CSV呈显著负相关;ASV与PTm呈极显著负相关。RVA特征值中,SBV与CSV同时与AC和GC显著相关,是反映稻米品质最为重要的2个指标。而利用经验公式换算的PTm与ASV相关系数达0.910,表明该方法测定的PTm可精确地反映稻米淀粉糊化温度。
Table 4
表4
表4稻米品质性状与RVA谱特征值的相关性
Table 4Correlation between rice quality characteristics and RVA profile characteristics
| 蒸煮品质 Cooking quality | 最高黏度 Peakviscosity | 热浆黏度 Hot paste viscosity | 冷胶黏度 Cool paste viscosity | 崩解值 Breakdown | 消减值 Setback | 回复值 Consistence | 成糊温度 Pasting temperature | 峰值时间 Peak time |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 直链淀粉含量Amylose content | -0.622* | 0.168 | 0.538* | -0.651** | 0.794** | 0.689** | -0.079 | -0.187 |
| 胶稠度Gel consistency | 0.392 | -0.020 | -0.408 | 0.354 | -0.547* | -0.665** | -0.088 | 0.003 |
| 碱消值ASV | 0.164 | 0.328 | 0.294 | -0.074 | 0.085 | 0.065 | -0.910** | 0.104 |
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2.2 标记-等位基因关联性检测
154个多态性标记中共检测到491个等位变异,平均每个位点3.19个,不同位点等位基因数变幅范围为2—8。各位点的基因多样性平均为0.447,变幅为0.041—0.829。对于多态性信息含量（PIC）,标记间差异较大,幅度为0.040—0.806,平均值为0.390,其中,27对引物为低度多态位点,82对引物为中度多态位点,45对引物为高度多态位点。采用EVONNO等[21]介绍的方法进行群体结构分析表明,△K值于亚群数为2时有明显的峰。因而该群体的适宜亚群数确定为2。第一个亚群包括02428、沈农9816、沈农016、云粳22、龙粳21、武运粳23、南粳46、W030、甬优8号和大粒种等粳稻亚群;其他材料分布在第二个亚群,为籼稻亚群。利用Tassel 3.0 软件中的GLM模型,以各材料对应的Q值作为协变量进行关联分析,结果显示,在0.01水平下,对于不同性状共检测到22个关联标记位点,其中同时与AC和GC关联的位点有5个。单个关联标记位点的贡献率（R2）范围是14.11%—75.62%。
标记-性状关联结果表明,与AC关联的位点有15个,表型变异解释率范围为14.34%—61.44%,其中在3个淀粉合酶基因（GBSSI、BeIIb和SSI）中有9个位点,贡献率最高的是Wx-G/T;与GC关联的位点有8个,表型变异解释率范围为14.11%—41.87%,在3个淀粉合酶基因（GBSSI、SSI和SSIIIb）中有5个位点,贡献率最高的是Wx-G/T;与ASV关联的位点有4个,表型变异解释率范围为19.01%—75.62%,其中,SSIIa的2个位点（alk-GC/TT和SSIIa-F）的贡献率是所有关联位点中最高的,分别为75.62%和74.46%（表5）。4个GBSSI的位点、4个BEIIb的位点以及1个SSI的位点都与AC显著关联,GBSSI和SSI上都有2个位点与GC显著关联,2个SSIIa的位点都与ASV显著关联,表明GBSSI、BEIIb和SSI对AC和GC具有一定的决定作用,SSIIa对ASV具有一定的决定作用。其中,标记Wx-G/T、GBSSI-4-IF、SSI-2-F、INV1和RM15206同时与AC和GC关联。
Table 5
表5
表5稻米品质性状显著关联的标记位点
Table 5Marker loci significantly associated with grain-quality traits
| 性状 Traits | 位点 Loci | 染色体 Chromosomes | P值 P-value | 贡献率 R2 (%) | 性状 Traits | 位点 Loci | 染色体 Chromosomes | P值 P-value | 贡献率 R2 (%) | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 直链淀粉含量 Amylose content | Wx-G/T | 6 | 3.90E-11 | 61.44 | 胶稠度 Gel consistency | Wx-G/T | 6 | 2.80E-07 | 41.87 | |
| GBSSI-4-IF | 6 | 4.13E-07 | 47.92 | GBSSI-4-IF | 6 | 2.96E-05 | 35.35 | |||
| BeIIb-1-F | 2 | 1.67E-05 | 33.49 | INV1 | 4 | 3.33E-04 | 28.57 | |||
| BeIIb-3-F | 2 | 1.67E-05 | 33.49 | SSI-1-F | 6 | 7.08E-03 | 22.74 | |||
| MS40671 | 5 | 4.39E-04 | 33.34 | SSI-2-F | 6 | 9.51E-04 | 20.38 | |||
| RM16 | 3 | 2.70E-04 | 30.65 | RMG2762.HAU2762 | 2 | 8.28E-03 | 18.34 | |||
| BeIIb-2-F | 2 | 2.76E-04 | 30.58 | RM15206 | 3 | 2.20E-03 | 17.79 | |||
| RM481 | 7 | 3.87E-03 | 29.69 | SSIIIb-IF | 4 | 7.03E-03 | 14.11 | |||
| GBSSI-F | 6 | 1.41E-04 | 27.32 | 碱消值 ASV | alk-GC/TT | 6 | 9.66E-16 | 75.62 | ||
| GBSSI-3-IF | 6 | 1.13E-03 | 26.11 | SSIIa-F | 6 | 2.92E-15 | 74.46 | |||
| BEIIb-IF | 2 | 2.94E-04 | 25.09 | |||||||
| INV1 | 4 | 8.88E-03 | 19.00 | RI0399 | 5 | 3.81E-03 | 22.12 | |||
| SSI-2-F | 6 | 3.34E-03 | 17.29 | |||||||
| RM15206 | 3 | 3.49E-03 | 17.15 | RM10316 | 1 | 9.13E-03 | 19.01 | |||
| RM15937 | 8 | 8.09E-03 | 14.34 |
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2.3 关键稻米品质性状等位基因及组合的效应分析
与AC、GC和ASV显著关联且贡献率位于前4位的位点上等位基因效应差值及对应等位基因的载体材料如表6所示。与AC显著关联的位点中,Wx-G/T具有最大的表型效应差异,Wx-G/T-G与Wx-G/T-T的表型效应差值达到了10.6%。AC减效最大的等位变异是Wx-G/T-T,典型载体材料是W030和云粳22。Table 6
表6
表6重要品质性状关联位点及表型效应
Table 6Marker loci significantly associated with important grain quality traits and their phenotypic variation
| 性状 Trait | 显著性关联位点Significant associated locus | 等位基因型 Allele | 表型效应 Ai | 典型载体材料 Typical carrier materials | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 功能基因/QTL Gene/QTL | 位点 Locus | 等位效应差值 Phenotypic difference between alleles | ||||
| 直链淀粉含量Amylose content | GBSSI (Wx) | Wx-G/T (0.61) | 10.6% | T | -1.3% | W030、云粳22 W030, Yunjing 22 |
| G | +9.3% | Kasalath、泰丰B Kasalath, Taifeng B | ||||
| GBSSI-4-IF (0.48) | 10.1% | C | -1.0% | 九七香、早粳占 Jiuqixiang, Zaojingzhan | ||
| T | +9.1% | 桂农占 Guinongzhan | ||||
| BEIIb | BeIIb-1-F (0.33) | 2.3% | 131 bp | -0.6% | 五山丝苗、巴斯马蹄370 Wushansimiao, Basmati 370 | |
| 121 bp | +1.7% | Kasalath、9311 | ||||
| BeIIb-3-F (0.33) | 2.2% | 451 bp | -0.6% | 华航31号、南粳46 Huahang 31, Nanjing 46 | ||
| 391 bp | +1.7% | 泰丰B、9311 Taifeng B, 9311 | ||||
| 胶稠度Gel consistency | GBSSI (Wx) | Wx-G/T (0.42) | 50.9 mm | T | +6.4 mm | 华宽占、沈农016 Huakuanzhan, Shennong 016 |
| G | -44.5 mm | Kasalath、桂农占 Kasalath, Guinongzhan | ||||
| GBSSI-4-IF (0.35) | 50.7 mm | C | +5.1 mm | 开平小优粒 Kaipingxiaoyouli | ||
| T | -45.6 mm | 泰丰B Taifeng B | ||||
| GIF1 | INV1 (0.29) | 58.6 mm | 111bp | +3.8 mm | 成恢727 Chenghui 727 | |
| 124bp | -54.9 mm | Kasalath | ||||
| SSI | SSI-1-F (0.23) | 72.7 mm | 198 bp | +2.4 mm | 沈农016、南粳46 Shengnong 016, Nanjing 46 | |
| 220 bp | -70.4 mm | Kasalath、秋B Kasalath, Qiu B | ||||
| 碱消值 ASV | SSIIa (alk) | alk-GC/TT (0.76) | 4.1 | TT | +0.9 | 桂禾丰、软占 Guihefeng, Ruanzhan |
| GC | -3.2 | 02428、Francis | ||||
| SSIIa-F (0.75) | 4.4 | 114 bp | +0.7 | 洪晚籼924、美香占2号 Hongwanxian 924, Meixiangzhan 2 | ||
| 106 bp | -3.7 | 九七香、华占 Jiuqixiang, Huazhan | ||||
| qPGWC-5 | RI0399 (0.22) | 1.7 | 355 bp | +0.3 | 华航31号、洪晚籼924 Huahang 31, Hongwanxian 924 | |
| 386 bp | -1.4 | 华占、云南红谷 Huazhan, Yunnanhonggu | ||||
| Gn1a | RM10316 (0.19) | 2.9 | 147 bp | -2.4 | 恒丰B、云南红谷 Hengfeng B, Yunnanhonggu | |
| 145 bp | 0.4 | 泰丰B、美香占2号 Taifeng B, Meixiangzhan 2 | ||||
| 142 bp | -0.8 | 成恢727 Chenghui 727 | ||||
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SSI-1-F对GC具有最大的表型效应差异（72.7 mm）,其次是贡献率最大的Wx-G/T（+50.9 mm）。增效最大的等位变异是Wx-G/T-T（+6.4 mm）,典型载体材料是华宽占和沈农016,其次是GBSSI-4-IF-C（+5.1 mm）,典型载体材料是开平小优粒。
与ASV显著关联的位点等位基因间表型效应差异最大的是SSIIa-F（4.4）,其次是贡献率最大的alk-GC/TT（4.1）,其中,alk-GC/TT-TT具有最大的增效表型效应（+0.9）,典型载体材料是桂禾丰和软占。
其中,典型载体材料W030、开平小优粒和软占等的AC、GC和ASV值达国标优质（表2）,GBSSI的Wx-G/T、GBSSI-4-IF和SSIIa的alk-GC/TT位点的基因型分别为T/T、C/C、TT/TT,均为优异等位变异。因此,W030、开平小优粒和软占等携带了控制AC、GC及ASV的多个优异等位基因,可作为优质品种选育的骨干亲本。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1等位基因组合箱形图
-->Fig. 1Box plots of the allelic combinations
-->
利用逐步回归的方法对各性状显著性关联位点进行分析的结果表明,AC、GC和ASV逐步回归模型中分别包含5、2和2个关联标记（表7、图1）。不同的等位基因组合形成了广泛的表型差异。Wx-G/T、GBSSI-F、RM16、GBSSI-3-IF和RM15206 5个位点的组合对AC的决定系数为85.30%,其中,Wx-G/T和GBSSI-F为前人验证过的控制AC的主效基因GBSSI的位点,具有最高的决定系数（68.60%和12.08%）其他3个为本研究获得的新位点。不同的等位基因组合具有不同的AC值,其中,G/I/II/A/I、G/I/ II/A/II和G/I/II/C/I等位基因组合具有较高的AC,T/II/I/A/II等位基因组合为糯稻品种,AC值极低;Wx-G/T和RMG2762.HAU2762可以用来预测GC,决定系数为40.62%,表明所选标记对GC进行预测尚有一定的困难;alk-GC/TT和SSIIa-F 2个位点的组合可以用来预测ASV,决定系数为80.38%,alk-GC/TT具有主要的决定作用（76.71%）,GC/I和GC/II等位基因组合具有较低的ASV,TT/II等位基因组合具有较高的ASV。
Table 7
表7
表7逐步回归模型中标记的等位基因组合
Table 7Allelic combinations based on the stepwise regression models
| 性状 Traits | 等位基因组合Allelic combinations | 基因型个体数 No. of genotypes | 最小值Minimum | 最大值 Maximum | 平均 Mean | 标准差 Standard Deviation | 回归方程模型 Regression equation models | 决定系数 R2 (%) | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 直链淀粉含量 Amylose content (%) | T/II/I/A/II | 2 | 5.9 | 6.3 | 6.1 | 0.3 | y=17.71-9.74x1+9.19x2+ 1.35x3-3.48x4+1.40x5 | x1 | 68.60 |
| T/I/II/A/I | 5 | 13.7 | 18.8 | 15.2 | 2.1 | ||||
| T/I/I/A/II | 9 | 10.7 | 17.2 | 14.8 | 2.1 | x2 | 12.08 | ||
| T/I/II/A/II | 25 | 14.3 | 19.2 | 16.4 | 1.5 | x3 | 1.07 | ||
| T/I/I/C/II | 1 | 20.9 | 20.9 | 20.9 | x4 | 2.37 | |||
| G/I/II/A/I | 3 | 24.2 | 27.5 | 25.3 | 1.9 | x5 | 1.18 | ||
| G/I/II/A/II | 1 | 26.8 | 26.8 | 26.8 | |||||
| G/I/II/C/I | 2 | 27.0 | 27.2 | 27.1 | 0.2 | 总Total | 85.30 | ||
| 胶稠度Gel consistency (mm) | G/I | 6 | 24.5 | 66.0 | 50.3 | 13.8 | y=64.81+43.49x1-9.31x2 | x1 | 37.94 |
| T/I | 32 | 49.5 | 142.0 | 99.0 | 19.7 | x2 | 2.68 | ||
| T/II | 10 | 92.0 | 142.5 | 108.3 | 16.6 | 总Total | 40.62 | ||
| 碱消值 ASV | GC/I | 8 | 1.0 | 4.5 | 1.8 | 1.5 | y=1.84+2.82x1+1.77x2 | x1 | 76.71 |
| GC/II | 3 | 1.9 | 6.0 | 3.6 | 2.1 | x2 | 3.67 | ||
| TT/II | 37 | 4.7 | 7.0 | 6.4 | 0.6 | 总Total | 80.38 | ||
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3 讨论
本试验代表性品种的稻米淀粉RVA谱检测结果表明,不同品种的RVA谱及其特征值存在明显的差异,消减值的变异系数最大,其次是回复值和崩解值,这与何秀英等[22]的结果类似,但变异系数均更大,主要是由于所选材料在AC和GC上差异显著。相关性分析发现,RVA特征值与AC和GC存在显著或极显著的相关性,稻米品质中的AC和GC是影响RVA谱特征值的2个重要理化指标,这与前人研究结果相似[23],但其相关系数略小于贾良等[24]的研究结果,这可能是由于所用材料数较少。本研究所用154个多态性标记,共检测到491个等位变异,平均每个标记位点具有3.19个等位变异,变幅为2—8,平均每对引物的多态信息含量（PIC）为0.390,变幅为0.040—0.806,遗传多样性平均为0.447,略低于前人研究结果[25],这是因为本研究所用的标记部分为SNP标记,为双等位形式,每个位点所携带的多态信息较少。
通过对48份不同水稻品种与稻米品质相关分子标记的关联性分析,发现对于20个与淀粉合成酶相关的基因,稻米AC主要由GBSSI控制,GC也可能主要由GBSSI或与其紧密连锁的基因位点控制[26]。本研究中Wx-G/T对AC和GC的贡献率最大,分别为61.44%和41.87%,同时GBSSI的其他4个位点对AC和GC的贡献率均较大（>25%）,说明GBSSI是控制直链淀粉含量和胶稠度的主效基因,这与TIAN等[27]的研究结果相符。GBSSI-4-IF与GC显著关联,这与第10个外显子的C/T SNP对决定高直链淀粉米饭的软硬具有重要作用是一致的[28]。多数研究表明,SSIIa（尤其是第8外显子的GC/TT SNP位点）对糊化温度具有重要影响[29-30]。本研究中SSIIa的2个位点与ASV均显著相关。除了SSIIa外,未检测到其他淀粉合成相关基因的位点与碱消值相关,这可能与多数参试材料的ASV较大有关。
以往研究表明,影响GC的主效基因是Wx基因（GBSSI）,但本研究中,在Wx基因型一样的情况下,出现GC表型差异较大的现象,如南粳46和五山丝苗、广源占15号和洪晚籼924等的Wx基因型均为T/T,但GC值差异很大。究其原因,可能有以下几点：（1）基因存在本研究未涉及的其他变异位点;存在某些控制GC的微效基因与Wx基因互作,但微效基因与Wx基因互作关系研究仍未明确;（2）GC受基因型与环境互作影响较大,遗传力较低[31-32]。影响糊化温度的主效基因是alk（SSIIa）[33],本研究中,云粳22的alk基因型为GC/GC,但其碱消值较大（糊化温度低）,这与前人研究结论未吻合[33]。NAKAMURA等[34]研究表明,不同SNP位点的相互作用会影响SSIIa酶的活性,在4 198 bp处出现G/A SNP的A位点时,不论SSIIa基因型为GC/GC或TT/TT,均表现出低糊化温度,这可能是导致云粳22表现出低糊化温度的原因。
单个标记用于区分群体的不同种质具有一定的局限性,对显著关联标记构建的回归模型可以用来预测表型,LESTARI等[35]建立了多个用来估计稻米食味品质的回归模型。本试验通过对与AC、GC和ASV显著关联的位点进行逐步回归分析发现,Wx-G/T、GBSSI-F、RM16、GBSSI-3-IF和RM15206 5个位点的组合可以用来预测AC;Wx-G/T和RMG2762.HAU2762可以用来预测GC,但决定系数较低;alk-GC/TT和SSIIa-F 2个位点的组合可以用来预测ASV。其中,Wx-G/T在AC和GC回归方程模型中均具有较大的决定系数,alk-GC/TT在ASV回归方程模型中的决定系数高达76.71%,表明对于AC和GC,Wx-G/T是主效位点,对于ASV,alk-GC/TT是主效位点,这与前人研究结果一致[26,29]。可知,所构建的回归方程模型对分子标记辅助选择育种具有一定的指导意义,尤其是决定系数较大的AC和ASV的回归模型。
挖掘稻米品质性状的优异等位基因及对应的典型载体材料,可为水稻分子设计育种的应用奠定基础。本研究通过对与AC、GC、ASV显著相关且贡献率位于前4位的位点的等位变异分析发现,同一位点等位变异间表型效应有差异。对于AC,Wx-G/T位点对其贡献率最大,且Wx-G/T-T具有最大的减效表型效应,典型载体材料为W030和云粳22;对于GC,贡献率最大的是Wx-G/T,最优等位变异是Wx-G/T-T,典型载体材料是华宽占和沈农016,其次是GBSSI-4-IF-C,典型载体材料是开平小优粒;对于ASV,贡献率最大的是alk-GC/TT,最优等位变异是alk-GC/TT-TT,典型载体材料是桂禾丰和软占。在水稻品质改良中,利用这些淀粉合成相关基因的优异等位基因及载体材料信息进行育种设计、杂交组合配置,从而将不同位点的优异等位基因进行聚合,以达到改良品质性状的目的。例如可利用携带控制AC、GC、ASV的关联位点优异等位变异的材料W030、开平小优粒、软占等作为骨干亲本或者供体亲本。这些材料具有对AC减效效应的等位变异位点Wx-G/T-T、对GC增效效应的等位变异位点GBSSI-4-IF-C和对ASV增效效应的等位变异位点alk-GC/TT-TT。针对现有育种材料开展分子改良或者多基因聚合,实现不同遗传背景的有利等位基因利用。
4 结论
共检测到22个与稻米品质性状显著关联的位点,其中同时与AC和GC关联的位点有5个。单个关联标记位点解释的表型变异比例（R2）范围是14.11%—75.62%。对表型变异解释率最大的是SSIIa的alk-GC/TT和SSIIa-F位点以及GBSSI的Wx-G/T和GBSSI-4-IF位点,表明GBSSI和SSIIa是影响AC、GC和ASV的2个主效基因。利用逐步回归分析获得了可以预测AC、GC和ASV的回归方程模型以及等位基因组合,同时发掘了AC、GC和ASV的优异等位变异及载体材料。The authors have declared that no competing interests exist.
