0 引言
【研究意义】马铃薯（Solanum tuberosum）在中国粮菜供给中具有重要地位[1]。但其块茎贮藏期间的腐烂损失颇为严重,由各类镰刀菌引起的干腐病是导致马铃薯腐烂的重要病害,块茎腐烂不仅造成巨大的经济损失,而且会积累真菌毒素,带来食用的安全隐患[2]。采收时在马铃薯块茎表面形成的大量伤口是致腐病原物侵入的主要通道[3],但块茎可通过形成愈伤组织来阻止病原物的侵入[4-5]。调查发现,不同品种的马铃薯如‘陇薯3号’、‘陇薯5号’和‘陇薯6号’等在贮藏期间的感病程度不同,耐贮性也就不同[6]。因此,研究不同抗性品种马铃薯块茎的愈伤能力,对于阐明不同品种块茎在贮藏期间的病害程度差异具有重要意义,也可为块茎贮藏提供理论依据。【前人研究进展】不同品种块根和块茎的愈伤能力存在较大差异。例如,‘Kemb 10’和‘SPK004’两个甘薯品种在愈伤期间不能连续形成木质层,木质化评分较低,抗病性不强。而‘Yanshu 1’和‘BP1-SP-2’两个品种则可连续形成木质层,木质化评分较高,抗病性较强[7]。AMAND等[8]分析了18个受损甘薯品种块根愈伤期间的乙烯释放量,发现不同甘薯品种间乙烯释放量、细胞木质化和伤口周皮的形成均存在显著差异,且乙烯释放量与细胞的木质化和周皮的形成存在一定的相关性。DASTMALCHI等[9-10]研究发现,不同品种马铃薯块茎愈伤组织中的极性和非极性提取物存在差异,品种‘Yukon Gold’的提取物中因富含酚类和长链脂肪酸而有利于软木脂的合成,而‘Norkotah Russet’和‘Atlantic’等品种的提取物中因缺乏这些物质而阻碍了软木脂的形成。【本研究切入点】针对单一或不同品种马铃薯块茎愈伤组织形成的生理生化及分子生物学研究已有报道,但对抗/感马铃薯品种间块茎愈伤能力的综合比较却未见报道。【拟解决的关键问题】以西北产区两个对干腐病抗性差异较大的马铃薯品种‘青薯168’（抗病）和品种‘陇薯3号’（感病）为试材,通过人工模拟创伤,在常温下进行愈伤,从组织化学和生理生化水平比较两个品种块茎愈伤期间的愈伤效果、木质素和软木脂积累以及苯丙烷代谢关键酶活性及其产物含量的差异,以期为马铃薯的块茎愈伤提供理论依据。1 材料与方法
试验于2014—2015年在甘肃农业大学食品学院采后生物学与技术实验室完成。1.1 材料与仪器
供试马铃薯品种‘青薯168’与‘陇薯3号’于2014年10月采自甘肃省渭源县会川镇,块茎装入网袋后当天运抵甘肃农业大学食品学院采后生物学与技术实验室,于常温（20—25℃,RH 70%—80%）下贮藏备用。供试硫色镰孢（Fusarium sulphureum）由甘肃省农业科学院植物保护研究所提供,PDA培养基上保存待用。超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）;立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）;恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）;正置万能显微镜（OLYMPUS公司）;紫外-可见光分光光度计（日本岛津）;台式高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 块茎创伤 参考包改红等[11]的方法并作修改。选取外观整齐,大小一致,无病虫害,无机械损伤的马铃薯块茎,用1%的次氯酸钠消毒清洗后,在每个块茎中部分别切出3块长×宽×深=20 mm×20 mm×2 mm的伤口,每处理用块茎200个,重复3次。1.2.2 块茎愈伤 参考包改红等[11]的方法。将人工损伤的块茎装入打孔的聚乙烯保鲜袋（25 cm×40 cm,厚度0.02 mm）中,置于常温（20—25℃,RH 70%—80%）条件下,并用黑色塑料薄膜覆盖避光,进行愈伤。
1.2.3 愈伤效果评价 失重率采用重量法测定,每个处理用块茎15个,重复3次。病情指数的测定采用孢子悬浮液的配置参照包改红等[11]的方法,于培养了7 d的硫色镰孢培养皿中加入适量的无菌水（含0.01% Tween-80）,用涂布器刮下培养基表面的病原菌孢子,用4层纱布过滤至三角瓶中,振荡20 s,采用血球计数板计数,制备成浓度为1×106 CFU/mL的孢子悬浮液。在创伤块茎愈伤的第0、3、5、7、14天时,将已配制好的孢子悬浮液均匀喷洒于块茎表面,晾干后装入打孔的聚乙烯保鲜袋中,于黑暗条件下贮藏,7 d后观察并统计病情指数。每个品种处理选用块茎30个,重复3次。
式中,发病级别评定标准：0级,创伤面不发生干腐病;1级,发生干腐病的面积占创伤面积的1/4;2级,发生干腐病的面积占创伤面积的1/2;3级,发生干腐病的面积占创伤面积的3/4;4级,创伤面完全发生干腐病。
1.3 木质素及软木脂沉积观察
木质素的沉积观察参照ALBA等[12]的方法并修改。用不锈钢刀片垂直于愈伤块茎创伤表面切出0.2—0.3 mm厚的薄片,蒸馏水冲洗3次后,置于载玻片上,滴加1%（w/v）间苯三酚溶液及浓盐酸染色1 min,置于光学显微镜下观察,拍照观察。软木脂（suberin poly aliphatic,SPA）的沉积观察参照LULAI等[13-14]的方法并修改。用不锈钢刀片垂直于块茎愈伤表面切出0.2—0.3 mm厚的薄片,蒸馏水冲洗3次后,进行如下染色观察。初染：配制0.05%（w/v）的甲苯胺蓝染液,染色45 min,染色过程中轻微振荡使其染色均匀;脱染料：分别用75%酒精、蒸馏水冲洗3次;复染：吸取中性红染液,染色1—1.5 min;除去染料：分别用75%酒精、蒸馏水冲洗3次。将染色的切片置于载玻片上,滴上清水加盖盖玻片,在荧光显微镜下观察,拍照。
块茎损伤表面的木质化细胞层厚度和软木脂总荧光强度分别根据文献[7,15]的方法通过IS Capture与Imagine J图像软件进行测量计算。
1.4 苯丙烷代谢关键酶活性及产物含量的测定
取样参照吴觉天等[16]的方法。在创伤后的0、3、5、7和14 d时,取皮下2—3 mm厚的愈伤组织2 g,用锡箔纸包好,液氮冷冻,粗酶液提取之前保存在-80℃超低温冰箱中待用。1.4.1 苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase, PAL)活性 参照YIN等[17]的方法。称取愈伤组织2 g,用3 mL 0.05 mol·L-1的硼酸缓冲液（含1% PVPP,5 mmol·L-1β-琉基乙醇,pH 8.8）冰浴研磨成匀浆,4℃、15 000×g离心30 min,取上清液用于酶活测定。酶促反应体系：将500 μL粗酶液加入0.05 mol·L-1的硼酸缓冲液中（pH 8.8）孵育,再加入20 mmol·L-1的L-苯丙氨酸,37℃保温30 min,充分混合后290 nm下测定吸光值,作为反应初始值（OD0）。再在37℃下反应1 h,测定其OD/290nm,作为终止值（OD1）。对照组以硼酸缓冲液代替酶液。每分钟内OD/290 nm变化0.01为1个酶活性单位（U）,以U·g-1 FW表示。重复3次。
1.4.2 木质素、总酚及类黄酮含量 木质素含量的测定参照YIN等[17]方法。取2 g愈伤组织,在预冷的5 mL 95%乙醇中研磨成匀浆状,然后4℃,14 000 ×g离心30 min,弃去上清液,将沉淀物用95%乙醇冲洗3次,再用乙醇﹕正己烷=1﹕2（V/V）冲洗3次,再次收集沉淀在60℃烘箱中干燥24 h,将干燥物转移至离心管中,溶于1 mL 25%溴化乙酰冰醋酸溶液,70℃恒温水浴30 min,最后加入1 mL 2 mol·L-1 NaOH中止反应。再加2 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol·L-1羟胺盐酸,离心,取上清液0.5 mL,用冰醋酸定容至5 mL,在280 nm下测定吸光值,样品重复3次。木质素含量以OD280·g-1 FW表示。
总酚及类黄酮含量的测定参照参照YIN等[17]方法。取2 g愈伤组织,于预冷的5mL 1% HCl-甲醇溶液中,冰浴研磨成匀浆进行提取,然后于4℃下12 000×g离心30 min,收集上清液分别于280、325 nm下测定吸光值。总酚与类黄酮含量分别以OD280·g-1 FW和OD325·g-1 FW表示。重复3次。
1.5 数据统计与分析
全部数据采用Excel 2007计算平均值和标准误（±SE）,采用SPSS 17.0进行Duncan’s多重比较检验分析。2 结果
2.1 马铃薯块茎抗/感品种愈伤期间失重率和病情指数
愈伤期间,两个品种块茎的失重率均逐渐升高,‘陇薯3号’的失重率显著高于‘青薯168’（图1-A）。第14天时‘陇薯3号’的失重率是‘青薯168’的2.1倍。两个品种块茎在不同愈伤时期接种硫色镰孢后的病情指数均逐渐降低。愈伤前期‘陇薯3号’的病情指数显著高于‘青薯168’（图1-B）,第3和5天时,该品种的病情指数分别是‘青薯168’的3.5和3.6倍。第7天时,两个品种病情指数接近,无显著差异,之后逐渐趋于一致。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1马铃薯品种‘青薯168’和‘陇薯3号’块茎愈伤期间失重率（A）和病情指数（B）
-->Fig. 1Weight loss (A) and disease index (B) of potato tuber cultivars ‘Qingshu No. 168’ and ‘Longshu No. 3’ during wound healing
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2.2 马铃薯块茎抗/感品种愈伤期间木质素和软木脂的积累
两个品种块茎愈伤组织的木质素沉积随愈伤时间的延长而增加（图2-A）。但‘青薯168’的木质素沉积速度明显快于‘陇薯3号’。前者的木质素染色较深,细胞形成层数较多。第14天时,‘青薯168’形成愈伤组织的细胞层数约为4—5层,细胞较小且排列紧密,而‘陇薯3号’的仅为2—3层,细胞较大且排列疏松。同样,两个品种块茎愈伤组织中的软木脂沉积也在不断增加（图2-B）。‘青薯168’的木栓化程度明显快于‘陇薯3号’。前者的荧光强度较高,细胞形成层数较多。第14天时,‘青薯168’的愈伤组织有5—6层细胞发出强烈荧光,而‘陇薯3号’只有2—3层细胞发出微弱荧光。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2马铃薯品种‘青薯168’和‘陇薯3号’块茎愈伤期间木质素（A）与软木脂（B）的积累
-->Fig. 2The accumulation of lignin (A) and SPA (B) of potato tuber cultivars ‘Qingshu No. 168’ and ‘Longshu No. 3’ during wound healing
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愈伤期间,两个品种块茎愈伤组织的木质化细胞层厚度均不断增加（图3-A）。‘青薯168’的木质层厚度显著大于‘陇薯3号’。第14天时,‘青薯168’的木质层厚度高出‘陇薯3号’47.4%。同样,两个品种愈伤组织中的软木脂总荧光强度也持续增加（图3-B）,第14天时,‘青薯168’的荧光强度高出‘陇薯3号’60.6%。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3马铃薯品种‘青薯168’和‘陇薯3号’块茎愈伤期间木质化细胞层厚度（A）和软木脂荧光总强度（B）
-->Fig. 3Thickness of lignified cell layers (A) and total fluorescent intensity of SPA (B) of potato tuber cultivars ‘Qingshu No. 168’ and ‘Longshu No. 3’ during wound healing
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2.3 马铃薯块茎抗/感品种愈伤期间苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性以及木质素、总酚和类黄酮含量
愈伤期间,两个品种块茎愈伤组织中的PAL活性明显存在差异（图4-A）。‘青薯168’的PAL活性呈缓慢上升趋势,而‘陇薯3号’呈现先下降,然后基本保持稳定的趋势。但‘青薯168’的PAL活性显著高于‘陇薯3号’。第14天时,高出‘陇薯3号’77%。随着愈伤时间的延长,两个品种愈伤组织中的木质素含量均逐渐上升,但‘青薯168’的木质素含量显著高于‘陇薯3号’（图4-B）。第7天时,‘青薯168’的木质素含量高出‘陇薯3号’65%。两个品种愈伤组织中的总酚含量在愈伤期间也存在差异（图4-C）。‘青薯168’的总酚含量不断增加,而‘陇薯3号’的基本稳定。但‘青薯168’的总酚含量在中期和后期均显著高于‘陇薯3号’,第14天时含量高出‘陇薯3号’76%。两个品种的类黄酮含量在愈伤期间的变化趋势基本相同,均随愈伤时间的延长而不断增加（图4-D）。但在愈伤前期差异显著,第0和3天时,‘青薯168’的类黄酮含量分别高出‘陇薯3号’43.5%和16.3%。而第5天以后,两个品种间的类黄酮含量基本保持一致。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4马铃薯品种‘青薯168’和‘陇薯3号’块茎愈伤期间苯丙氨酸解氨酶活性（A）以及木质素（B）、总酚（C）和类黄酮含量（D）
-->Fig. 4Activity of PAL (A), content of lignin (B), total phenolics (C) and flavonoids (D) of potato tuber cultivars ‘Qingshu No. 168’ and ‘Longshu No. 3’ during wound healing
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3 讨论
马铃薯块茎受不同程度的损伤后,伤诱导的栓化作用能够使块茎伤口自动愈合,在伤口表面新生成一层完整周皮,从而可以较好地维持块茎品质,抵抗病原物的侵染[18-19]。本研究发现不同品种间块茎的愈合能力存在较大差异。抗病品种‘青薯168’的失重率、病情指数显著低于感病品种‘陇薯3号’,而‘青薯168’的木质素与软木脂沉积速率及苯丙烷代谢活性显著高于‘陇薯3号’,表明抗病品种比感病品种具有更强的愈伤能力。受损马铃薯块茎的伤口应答和愈伤涉及许多生物过程,其中最为重要的就是伤诱导的栓化。该过程包括初级栓化和次级栓化两个时期,前者是伤口处形成‘封闭层’,而后者是‘封闭层’下形成‘伤口周皮’[3]。栓化完成后,伤口处会积累大量的脂质聚合物、软木脂和木质素等成分,这些物质在阻止水分蒸腾、营养损失及抵抗病原物方面发挥着重要作用[20]。愈伤期间,感病品种‘陇薯3号’的失重率显著高于抗病品种‘青薯168’（图1-A）,这可能与感病品种周皮的形成速度较慢,软木脂的积累速度较低有关。已有报道表明,软木脂是由沉积在细胞壁上的聚酚类物质（SPP）和沉积在细胞壁与细胞膜之间的聚脂类物质（SPA）通过甘油交联、蜡质填充而形成的杂聚物,这两类物质对病原物的抵抗作用存在差异,SPP可抵抗细菌性病害,而SPA只对真菌性病害表现抗性[21-23]。当SPA在伤后5—7 d沉积至第一层细胞时,块茎就具备了抵抗真菌侵染的能力[14]。本研究所观察到的块茎病情指数随着愈伤时间延长而降低的结果与之相符。此外,块茎愈伤组织积累的脂质和木质素以及周皮细胞层的厚度均会显著影响块茎对病原物侵染的抗性[24]。因此,抗病品种‘青薯168’所表现出的良好愈伤效果与其愈伤组织中木质素和SPA的快速积累（图2-A、2-B）以及较大的木质化细胞层厚度与软木脂荧光强度（图3-A、3-B）密切相关。JARVINEN等[23]发现,红皮抗病品种‘Asterix’和白皮感病品种‘Nikola’块茎的软木脂组织中SPA的成分与含量的变化在贮藏期间存在差异。由此表明,不同品种马铃薯块茎的愈伤能力与其愈伤组织中木质素与软木脂的积累速度密切相关。
蛋白组学的研究结果指出,马铃薯块茎的愈伤涉及细胞增大和分裂、细胞结构、信号转导、能量代谢和次生代谢等多种生化过程[25]。其中以苯丙烷途径为代表的多种次生代谢在块茎周皮的形成中起着重要作用[26-28]。苯丙氨酸解氨酶（PAL）作为植物体内合成总酚、类黄酮及木质素等物质的关键酶[29-30],在愈伤组织的形成中发挥着重要作用。该酶为软木脂的合成提供了酚前体[31],如阿魏酸和羟基肉桂酸衍生物等[32-34]。PAL在参与木质素形成的同时也参与了防御机制的诱导[35-36]。本研究显示,抗病品种‘青薯168’较高的PAL活性是导致该品种愈伤组织中木质素与软木脂快速积累的关键（图4-A）,该结果与SHAO等[37]在‘红富士’和‘嘎啦’苹果果实愈伤期间的观察结果类似。愈伤组织中积累的酚类物质和木质素还可能会直接毒杀病原物并参与物理屏障的形成[38-39]。有报道表明,过氧化物酶和H2O2参与了愈伤结构的形成[40],在过氧化物酶和H2O2的介导下酚酸类物质的聚合才能实现[41]。同样,MAHGOUBA等[42]也发现马铃薯抗病品种可产生更多的次生代谢产物,其总酚含量和过氧化物酶活性较高,木栓层较厚,能更好地氧化羟基肉桂醇生成木质素和交联细胞壁,从而具备较强的抗病性。由此表明,活性氧和过氧化物酶在马铃薯块茎愈伤组织形成中发挥了重要作用,但具体的作用机理尚有待今后进一步研究。
4 结论
抗/感马铃薯品种块茎的愈伤能力存在较大差异,抗病品种的愈伤能力要显著高于感病品种。抗病品种所具备的良好愈伤能力与其高活力的苯丙烷代谢密切相关,在苯丙氨酸解氨酶的作用下,块茎愈伤组织中快速积累酚前体,在过氧化物酶和H2O2参与下聚合为木质素与软木脂,促进了愈伤结构的形成。The authors have declared that no competing interests exist.
