0 引言
【研究意义】新疆野苹果及其红肉变型（Malus sieversii f.neidzwetzkyana（Dieck）Langenf.）是世界栽培苹果的祖先种,遗传多样性极为丰富,是苹果品质育种的重要种质[1],但新疆野苹果资源正遭到严重破坏,濒临灭绝,挖掘利用不够;生产上的栽培品种单一化态势明显,遗传基础变窄,而市场和消费者需要特色、多样化品种[2]。因此,进一步以新疆野苹果及其红肉变型为亲本创建的杂种分离群体为材料,研究MdVGT1蛋白在果实糖代谢中的作用,完善果实糖品质性状遗传与发育机理,对新疆野苹果资源的科学保护与持续高效利用具有重要意义。【前人研究进展】植物糖的运输主要由糖转运蛋白介导,目前在拟南芥中鉴定的至少有69种糖转运蛋白,分属8个亚家族,其中包括单糖转运蛋白家族[3]。多种糖的运输由单糖转运蛋白介导,如果糖、葡萄糖、麦芽糖及各种糖醇等,已报道的所有单糖转运蛋白都属于协助扩散超家族（MFS）,也称为共转运蛋白家族。根据其运输方式或运输物质不同,包括液泡膜葡萄糖转运蛋白、液泡膜单糖转运蛋白和己糖转运蛋白等[4],第一个被鉴定的单糖转运蛋白是绿藻CkHUP1,其对葡萄糖有一定的特异性[5]。果实中的糖虽依靠叶片光合作用产物的输入,但其糖分积累主要还是果实内部的作用[6],积累场所主要在液泡中,且受液泡膜上糖转运蛋白的严格调控[7-8]。目前在拟南芥中己经鉴定的液泡膜糖转运蛋白主要有液泡膜葡萄糖转运蛋白（VGT）[9-10]和液泡单糖转运蛋白（TMT）[8],它们都定位于液泡膜。在苹果中,MdTMT基因家族也得到鉴定,其中,MdTMT1和MdTMT2可能参与了果实成熟期蔗糖和果糖的积累[11]。【本研究切入点】课题组围绕新疆野苹果资源的保护与利用,在群体遗传结构等相关研究的基础上,于2006年率先构建了新疆红肉苹果与栽培苹果品种的杂种分离群体[12-13]。陈学森等[14]探讨了杂种一代类黄酮含量等性状遗传变异特点,并提出“功能型苹果”概念。张芮[15]和许海峰[16]等进行了杂种一代不同株系果实质地和类黄酮含量比较及相关基因表达分析,但杂种一代株系糖代谢机理及液泡膜葡萄糖转运蛋白VGTs有待进一步深入研究。【拟解决的关键问题】本研究以新疆红肉苹果杂种一代优系‘红脆1号’不同发育时期的果实及‘嘎啦’组培苗为试材,对苹果液泡膜葡萄糖转运蛋白MdVGT1进行生物信息及表达水平的分析,并通过酵母双杂交验证其互作关系及原核诱导获得重组蛋白,旨在为进一步研究苹果液泡膜葡萄糖转运蛋白的功能奠定基础,并为完善功能型苹果育种的理论与技术体系提供参考。1 材料与方法
1.1 植物材料与处理
植物材料为从新疆红肉苹果（Malus sieversii f. neidzwetzkyana）中的‘塔尔阿尔玛’与‘烟富3号’（M. domestica cv. Fuji）杂种一代选育出的‘红脆1号’优株以及‘嘎啦’组培苗（MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IAA）。从2015年4月开始,分别采集‘红脆1号’花后30、60、90及120 d等不同发育时期的果实,取样后液氮速冻,-80℃保存备用;另取‘红脆1号’初花时的花及花后30 d的幼果、新生叶、生长根、幼茎,液氮速冻,-80℃保存备用;用葡萄糖（0、10和20 g·L-1）处理‘嘎啦’组培苗一周后,将苗液氮速冻,-80℃保存备用。1.2 总RNA的提取与荧光定量
植物RNA提取试剂盒（DP432）、反转录试剂盒（KR106）、SYBR染料（FP205）均购自北京天根公司。荧光定量PCR仪型号为伯乐CFX96,按照SYBR® Green PCR Master Mix 说明书配制荧光定量PCR反应体系,每个样品设3个重复。反应体系为20 μL：10 μL 2.5×Real Master Mix/20×SYBR Solution,1 μL cDNA（50 ng·μL-1）,上下游引物各1 μL（5 μmol·L-1）,7 μL ddH2O。反应条件：① 95.0℃预变性30 s;②95.0℃变性5 s;③58℃退火10 s;④72.0℃延伸30 s（②—④共45个循环）;⑤ 65℃孵育20 s;⑥溶解温度从55℃到 95℃每升高0.5℃保持1 s;⑦停止反应。以苹果Actin为内参,每个基因扩增均伴有内参同时扩增,默认条件下读取Ct值,采用2 -ΔΔCT方法进行数据分析[17]。1.3 MdVGT1的克隆,生物信息分析与进化树的构建
利用拟南芥AtVGT1蛋白序列在苹果基因组中Blast比对得到一个基因序列号为MDP0000863082的基因,暂命名为MdVGT1,设计一对引物5′-ATG GCGTCGGATCCTGAG-3′和5′-CTAAAGGCACTT GGCCTCAAT-3′,以‘红脆1号’cDNA为模板,按照phusion高保真DNA扩增酶（F530）说明书进行PCR,用1%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳并回收目的条带,连接PLB零背景载体（VT205）进行测序。利用Expasy网站（http://web.expasy.org/protparam/）对氨基酸的理化性质进行分析,利用SMART网站（http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?GENOMIC=1）对蛋白结构功能域进行分析,利用MEGA 5软件构建进化树。
1.4 果肉葡萄糖含量的测定
参照赵智中等[18]的方法略做改进,准确称取5 g果肉,研磨成匀浆后转入到30 mL离心管中,加入25 mL超纯水,80℃水浴超声提取1 h,使可溶性糖和有机酸充分浸出,冷却后10 000 r/min离心15 min,将上清液过滤到50 mL的容量瓶中,残渣加入15 mL超纯水再提取,合并上清液,超纯水定容。用0.22 μm滤膜过滤后,液相色谱根据葡萄糖标准曲线和样品峰面积计算葡萄糖含量。色谱条件：岛津RID-10A示差折光检测器,色谱柱YMC Polyamine II（长度×内径：250 mm×4.6 mm,颗粒径：5 μm）,流动相：乙腈﹕水=75﹕25（V﹕V）,灵敏度：4,进样量：10 μL,流速：0.8 mL·min-1,柱温：30℃。1.5 酵母双杂交
用引物5′-CATATGATGGCGTCGGATCCTGAG- 3′和5′-GAATTCCTAAAGGCACTTGGCCTCAAT-3′扩增MdVGT1的编码框序列,用引物5′-CATATGAT GAAGAAGGGAGCCGTG-3′和5′-GTCGACTTACT CGTTTTTGGCAGCC-3′扩增MdTMT1的编码框序列,之后连接PLB零背景载体。用NdeⅠ和EcoRⅠ对MdVGT1-PLB和pGADT7分别进行双酶切,用NdeⅠ和SalⅠ对MdTMT1-PLB和pGBKT7分别进行双酶切,构建pGADT7-MdVGT1和pGBKT7-MdTMT1重组载体。按照YeastmakerTM Yeast Transformation System 2试剂盒（Clontech）说明书方法,将这两种重组质粒共转化到酵母Y2H感受态细胞,细胞先培养在-T-L选择性培养基中（-Leu/Trp,Clontech）,然后将生长的细胞培养在-T-L-H-A选择性培养基中（-Ade/-His/-Leu/-Trp,Clontech）,最后用X-α-gal作为底物添加到四缺培养基中检测β-galactosidase。1.6 MdVGT1原核表达
用引物5′-GAATTCATGGCGTCGGATCCTGAG- 3′和5′-GTCGACCTAAAGGCACTTGGCCTCAAT-3′扩增MdVGT1的编码框序列,之后连接到PLB零背景载体。用EcoRⅠ和SalⅠ对克隆载体和原核表达载体pET28a分别进行双酶切,构建原核重组表达载体pET28a-MdVGT1,将重组质粒转化到大肠杆菌DE3感受态中。加入1 mmol·L-1 IPTG后分别在0、2、4、6 h时取样于4℃暂时保存,取6 h菌液离心收集菌体,用8 mL PBS缓冲液悬浮,超声破碎（打6 s,停9 s,25个循环）分离可溶性蛋白和包涵体,SDS-PAGE电泳检测。1.7 数据分析
用Excel 2007进行作图和数据分析,DPS 7.05软件进行显著性分析,Spss进行相关性分析。2 结果
2.1 MdVGT1的克隆与基因组结构分析
如图1所示,获得了一条大小约为1 500 bp的条带,与预期大小一致,序列测定与分析表明,MdVGT1的完整开放阅读框长度为1 506 bp,编码501个氨基酸,预测其蛋白质分子量为53.16 kD,等电点为5.92。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1MdVGT1编码区全长的RT-PCR扩增
-->Fig. 1Agarose gel electrophoresis of MdVGT1 RT-PCR products
-->
利用GDR数据库（http：//www.rosaceae.org/）分析MdVGT1的染色体位置和基因结构。如图2所示,MdVGT1位于苹果基因组的1号染色体上,由14个外显子和13个内含子构成。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2MdVGT1染色体定位和基因组结构
-->Fig. 2Chromosomal location and genomic structure of the MdVGT1
-->
2.2 MdVGT1的进化树和结构功能域
如图3所示,液泡单糖转运蛋白TMT和蔗糖转运蛋白SUT/SUC分别在不同物种间都在同一个进化树枝上,因其具有相同的功能。而MdVGT1和拟南芥AtVGT1同样在同一个进化树枝上,推测苹果MdVGT1与拟南芥AtVGT1的功能相似（图3中比例尺0.1代表每10个氨基酸有1个不同）。SMART功能域分析表明MdVGT1有12个跨膜区域。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3糖代谢相关转运蛋白系统进化树分析
-->Fig. 3Phylogenetic tree of relative transporter in glycometabolism
-->
2.3 MdVGT1组织表达特性及果实发育过程中MdVGT1表达量与葡萄糖含量相关性
由图4可得,MdVGT1在根、茎、叶、花、果实中都有表达,其中在叶、花和果实中具有较高的表达。由图5可得,MdVGT1表达量和葡萄糖含量均在花后120 d达到最大值,经Spss显著性分析可得,MdVGT1表达量和葡萄糖含量在0.05水平上显著相关（显著性系数为0.986）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4MdVGT1在不同苹果组织中的相对表达量
-->Fig. 4Relative expression of MdVGT1 gene in different tissues of apple
-->
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图5‘红脆1号’苹果果实不同发育期VGT1相对表达量和葡萄糖含量
-->Fig. 5Relative expression of ‘Hongcui 1’ VGT1 and glucose content at different stages
-->
2.4 MdVGT1启动子顺式作用元件和葡萄糖处理‘嘎啦’组培苗MdVGT1的表达
利用https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?sid= &lang=en&pj=640&action=page&page=newplace网址分析MdVGT1启动子的顺式作用元件,结果如表1。MdVGT1启动子序列含有多个与抗逆性相关的作用元件：ACGTATERD1和MYBCORE是与脱水相关的元件[19-21],MYB1LEPR是与防御相关的元件[22],MYCCONSENSUSAT是与低温相关的元件[23-24];SREATMSD是与糖信号相关的元件[25]。此外,在启动子序列中还发现了不同激素响应元件：细胞分裂素诱导顺式作用元件CPBCSPOR[26],脱落酸相关作用元件ABRELATERD1[27],乙烯代谢相关作用元件ERELEE4[28-29]。表明MdVGT1除受糖信号诱导外,还可能参与了抗逆和逆境胁迫反应。Table 1
表1
表1 MdVGT1基因上游调控序列重要顺式作用元件分析
Table 1Some important cis-acting regulatory elements in the upstream regulatory sequences of MdVGT1
| 顺式作用元件名称 Cis-acting element name | 序列 Sequence | 位点功能 Function of site | 起始位点 Start site | 终止位点 Terminal site |
|---|---|---|---|---|
| ACGTATERD1 | ACGT | 与叶片衰老相关的脱水和黑暗应答元件 Cis-acting element involved in dehydration stress and dark-induced leaf senescence | -1338 -1334 -129 | -1335 -1331 -126 |
| MYB1LEPR | CTTAGTT | 防御相关元件 Cis-acting element involved in defence induction | -211 | -205 |
| MYBCORE | CNGTTR | 脱水响应元件 Cis-acting element involved in dehydration stress | -1289 -1066 | -1284 -1061 |
| MYCCONSENSUSAT | CANNTG | 低温相关元件 Cis-acting element related to cold | -1865 -1834 | -1860 -1829 |
| SREATMSD | TTATCC | 与糖信号相关元件 Cis-acting element involved in sugar signaling response | -1781 | -1776 |
| CPBCSPOR | TATTAG | 细胞分裂素诱导元件 Cis-acting element involved in cytokinin induction | -1909 -695 -616 | -1904 -690 -611 |
| ABRELATERD1 | ACGTG | 与脱落酸相关元件 Cis-acting element involved in the abscisic acid response | -1334 | -1330 |
| ERELEE4 | AWTTCAAA | 乙烯相关元件 Cis-acting element involved in the ethylene response | -882 | -875 |
新窗口打开
图6中,CK表示‘嘎啦’组培苗生长在不添加葡萄糖的培养基,处理1表示‘嘎啦’组培苗生长在10 g·L-1培养基（MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IAA+ 10 g·L-1葡萄糖）,处理3表示‘嘎啦’组培苗生长在20 g·L-1培养基（MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IAA+ 20 g·L-1葡萄糖）。由图6可得,培养基中葡萄糖含量越高,VGT1的表达量也越高。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图6MdVGT1基因在葡萄糖诱导下的相对表达量
-->Fig. 6Relative expression of MdVGT1 gene induced by glucose
-->
2.5 MdVGT1与MdTMT1酵母双杂交
由图7酵母双杂交试验可得,空载体pGADT7和MdTMT1+pGBKT7、空载pGBKT7和MdVGT1+ pGADT7共转Y2H均在二缺板上生长,在四缺及四缺+X-α-gal不生长;而MdVGT1和MdTMT1共转Y2H在二缺、四缺及四缺+X-α-gal都能生长,因此推测其在体外能够相互作用。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图7MdVGT1和MdTMT1酵母双杂交
-->Fig. 7Yeast two-hybrid in MdVGT1 and MdTMT1
-->
2.6 MdVGT1蛋白的原核表达
由图8可得,1 mmol·L-1IPTG诱导0、2、4、6 h后的蛋白提取物经SDS-PAGE电泳在55 kD左右有一条带,与预期蛋白大小一致,且颜色随时间推移变深。此外,经超声破碎后,诱导产生的MdVGT1蛋白以包涵体的形式存在。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图8pET28a-VGT1在大肠杆菌BL21中的表达产物、上清液和包涵体蛋白的SDS-PAGE
-->Fig. 8SDS-PAGE of pET28a-VGT1 expression products ,soluble protein in the supernatant and inclusion body protein
-->
3 讨论
3.1 液泡膜葡萄糖转运蛋白MdVGT1与糖代谢关系
植物中糖转运蛋白都有相似的拓扑结构,为膜结合蛋白,有12个跨膜结构域,不仅可以跨细胞膜,有的还跨液泡膜和质体膜或者线粒体膜[30]。拟南芥AtVGT1和AtTMT1主要在花和叶中表达[8-9],其中AtVGT1对葡萄糖有着高度特异性,而AtTMT1不仅能转运葡萄糖,对果糖也有一定的选择性,同时也可作为蔗糖的逆向转运蛋白,转运蔗糖进入液泡[10,31]。另有研究表明拟南芥AtSUC1和苹果MdSUT1能够参与ABA诱导的糖代谢途径[32-33],而AtTMT1可受低温,盐胁迫等诱导参与逆境胁迫与糖信号代谢[8]。本研究发现,MdVGT1蛋白的结构和功能与拟南芥糖转运蛋白类似,分析其启动子发现,它可能参与激素和逆境胁迫相关的糖代谢途径,其表达水平对葡萄糖含量有一定的特异性,且可能与MdTMT1在液泡膜形成复合体共同转运葡萄糖进入液泡。同时通过原核诱导获得了MdVGT1的重组蛋白,上述工作为进一步研究MdVGT1蛋白的功能奠定了基础。3.2 糖代谢与功能型苹果育种
有效利用现代分子生物学技术,及时借鉴模式植物的最新研究进展与成果,积极探讨果树特色种质或新品种在品质性状形成与调控机理方面的特异性,是近几年果树分子生物学研究领域的重要趋势之一[15]。因此,新疆野苹果资源的亲本利用,不仅可培育功能型苹果等特色多样化品种（系）,实现资源的利用保存,创建多层次的种质资源保护保存技术体系,同时为果实糖品质性状遗传与发育机理的研究提供了丰富的试验材料[2]。本文以新疆红肉苹果杂种一代‘红脆1号’为试材,克隆了液泡膜葡萄糖转运蛋白MdVGT1,初步探讨了其与葡萄糖及MdTMT1的关系,未来将对新疆红肉苹果杂种分离群体糖含量差异的优株进行糖代谢相关基因的表达分析及糖转运蛋白的研究,旨在从新疆红肉苹果杂种一代中选育出含糖量多的功能型苹果品种。4 结论
在‘红脆1号’苹果中克隆获得了液泡膜葡萄糖转运蛋白基因MdVGT1,其表达量与葡萄糖含量显著相关且受葡萄糖诱导;其可能与MdTMT1互作共同转运葡萄糖进入液泡膜。原核诱导获得了其重组蛋白,可用于进一步研究MdVGT1蛋白在果实糖代谢中的转运机制。（责任编辑 赵伶俐）
The authors have declared that no competing interests exist.
