0 引言
【研究意义】发掘优异种质资源、获得突破性育种材料是选育优良品种的基础与前提。由于中国不是玉米的起源地和多样性中心,不断引进国外自交系、群体及杂交种等并加以改良应用十分重要[1]。其中,生产上大面积利用的不同类型杂交种,多数是经过长期自然选择与人工选育不断积累人类所需特性的种质结晶,以杂交种为基础材料发掘种质资源在以往的玉米育种实践中发挥了重要的作用,特别是引进的国外杂交种是中国玉米种质资源扩充的重要来源之一[2]。目前,世界上玉米生产95%以上利用的是单交种,而单交种是由两个亲本配制的杂交组合,具备强杂种优势对于提高产量至关重要,因而育种家对基础材料所属的杂种优势群十分重视。尽管不同的育种家将育种材料分成不同的优势群[3-6],但是不变的总是一类材料适合作母本,而另一类材料相应适合作父本。大量研究与实践表明,分子标记可以较真实地反映材料间遗传关系,服务于划分杂种优势类群[7-9]。因此,利用分子标记辅助选择技术,依据双亲遗传信息,研究基于杂交种资源建立高效实用的种质资源创新方法体系,对于提高该类资源的利用效率,推动玉米育种发展进程具有重要意义。【前人研究进展】生产上利用的杂交种是一类重要的种质资源。事实上,20世纪70年代末从美国、东欧引入中国的一批杂交种,不同程度地含有Reid种质,株型紧凑,茎秆坚韧,籽粒偏马齿,以其作为基础材料,育成了一批优良自交系并逐步形成了中国的改良Reid类群[10],组配出的杂交种在中国玉米生产上发挥了巨大作用,如沈单7号、掖单12、郑单958等[11-12];20世纪80年代末,美国先锋公司的78599等杂交种引入中国,由于遗传基础丰富,具有抗病、抗倒、保绿度好、活秆成熟等优点,以其作为基础材料,经过多代自交和群体选择,成功选育出了一批多抗性材料[13-14],形成了中国另外一个重要优势群类型——P群[15],并育成了鲁单50、农大108等一批在生产上发挥了重要作用的优良杂交种。这些基于杂交种选育出的自交系在中国玉米育种种质基础与骨干亲本的形成上发挥了重要的作用[16],同时这些工作也是成千上万玉米育种工作者成功的典范。随着生物技术的发展,借助分子标记辅助选择策略从一个亲本信息未知的杂交种中快速选出相对适合作父本和母本的材料在理论上成为可能,由于玉米种皮组织与母本在遗传信息上是一致的,胚具有双亲的遗传信息[17],通过玉米杂交种F1可成功推断获得相应父母本基因型[18-19]。而育种实践也同样证明这是可行的,GUAN等[20]利用SNP标记开展了基于杂交种的反向分子育种研究,并取得了成功。【本研究切入点】利用杂交种这类种质资源有多种策略,其中,最普遍的是创制二环系。但应用常规方法或加倍单倍体技术选育出的二环系往往利用方向欠明确,育成的自交系需要进行大量的测配和田间鉴定判定所属的杂种优势群,耗时费力,选育效率较低,难以符合现代玉米育种的需求。利用分子标记技术摸索高效发掘杂交种后代中分别适合作母本和父本材料的方法对有效利用杂交种资源、提高玉米育种效率是十分有必要的。【拟解决的关键问题】本研究以爆裂玉米杂交种JB1构建的各世代群体为试验材料,通过经济适用、可灵活组合的全基因组SSR分子标记进行辅助选择,筛选类父、类母本材料,进一步摸索建立基于分子标记辅助选择和杂交种资源开展种质资源创新的实用方法,旨在通过SSR分子标记辅助选择的方法提高开发利用杂交种类资源创新种质的效率,为快速发掘优异种质资源、推动遗传改良进程提供技术支撑。1 材料与方法
1.1 试验材料
以爆裂玉米杂交种JB1为试验材料,与其他普通玉米杂交种相比,爆裂玉米品种通常双亲植株性状及籽粒性状差异不大,仅从表型选择杂交种后代优良个体比较困难。2013年先后于北京顺义和海南三亚试验基地种植杂种F1和F2分离群体。2014年夏于北京顺义试验基地种植380个F2:3家系,进行分子标记辅助选择。2014年冬于海南三亚试验基地种植通过分子标记辅助选择获得的类父本、类母本材料及通过育种经验选取的优异代表性材料,同时种植库存资源爆裂玉米自交系5007、5027和5087,用于组配测交组合,为评估基于分子标记辅助选择创新种质的配合力及育种应用价值做准备。1.2 双亲指纹图谱的构建
取5粒JB1的F1代种子,利用碱泡法[21]分解种皮与胚乳间的外胚乳层,手工剥离获得无胚乳污染的籽粒种皮,然后利用植物基因组DNA提取试剂盒PlantZol（北京全式金生物技术有限公司）提取种皮DNA样品（玉米种皮实际是果皮和种皮的复合物,果皮和种皮分别由子房壁和胚珠的珠被发育而来,与母本具有相同的基因组组成）。同时,切取杂交种的胚组织,通过碱煮法[22]快速提取DNA样品（由于胚由受精卵发育而来,因此具有双亲的遗传信息）。利用玉米基因组数据库（http://www.maizegdb.org/data_ center/map）公布的标记序列信息合成SSR引物,经PCR扩增,8.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,0.1% AgNO3染色,甲醛和NaOH显色,在全基因组范围内进行多态性SSR分子标记筛选。鉴于SSR分子标记为共显性标记,亲本一般出现一条扩增带,杂交种一般出现双亲互补型两条扩增带[23],通过比对可推测出另一亲本扩增带型。本研究中根据种皮和胚的扩增带型差异,推测出父本扩增带型,建立双亲分子指纹图谱。1.3 分离后代基因型鉴定及材料选择
当玉米幼苗生长至5片叶时,取幼嫩叶片,采用CTAB法[24]提取DNA并纯化。根据构建的指纹图谱信息及IBM2 2008 Neighbors图谱公布的标记遗传位置,从中选取均匀分布的多态性标记对各世代群体进行基因型鉴定。对于F2:3家系及F3单株,利用基于全基因组筛选获得的多态性SSR分子标记进行基因型鉴定,对于F4单株,在排除纯合位点的基础上,对材料杂合位点进行进一步基因型鉴定。利用Microsoft Excel 2010对各世代基因型数据进行整理,分别计算所选材料与父本或母本的相似度和纯合程度。计算公式如下：PS（%）=（X + 0.5×Hy）/ N×100%
Ho（%）=（M + F）/ N×100%
其中,PS（%）为亲本相似度,X为与父本或母本相同的基因型数,Hy为杂合基因型数,N为有效基因型数;Ho（%）为纯合程度,M和F分别对应父本类型基因型数和母本类型基因型数,N为有效基因型数。
以PS（%）作为分子标记辅助选择依据,选取类父本、母本材料。同时,依据育种经验,对相应世代单株进行综合评价,从中筛选优异材料,并同分子标记辅助选择获得的类父、母本材料一同种植,用于后续研究工作。
1.4 田间试验及产量测定
经过分子标记辅助选择,2014年冬,将入选的F2:3家系相应F3单株全部种植于海南三亚试验基地,在此期间,继续对F3单株及进一步入选F3单株相应后代进行分子标记辅助选择。对基于F3单株基因型数据入选的F3:4家系,采用不完全双列杂交方法,构建杂交组合（类母本×类父本,类父本×类母本）。同时,将入选以外的家系与入选家系材料随机组配（类母本×类父本,类父本×类母本,类父本×类父本,类母本×类母本）,获得不同遗传距离组合,用于探讨通过分子标记辅助选择获得不同类型材料在分离后代之间的杂种优势程度。此外,种植优良测验种5007、5027和5087为父本,与所有材料构建测交组合（类父本×测验种,类母本×测验种,育种经验选取材料×测验种）,以评估经分子标记辅助选择创新种质资源的育种应用价值。2015年夏,于北京顺义（40.2° N,116.6° E）及河北蔚县（39.8° N,114.6° E）2个环境下种植杂交组合,田间试验采用间比法设计,2行小区,行长3 m,行距0.6 m,株距0.3 m,每30小区种植对照品种JB1。全部田间试验中的施肥、灌溉、防虫和除草同当地大田管理一致。成熟后,按组合收获,果穗风干至恒重,小区果穗混合脱粒,称量小区产量。1.5 数据分析
利用GGT软件[25],采用Allele sharing/SM相似系数算法,依据辅助选择材料基因型数据,计算两两间遗传距离。在此基础上,利用MEGA 6软件[26],采用UPGMA法（unweighted pair group method using arithmetic average）进行聚类分析。利用Microsoft Excel 2010进行数据整理,利用SAS 9.2软件对不同类型遗传距离组合产量数据进行多重比较分析。2 结果
2.1 指纹图谱构建及辅助选择标记的确定
利用玉米全基因组范围内的1 515对SSR引物对试验材料种皮及胚的DNA进行PCR扩增、电泳,筛选获得167对扩增清晰的多态性SSR分子标记,用于推测双亲指纹图谱（图1）。最终,根据玉米基因组数据库（http://www.maizegdb.org/data_center/map）公布的遗传位置,从中选取均匀分布于10条染色体的多态性标记97对,用于各世代分离群体的分子标记辅助选择（图2）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1基于第1染色体入选SSR分子标记扩增JB1种皮及胚图谱
-->Fig. 1DNA footprints of JB1’s pericarp and embryo using SSR markers on Chromosome 1
-->
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2用于各世代群体辅助选择的多态性SSR分子标记在10条染色体上的遗传位置分布图
-->Fig. 2Chromosomal distribution of the polymorphic SSR markers used in progeny selection
-->
2.2 分子标记辅助选择材料基因型变化情况
利用93对多态性引物对380个F2:3家系进行基因型鉴定,从中筛选出了最具典型性的类父、母本家系各10个。其中,筛选的类父本家系中,父本相似度介于64.8%—68.8%,平均为66.5%,纯合程度介于45.1%—63.0%,平均为54.7%;筛选的类母本家系中,母本相似度介于58.2%—63.6%,平均为60.0%,纯合程度介于43.5%—58.2%,平均为51.4%。利用97对（新增4对,分别为umc2363、umc1117、umc2041和umc1101）多态性引物对来源于上述20个家系的285个F3单株进行基因型鉴定,筛选获得了类父、母本F3单株各12个。入选的类父本F3单株中,父本相似度介于70.3%—79.6%,平均为73.3%,纯合程度介于69.8%—87.1%,平均为79.0%;入选的类母本F3单株中,母本相似度介于63.7%—70.2%,平均为66.9%,纯合程度为73.7%—81.0%,平均为76.4%。在排除纯合位点的基础上,对不同类群内的总计384个F4单株的杂合位点进行进一步基因型鉴定,从中分别筛选出10个极端类父本单株和10个极端类母本单株。其类父本F4单株与父本相似度介于78.4%—79.5%,平均为78.8%,纯合程度介于87.2%—96.8%,平均为92.0%;类母本F4单株与母本相似度介于71.6%—73.7%,平均为72.7%,纯合程度介于85.3%—95.8%,平均为88.9%（表1）。Table 1
表1
表1辅助选择材料从F2代到F4代亲本相似度及纯合程度分析
Table 1Results of parental similarity and homozygosity of selected materials from F2 to F4
| 分类 Classification | 项目 Item | 辅助选择的F2单株 Selected F2 individual plants | 辅助选择的F3单株 Selected F3 individual plants | 辅助选择的F4单株 Selected F4 individual plants | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 变化幅度 Range | 均值 Average | 变化幅度 Range | 均值 Average | 变化幅度 Range | 均值 Average | ||
| 类父本材料 Male-like materials | 父本相似度 Similarity to male parent (%) | 64.8—68.8 | 66.5 | 70.3—79.6 | 73.3 | 78.4—79.5 | 78.8 |
| 纯合程度 Homozygosity (%) | 45.1—63.0 | 54.7 | 69.8—87.1 | 79.0 | 87.2—96.8 | 92.0 | |
| 类母本材料 Female-like materials | 母本相似度 Similarity to female parent (%) | 58.2—63.6 | 60.0 | 63.7—70.2 | 66.9 | 71.6—73.7 | 72.7 |
| 纯合程度 Homozygosity (%) | 43.5—58.2 | 51.4 | 73.7—81.0 | 76.4 | 85.3—95.8 | 88.9 | |
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对各世代类父、母本材料基因型数据汇总分析可以看出（表1,图3）,通过3次分子标记辅助选择,所选材料与亲本相似度整体上不断提高,但随着世代的推进,提高幅度逐渐减小。通过F2代挑选偏双亲基因型的材料,经过进一步的选择,在F4世代,类父本材料与父本的相似度最高可达79.5%,类母本材料与母本的相似度最高可达73.7%。若对试验材料不加以分子标记辅助选择,各世代分离群体亲本相似度均值应围绕50%上下波动,纯合程度从F2代至F4代分别应为50%、75%和87.5%。通过分子标记辅助选择后,从F2代开始亲本相似度显著高于50%,纯合程度均高于其理论均值（图4）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3各世代材料分子标记辅助选择进度
-->Fig. 3Progess of marker-assisted selection of materials from F2 to F4
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4通过辅助选择获得的不同类型材料在各世代中亲本相似度及纯合度分析
-->Fig. 4Parental similarity and homozygosity of different groups of materials by assisted selection in F2 and two subsequent generations
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2.3 遗传距离及聚类分析
对收获的杂交种,根据双亲基因型数据进行遗传距离分析,统计结果表明,F4代类父本材料与类母本材料间平均遗传距离为0.68,最大值为0.86。经过3次辅助选择,类父、母本材料间保持了较大的遗传距离。根据试验材料基因型数据进行聚类分析（图5）,结果显示,24个F3辅助选择材料后代（384个F4单株）被划分为两大类群,亲缘关系较近材料均被划为同一类群。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图5F3代辅助选择材料后代的UPGMA聚类分析
-->Fig. 5Cluster analysis of the progenies of selected plants in F3 generation via UPGMA method
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2.4 产量数据分析
2.4.1 类父、母本材料组间及组内测交组合产量结果 总体看来,在2个试验点中,类父、母本材料间组配组合（类母本×类父本或类父本×类母本）小区产量均高于同类材料组配的组合（类父本×类父本,类母本×类母本）（α=0.05）,但未发现高于原始杂交种最大值的组合（表2）。Table 2
表2
表2不同地点的各类型组合及对照的小区产量
Table 2Plot yields of all hybrid combinations and the control at differernt locations
| 地点 Location | 组合 Hybrid combination | 组合数 No. of combinations | 平均值±标准差 Mean±SD (kg) | 变化范围 Range (kg) | 差异显著性* Significance of difference（α=0.05） |
|---|---|---|---|---|---|
| 北京顺义 Shunyi of Beijing | 类母×类父或类父×类母 Female-like×Male-like or Male-like×Female-like | 803 | 1.64±0.28 | 0.97—2.61 | b |
| 类母×类母Female-like×Female-like | 105 | 1.42±0.21 | 0.94—1.93 | d | |
| 类父×类父Male-like×Male-like | 131 | 1.54±0.29 | 1.00—2.47 | c | |
| 对照Control | 33 | 2.22±0.27 | 1.70—2.69 | a | |
| 河北蔚县 Yuxian of Hebei | 类母×类父或类父×类母 Female-like×Male-like or Male-like×Female-like | 484 | 1.81±0.40 | 1.00—3.00 | b |
| 类母×类母Female-like×Female-like | 51 | 1.46±0.25 | 1.00—2.10 | c | |
| 类父×类父Male-like×Male-like | 55 | 1.36±0.27 | 1.00—2.00 | c | |
| 对照Control | 17 | 2.55±0.35 | 1.80—3.10 | a |
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以杂交组合双亲间遗传距离作为分类依据,可将组配的杂交种划分为三大类,即遗传距离<60%,遗传距离介于60%—70%,遗传距离>70%。总体而言,随着遗传距离的增加,相应的小区产量呈现出增加趋势,但增加幅度较缓,结果表明,通过分子标记辅助选择获取的类父、母本材料间可在一定程度上恢复原有杂种优势（图6）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图6不同遗传距离亲本配制的组合小区产量分析
-->Fig. 6Plots yield of combinations with parents which had different genetic distance
-->
2.4.2 测验种组配的组合产量结果及育种价值分析 对2个环境下共同种植的测交组合产量数据进行统计分析表明,分子标记辅助选择材料与3个测验种5007、527和5087测交表现出较高的一般配合力（表3）,其平均产量明显高于分子标记辅助选择获得材料之间组配的组合。尽管与3个测验种组配组合的产量平均水平低于原始对照杂交种,但在北京顺义和河北蔚县2个环境均存在优于对照的组合（表3）。此外,本研究中通过育种经验选取的756个优异材料与3个测验种测交获得了1 344个组合,其一般配合力平均水平低于分子标记辅助选择获得的材料（图7）。
Table 3
表3
表32个环境下不同测验种组配测交组合及对照小区的产量
Table 3Plot yields of the testcrosses by three testers and the control in two locations
| 地点 Location | 测验种 Tester | 测交组合数 No. of testcross | 平均值±标准差 Mean±SD (kg) | 变化范围 Range (kg) | 差异显著性 Significance of difference (α=0.05) |
|---|---|---|---|---|---|
| 北京顺义 Shunyi of Beijing | 测验种5007 Tester 5007 | 130 | 2.00±0.35 | 1.23—2.99 | ab |
| 测验种5027 Tester 5027 | 223 | 1.94±0.33 | 1.18—2.70 | b | |
| 测验种5087 Tester 5087 | 108 | 2.08±0.33 | 1.30—3.25 | a | |
| 对照 Control | 27 | 2.12±0.33 | 1.34—2.65 | a | |
| 河北蔚县 Yuxian of Hebei | 测验种5007 Tester 5007 | 130 | 1.85±0.41 | 0.80—2.70 | b |
| 测验种5027 Tester 5027 | 223 | 1.79±0.45 | 0.70—3.00 | b | |
| 测验种5087 Tester 5087 | 108 | 1.97±0.47 | 1.00—3.12 | b | |
| 对照 Control | 18 | 2.24±0.50 | 1.40—3.03 | a |
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图7不同类型辅助选择材料与3种测验种组配的测交组合小区产量
-->Fig. 7Plot yield performance of testcrosses between the three groups of materials obtained by assisted selection and three testers
-->
3 讨论
3.1 利用分子标记技术可以提高基于杂交种资源种质创新的选育效率
目前,中国对杂交种类资源的利用大部分采取常规的育种方法,直接进行二环系选育或是通过与其他材料构建三交后进行自交系的选育。在进行常规选系的过程中,育种家除了选择具有优良农艺性状、抗性好个体或群体的同时,还需要进行大量的测交试验,以便选育特定杂种优势群内的材料,尤其是对于一些遗传信息未知的杂交种,不但耗时费力,而且测配结果受到环境因素影响很不稳定。而分子标记可较好地反映材料间遗传关系,以分子标记辅助选择手段进行基于杂交种资源的种质创新工作,以基因型作为重要的选择标准,具有较强的预见性,受外界因素影响较小,并且辅助选择后代表型加以基因型判断容易进行杂种优势类群归类。GUAN等[20]利用SNP芯片开展玉米反向育种,以覆盖全基因组的192个SNP位点作为选择依据,对杂交种后代进行逐代辅助选择,F4代当选材料中,父本基因型最高可恢复76%,母本基因型最高可恢复73%,F4代自交两代纯合后,重新组配杂交种,表现出杂种优势。本研究中,利用97对广泛分布的SSR分子标记开展杂交种类资源种质创新研究,F4代辅助选择材料父本相似度最高可达79.5%,母本相似度最高可达73.7%,F4代相互组配,不同类型辅助选择材料组配的杂交种小区产量显著高于同类型辅助选择材料组配的杂交种。虽然与GUAN等[20]研究所采用的分子标记类型不同,数量有异,但辅助选择结果相似,通过分子标记辅助选择均大大提高了杂交种后代的选育效率。同时,由于SSR分子标记应用简单,不需要过多投入,可在实验室独立完成,并且对于不同基础材料可重复筛选利用,因此,节约了试验成本,并且提高了试验灵活性。如果在选择过程中结合南繁或温室加代,一年推进3—4个世代,可大大缩短选育时间。3.2 结合常规测交试验进一步快速明确选择材料的育种应用价值
育种材料的配合力是玉米育种家选择后代的重要指标,也是育种材料应用价值的体现[27]。在种质创新与育种方面,科研人员一直在摸索不同的途径实现创新工作效益的最大化,有人提出反向育种思路,比如通过转基因沉默技术,干扰控制减数分裂重组过程中的部分基因,得到未发生过重组的纯合单倍体植物,再通过多倍化技术形成双单倍体（double haploid,DH）植株,进而获得原杂交组合[28-30],目前该方法仍处于研究阶段,还未应用于实际育种当中[31-32]。本研究有别于上述情况,通过连续地分子标记辅助选择,获得与原双亲基因型相近的材料,并对分子标记辅助选择材料进行遗传关系及配合力分析,研究如何更快、更好地从杂交种类基础种质资源中分离出分别适合作父本、作母本的优良新材料,提高选择与利用效率。为了验证选择效果,本研究中选取了3个爆裂玉米自交系作为测验种进行早代测配,评估辅助选择材料的育种应用价值。对这3个测验种分子检测结果显示,测验种5007与5027基因型相对接近母本,而测验种5087基因型与供试品种双亲比较均有较大差异。测交验证试验结果表明,整体上通过分子标记辅助选择获得的材料表现出较高的一般配合力,其中测验种5007与5027与类父本材料之间测配组合的产量在北京顺义和河北蔚县2个环境条件下均较高;而测验种5087在2个环境条件下均出现较多的优异组合。此外,对于本研究所获得的优异组合,正在进行进一步的培育,有望育成有实用价值的新品种。3.3 分子标记辅助选择杂交种后代创新种质资源的一些建议
利用分子标记作为辅助选择手段通过优异杂交种后代发掘分别适合作父本和母本的种质资源,在不久的将来很有可能对推动中国玉米育种工作发挥越来越重要的作用。根据本试验的研究结果及试验过程中存在的问题,提出的建议有：一是从经济与效率方面考虑,使用分子标记数量不需过多,可选择一些功能标记作为辅助选择依据。GUAN等[20]利用50K高密度芯片选取的192个SNP位点进行分子标记辅助选择与本研究中以均匀分布的97对SSR分子标记进行辅助选择获得了相近似的结果。当然,在标记的选择过程中,选择一些重要育种性状相关标记,对于发掘携带目标性状的种质资源具有重要的意义;二是应注意扩大早代分离群体,提高早代辅助选择材料基数。大群体有利于增加在早期挖掘偏向于母本或父本的极端材料的可能性,同时也有利于选出打破不利基因连锁的个体,获得更好的材料。随着世代增加,变异趋于稳定,可结合表型减少选择材料所占比例;三是应注意分子标记辅助选择与常规育种相结合,从亲缘关系未知玉米杂交种后代中创新优异种质资源,要在早代对选择材料进行常规测交试验,建议在F4代或更早世代,有的放矢地与其他来源和方法获得的创新种质组配测交组合,尽早检测辅助选择材料配合力情况,可以极大地提高育种效率。同时需要指出的是,除了特殊的需要,开展种质资源创新不提倡对某一品种亲本自交系进行“还原”,而是获得属于母本或父本群的新型“二环系”或通过进一步复交、综合应用不同手段获得新型改良系。在选择过程中,多种策略相结合,使得基于杂交种为基础材料进行种质创新所获得选系的配合力特性得以保持,提高种质资源创新效果与利用效率。4 结论
利用分子标记辅助选择策略,建立基于杂交种资源的玉米种质创新方法,可提高杂交种后代选择效率,并且所选材料可保持原有杂种优势属性。利用不同来源的测验种进行早代测交,可快速评估辅助选择材料的育种应用价值,提高基于杂交种资源创新种质的效率。致谢：李平教授在研究过程中给予的指导与帮助,王岩文、付发林、靳长再等负责试验的同志,在材料种植、田间记载、收获后考种给予的有力支持,在此表示感谢。
（责任编辑 李莉）
The authors have declared that no competing interests exist.
