梁伟^,1, 朱亚同¹, 柴秀伟¹, 孔蕊¹, 李斌山¹, 李永才¹, 毕阳^,1, DOV Prusky^1,21甘肃农业大学食品科学与工程学院,中国兰州 730070
²Department of Postharvest Science of Fresh Produce, Agricultural Research Organization, Rishon LeZion 7505101, Israel

p-Coumaric Acid Promoted Wound Healing of Potato Tubers by Accelerating the Deposition of Suberin Poly Phenolic and Lignin at Wound Sites

LIANG Wei^,1, ZHU YaTong¹, CHAI XiuWei¹, KONG Rui¹, LI BinShan¹, LI YongCai¹, BI Yang^,1, DOV Prusky^1,21College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
²Department of Postharvest Science of Fresh Produce, Agricultural Research Organization, Rishon LeZion 7505101, Israel

通讯作者: 毕阳,Tel：13119421362;E-mail： biyang@gsau.edu.cn

责任编辑: 赵伶俐
收稿日期:2020-12-18接受日期:2021-04-25

基金资助:

国家自然科学基金(31772040) 甘肃省马铃薯产业技术体系(GARS-MLS-S)

Received:2020-12-18Accepted:2021-04-25
作者简介 About authors
梁伟,Tel：13709240527;E-mail： liangweigsau@163.com。










摘要
【目的】研究p-香豆酸（p-Coumaric acid,p-CA）处理对马铃薯块茎伤口处聚酚软木脂和木质素积累的影响及相关机理。【方法】用0.5 mmol∙L^-1p-CA浸泡切半‘大西洋’马铃薯块茎10 min,以蒸馏水处理作为对照,于室温条件下避光贮存进行愈伤。测定损伤块茎在愈伤期间的失重率以及损伤接种硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum）块茎的病情指数,观察伤口处聚酚软木脂和木质素的积累,测定伤口处苯丙烷代谢关键酶和过氧化物酶活性,以及苯丙烷代谢产物和H₂O₂含量。【结果】p-CA处理显著降低了损伤块茎的失重率和损伤接种块茎的病情指数,14 d时,处理块茎的失重率和病情指数分别比对照低38.46%和43.18%。p-CA处理加速了块茎伤口处聚酚软木脂和木质素的积累,14 d时,处理块茎的聚酚软木脂和木质素的细胞层厚度分别比对照高26.43%和30.26%。p-CA处理还明显提高了块茎伤口处苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟化酶、4-香豆酰辅酶A连接酶和肉桂醇脱氢酶的活性,7 d时,处理块茎的酶活性分别比对照高32.17%、23.51%、25.09%和23.08%。14 d时,p-CA处理块茎的肉桂酸、p-香豆酸、咖啡酸和总酚含量分别比对照高34.26、38.29%、19.31%和41.04%;21 d时,处理块茎的阿魏酸、芥子酸含量分别比对照高38.33%和20.47%。此外,p-CA处理促进了块茎伤口处肉桂醇、松柏醇、芥子醇和木质素的积累,14 d时,处理块茎的肉桂醇和木质素含量分别高于对照36.93%和31.66%;21 d时,处理块茎的松柏醇和芥子醇含量分别高于对照41.43%和34.05%。p-CA处理还提高了块茎伤口处H₂O₂含量和过氧化物酶活性,7 d时,处理块茎的H₂O₂含量和过氧化物酶活性分别高于对照40.25%和27.01%。【结论】p-CA处理可通过激活苯丙烷代谢,提高H₂O₂含量和过氧化物酶活性,促进马铃薯块茎伤口处聚酚软木脂和木质素的积累,从而加速块茎愈伤。
关键词： p-CA;马铃薯块茎;愈伤;苯丙烷代谢

Abstract
【Objective】This study aimed to investigate the effect and related mechanism of p-CA treatment on the accumulation of suberin polyphenolic and lignin at wound sites of potato tubers. 【Method】The half cut potato tubers ‘cv. Atlantic’ were soaked with 0.5 mmol∙L ^-1p-CA for 10 min (using distilled water treated as control), which were stored at room temperature and protected from light for healing. The weight loss and the disease index of wounded tubers inoculated with Fusarium sulphureum were determined, the deposition of suberin polyphenolic and lignin at wounded sites were observed, and the activity of the key enzymes of phenylpropane metabolism and peroxidase as well as the content of phenylpropane metabolism products and H₂O₂ at wounded sites were measured. 【Result】The weight loss and the disease index of wounded tubers were significantly reduced by p-CA treatment, which were 38.46% and 43.18% lower than those of control on the 14 day of healing, respectively. p-CA treatment accelerated the deposition of suberin polyphenolic and lignin at wound sites of potato tubers, and the thickness of cell layers in treated tubers were 26.43% and 30.26% higher than that under control on the 14 day of healing, respectively. p-CA treatment also significantly increased the activities of phenylalanine ammonia lyase, cinnamic acid-4-hydroxylase, 4-coumaryl coenzyme A ligase and cinnamyl alcohol dehydrogenase at wounde sites of tubers, with the enzyme activities of the treated tubers being 32.17%, 23.51%, 25.09% and 23.08% higher than the control on 7 day, respectively. p-CA treatment also promoted the synthesis of cinnamic acid, p-coumaric acid, caffeic acid, ferulic acid, sinapic acid and total phenolics, with the contents of cinnamic acid, p-coumaric acid, caffeic acid and total phenolics in the treated tubers on 14 day being 34.26%, 38.29%, 19.31% and 41.04% higher than that under control, respectively, and the contents of ferulic acid, sinapic acid in the treated tubers being 38.33% and 20.47% higher than that under control on 21 day, respectively. In addition, p-CA treatment promoted the accumulation of cinnamyl alcohol, coniferyl alcohol, sinapis alcohol and lignin at wound sites, with the contents of cinnamyl alcohol and lignin in the treated tubers being 36.93% and 31.66% higher than that under control on 14 day, respectively, and the contents of coniferyl alcohol and sinapis alcohol in the treated tubers were 41.43% and 34.05% higher than the control on 21 day, respectively. The p-CA treatment also increased the H₂O₂ content and peroxidase activity at the wound sites, with the H₂O₂ content and peroxidase activity of the treated tubers being 40.25% and 27.01% higher than that under control on 7 day, respectively. 【Conclusion】The p-CA treatment accelerated wound healing of potato tubers by activating phenylpropanoid metabolism, increasing H₂O₂ content and peroxidase activity, and promoting the accumulation of suberin polyphenolic and lignin in potato tuber wound sites.
Keywords： p-CA;potato tuber;wound healing;phenylpropanoid metabolism


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本文引用格式
梁伟, 朱亚同, 柴秀伟, 孔蕊, 李斌山, 李永才, 毕阳, DOV Prusky. p-香豆酸通过加速伤口处聚酚软木脂和木质素的沉积促进马铃薯块茎愈伤. 中国农业科学, 2021, 54(20): 4434-4445 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.016
LIANG Wei, ZHU YaTong, CHAI XiuWei, KONG Rui, LI BinShan, LI YongCai, BI Yang, DOV Prusky. p-Coumaric Acid Promoted Wound Healing of Potato Tubers by Accelerating the Deposition of Suberin Poly Phenolic and Lignin at Wound Sites. Scientia Acricultura Sinica, 2021, 54(20): 4434-4445 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.016


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0 引言

【研究意义】愈伤是马铃薯块茎采后的重要特性,通过在伤口表面形成愈伤组织,可有效降低水分蒸腾,阻止外界病原菌的侵染^[1]。然而,块茎在自然条件下愈伤需要较长时间^[2],因此,有必要采取措施加速马铃薯愈伤形成。【前人研究进展】p-香豆酸（p-Coumaric acid,p-CA）是一种在植物中广泛存在的酚类化合物,来源于苯丙烷代谢^[3]。近年来人们发现,p-CA处理能够诱导枣对互隔交链孢（Alternaria alternata）引起的黑斑病^[4]、甜樱桃对灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病^[5]以及菠萝对凤梨镰孢菌（Fusarium ananatum）引起的心腐病的抗性^[6]。进一步研究发现,p-CA诱导抗性的机制与激活苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟化酶和4-香豆酰辅酶A连接酶^[4],促进苯丙烷代谢相关基因CHS、HCT、F5H的表达,以及阿魏酸、香豆酸和芥子酸等酚类物质的合成有关^[7,8]。此外,p-CA还可促进枣果实中H₂O₂的积累^[4],提高枣以及甜樱桃中过氧化物酶的活性和转录水平^[4,5]。【本研究切入点】尽管已有p-CA诱导果实采后抗病性及相关机制的报道,但作为苯丙烷代谢的重要产物,p-CA是否通过激活苯丙烷代谢进而影响马铃薯块茎愈伤尚未见报道。【拟解决的关键问题】本试验通过采用0.5 mmol∙L^-1p-CA处理切半马铃薯块茎,于室温条件下避光贮存进行愈伤,通过测定愈伤期间损伤块茎的失重率和损伤接种块茎的病情指数,观察伤口处聚酚软木脂和木质素的积累,分析块茎伤口处苯丙烷代谢关键酶和过氧化物酶活性,测定苯丙烷代谢产物及H₂O₂含量,评价p-CA对马铃薯块茎愈伤的影响。

1 材料与方法

试验于2019年11月至2020年3月在甘肃农业大学食品科学与工程学院采后生物学与技术实验室进行。

1.1 材料

供试‘大西洋’马铃薯块茎（Solanum tuberosum L. cv. Atlantic）,于2019年10月购自甘肃省定西市爱兰马铃薯种业有限公司。选取外观一致,大小均匀,无可见病害和机械损伤的块茎用网袋包装（每袋15 kg）,于翌日运往冷库中（（4±2）℃、RH 55%—65%）存放待用。

供试硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum Schlect）是甘肃省马铃薯块茎干腐病主要致病菌,由甘肃省农业科学院植物保护研究所提供,在PDA培养基上保存待用。

供试p-CA购自上海麦克林生化科技有限公司（纯度98%）。

1.2 方法

1.2.1 块茎损伤及p-CA处理 块茎损伤参照LULAI等^[9]的方法并作适当修改。马铃薯冲洗干净后浸泡于含1%次氯酸钠的清水中进行消毒。室温下晾干后用不锈钢刀片沿块茎赤道将其切分为两半。将切半后的块茎浸泡于含0.5 mmol∙L^-1p-CA的蒸馏水溶液中10 min（蒸馏水作为对照组）,于室温下再次晾干后,分批次放入打孔的黑色聚乙烯保鲜袋中,于室温（（20±2）℃、RH 65%—75%）避光条件下进行愈伤。

1.2.2 愈伤效果的比较

1.2.2.1 块茎失重率的测定 采用称重法。分别于愈伤的0、3、5、7、14和21 d用天平对块茎称重并计算失重率（%）。

1.2.2.2 损伤接种F. sulphureum块茎病情指数的测定 参照JIANG等^[10]的方法并作适当修改。将F. sulphureum接种到PDA培养基上,28℃下培养7 d后加入含0.01（V/V）tween 80的无菌水10 mL,用玻璃棒搅拌混匀后用灭菌涂布器将孢子刮下并用4层纱布过滤到50 mL锥形瓶中,在振荡器上振荡30 s混匀后用血球计数板调整浓度至1×10⁶ spores/mL。分别于块茎愈伤的0、3、5、7、14和21 d,将20 μL孢子悬浮液先滴加在切半块茎伤口表面中部,然后用灭菌涂布器均匀涂抹,晾干后装入打孔的黑色聚乙烯保鲜袋中,于室温（（20±2）℃、RH 65%—75%）黑暗条件下培养7 d后观察并按下式统计病情指数。每处理用块茎18个,重复3次。

$病情指数(\%)=frac{\sum(各病级伤口个数\times 发病级别)}{总伤口个数\times 最高级发病级别}\times 100$

式中,发病级别的标准为：4级,块茎伤口表面100%发病;3级,块茎伤口表面75%的区域发病;2级,块茎伤口表面50%的区域发病;1级,块茎伤口表面25%的区域发病;0级,块茎伤口表面不发病。

1.2.3 聚酚软木脂及木质素沉积观察 聚酚软木脂（suberin poly phenolic,SPP）在块茎伤口处沉积的观察参照LULAI等^[11]的方法并略作修改。将块茎采用双面刀片（74-S,上海吉列有限公司）垂直伤口表面切出厚度0.2—0.3 mm的薄片。将切片置于载玻片上,滴加蒸馏水并盖上盖玻片在荧光显微镜（BX53,Olympus,Japan）下观察拍照,激发波长340—390 nm,接收波长420 nm。

木质素的沉积观察参照ALBA等^[12]的方法并作适当修改。在垂直伤口表面切出0.2—0.3 mm的薄片,蒸馏水冲洗8遍,置于载玻片上滴加1%（W/V）间苯三酚溶液及浓盐酸染色1 min,在光学显微镜（BX53,Olympus,Japan）下拍照观察。

参照VAN OIRSCHOT等^[13]的方法通过IS Capture测定愈伤期间块茎的SPP和木质素细胞层厚度。

1.2.4 生化取样 参照JIANG等^[10]的方法并作适当修改。分别于愈伤的0、3、5、7、14和21 d时取伤口及伤口下3 mm厚的样品,用液氮速冻并研磨成粉后装入50 mL离心管,保存于-80℃超低温冰箱。

1.2.5 苯丙烷代谢酶活性的测定 苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonia-lyase,PAL）的测定根据KOZUKUE等^[14]的方法并略作修改。称取1.0 g冷冻粉末,于5 mL的0.1 mol∙L^-1硼酸-硼砂冷缓冲液（pH 8.8,4%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone,PVP））、5 mmol∙L^-1β-巯基乙醇和2 mmol∙L^-1乙二胺四乙酸（EDTA）中冰浴匀浆,静置提取30 min后于12 000×g离心30 min（4℃）,上清液即为粗酶液。反应体系包括0.5 mL上清液、3 mL的50 mmol∙L^-1硼酸钠缓冲液（pH 8.8）和0.5 mL的20 mmol∙L^-1苯丙氨酸（蒸馏水作为参照）。将体系混合10 s后迅速测定在290 nm吸光度作为初始值（OD₀）,然后37℃水浴1 h后在290 nm测定吸光度作为终止值（OD₁）。以每小时吸光度变化0.01定义为一个酶活性单位（U）,PAL活性用U∙g^-1 FW表示。

肉桂酸-4-羟化酶（cinnamic acid-4-hydroxylase,C4H）的测定根据LAMB等^[15]的方法并略作修改。称取1.0 g冷冻粉末,于3 mL Tris-HCl缓冲液（pH 8.8,含40 g∙L^-1 PVP）、10 mmol∙L^-1β-巯基乙醇、4 mmol∙L^-1 MgCl₂、5 mmol∙L^-1抗坏血酸、2 μmol∙L^-1 NADPNa₂、10 μmol∙L^-1 Leupeptin（亮抑酶肽）、1 mmol∙L^-1苯甲磺酰氟化物（PMSF）和10%（V/V）的甘油中冰浴匀浆,静置提取30 min后于12 000×g离心30 min（4℃）,上清液即为粗酶液。反应体系为1.0 mL粗酶液、5 mL的50 mmol∙L^-1 Tris-HCl缓冲液,25℃水浴加热30 min,向反应体系中加入100 μL的6 mmol∙L^-1 HCL终止反应,于340 nm测定OD值,以Tris-HCl缓冲液作为对照组。以每分钟吸光值变化0.01定义为一个酶活性单位（U）,C₄H活性以U∙g^-1 FW表示。

4-香豆酰辅酶A连接酶（4-coumaryl coenzyme A ligase,4CL）的测定参照VOO等^[16]的方法并作适当修改。称取1.0 g冷冻粉末,加入3 mL上海源叶生物科技有限公司的提取液,然后于4℃,12 000×g离心30 min（4℃）,上清液即为粗酶液。反应体系：0.45 mL的7.5 μmol∙L^-1 Mg²⁺（硫酸镁或氯化镁）、0.15 mL的50 nmol∙L^-1 p-香豆酸、0.15 mL的2.5 μmol∙L^-1 ATP、0.15 mL的38 nmol∙L^-1 CoA以及0.5 mL粗酶液。40℃下反应10 min后,在333 nm处测定吸光度值。以每分钟吸光值变化0.001定义为一个酶活性单位（U）,4CL活性以U∙g^-1 FW表示。

肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD）的测定参照GOFFNER等^[17]的方法并作适当修改。称取1.0 g冷冻粉末,于3 mL Tris-HCl缓冲液（pH 8.8,含40 g∙L^-1 PVP）、15 mmol∙L^-1β-巯基乙醇、10%偏聚乙二烯和2%（W/V）PEG中冰浴匀浆,静置提取30 min后于12 000×g离心30 min（4℃）,上清液即为粗酶液。反应体系：0.2 mL粗酶液,0.8 mL反应液（含10 mmol∙L^-1烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷（NADP）、5 mmol∙L^-1反式肉桂酸）,37℃水浴30 min,1 mol∙L^-1 HCl终止反应（如有沉淀,离心除去）后在400 nm处测吸光值,以0.2 mL PBS与0.8 mL反应液为对照。以每分钟吸光值变化0.001定义为一个酶活性单位（U）,CAD活性以U∙g^-1 FW表示。

过氧化物酶（peroxidase,POD）的测定参照VENISSE等^[18]的方法并作适当修改。称取1.0 g冷冻粉末,加入3 mL乙酸-乙酸钠缓冲液（含1 mmol∙L^-1 PEG、1% Triton X-100和4% PVPP,pH 5.5）混匀后充分提取,10 000×g条件下离心30 min（4℃）,上清液即为粗酶液。反应体系：500 μL粗酶液、3.0 mL的25 mmol∙L^-1愈创木酚,滴加300 μL的5 mmol∙L^-1 H₂O₂启动反应,记录反应体系2 min内在470 nm处吸光度值的变化。以每分钟吸光值变化1定义为一个酶活性单位（U）,活性以U∙g^-1 FW表示。

1.2.6 愈伤组织中肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸和肉桂醇、松柏醇、芥子醇含量的测定 参照AYAZ等^[19]方法并作适当修改。称取3.0 g冷冻粉末,加入3 mL 70%甲醇在40 Hz常温超声提取30 min,8 000×g离心20 min（4℃）,上清液经浓缩仪浓缩后,用复溶液（甲醇﹕水﹕冰醋酸=70﹕30﹕1）溶至1 mL,过0.22 μm微孔滤膜（BS-QT-013型,Biosharp,USA）,将滤液转移至2 mL自动进样瓶中。采用Waters Symmetry^® C18（4.6 mm×250 mm,5 μm）柱进行四元梯度超快速液相色谱仪（ACQUITY Arc,Waters,USA）分析。HPLC条件：以100%甲醇（A）和1%乙酸（B）为流动相。梯度洗脱程序为0—10 min：30% A、70% B;10—12 min：45% A、55% B;12—15 min：65% A、35% B;15—18 min：30% A、70% B;18—20 min：30% A、70% B;18—20 min：30% A、70% B。流速0.8 mL∙min^-1,进样量10 μL。芥子酸和咖啡酸在325 nm处检测,阿魏酸在322 nm处检测,对香豆酸在310 nm处检测,肉桂酸在276 nm处检测,松柏醇在263 nm处检测,肉桂醇在273 nm处检测,芥子醇在322 nm处检测。通过对比标准化合物的保留时间来对其进行定量测定。以标准曲线计算样品中各个酚酸的浓度,酚酸含量以μg∙g^-1 FW表示。

1.2.7 总酚和木质素含量的测定 总酚含量测定参照SCALBERT等^[20]的方法并略作修改。称取冷冻粉末1.0 g于3 mL 0.5 %乙酸和70%丙酮混匀提取30 min,将混合液于4℃黑暗环境下放置24 h,8 000×g离心30 min（4℃）,收集上清液用于总酚和类黄酮的测定。测定体系：1 mL上清液、2 mL福林酚（1﹕10稀释）,2 mL7.5 %（W/V）Na₂CO₃,50℃静置5 min,以甲醇作为参比空白,760 nm处测定吸光度。制定没食子酸（gallate,GAE）标准曲线评估总酚含量,总酚含量以GAE mg/100 g FW表示。

木质素含量测定参照MORRISSON^[21]的方法并略作修改。称取1.0 g冷冻粉末,加入3 mL预冷的95%的乙醇后离心,取沉淀物依次用95%乙醇﹕正己烷=1﹕2（V/V）冲洗3次后置于烘箱中干燥。待沉淀充分干燥后取出,加入1 mL溴化乙酰冰醋酸（1﹕3（V/V））溶液并将反应体系水浴30 min（70℃）,接着加入1 mL 2 mmol∙L^-1 NaOH终止反应。然后分别依次加入2 mL冰醋酸和0.1 mL的7.5 mmol∙L^-1羟胺盐酸后离心取上清液0.5 mL,冰醋酸定容至5 mL,280 nm下测定OD值。木质素含量以OD₂₈₀∙g^-1 FW为单位。

1.2.8 H₂O₂含量的测定 H₂O₂含量的测定参考PROCHAZKOVA等^[22]的方法并略作修改。称取1.0 g冷冻粉末,加入丙酮后提取10 min,10 000×g离心30 min（4℃）,取上清液用于含量测定。反应体系：1 mL上清液、100 μL 20% TiCL₄、100 μL浓氨水,混合液反应10 min后,离心10 min,取沉淀用丙酮洗涤3次,加2.0 mL浓硫酸（1 mmol∙L^-1）进行溶解,410 nm测定OD值,通过标准曲线计算H₂O₂含量,H₂O₂含量用μmol∙g^-1 FW表示。

1.3 数据统计

以上数据采用Excel 2016计算平均值和标准误（±SE）,采用SPSS 24.0进行Duncan’s显著性分析（P<0.05）。

2 结果

2.1 p-CA处理对愈伤期间损伤块茎失重率和损伤接种块茎病情指数的影响

失重率和病情指数是衡量块茎愈伤效果的重要参照。p-CA处理和对照块茎的失重率在愈伤期间均呈上升趋势,但处理块茎的失重率在愈伤期间始终低于对照,14 d时比对照低38.46%（P<0.05）（图1-A）。随着愈伤层的形成,处理和对照块茎的病情指数均逐渐下降,但处理块茎的病情指数在愈伤中后期始终低于对照,14 d时比对照低43.18%（P<0.05）（图1-B）。上述结果表明,p-CA处理有效降低了块茎的水分蒸腾和病情指数。

图1

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图1p-CA处理对愈伤期间损伤块茎失重率（A）和损伤接种块茎病情指数（B）的影响

*代表显著差异（P<0.05）。下同
Fig. 1Effects of p-CA treatment on weight loss rate (A) of wounded tubers and disease index (B) of inoculated tubers during healing

* indicate significant difference (P<0.05). The same as below

2.2 p-CA处理对愈伤期间损伤块茎愈伤组织处SPP和木质素沉积的影响

SPP和木质素是块茎伤口处愈伤组织的重要成分。愈伤期间,p-CA处理和对照块茎愈伤组织处的SPP沉积速度和积累量均逐渐增加,处理与对照的积累差异出现在愈伤3 d时,之后处理块茎的沉积速度和积累量始终高于对照（图2-A）。同样,处理和对照块茎的SPP细胞层厚度随愈伤时间的延长不断增加,处理块茎的细胞层厚度在愈伤中后期始终高于对照,14 d时比对照高26.43%（P<0.05）（图2-C）。愈伤期间,处理和对照的木质素沉积速度和积累量均逐渐增加,处理与对照的积累差异出现在愈伤3 d时,之后处理块茎的沉积速度和积累量均高于对照（图2-B）。同样,处理和对照的木质素细胞层厚度随愈伤时间的延长不断增加,处理的细胞层厚度在愈伤中后期始终高于对照,14 d时比对照高30.26%（P<0.05）（图2-D）。以上结果表明,p-CA处理促进了块茎伤口处SPP和木质素的沉积。

图2

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图2p-CA处理对马铃薯块茎伤口处SPP和木质素积累（A,B）以及细胞层厚度（C,D）的影响

Fig. 2Effects of p-CA treatment on the accumulation (A, B) of SPP and lignin and the thickness (C, D) of cell layers at wounded sites of tubers during healing

2.3 p-CA处理对愈伤期间块茎伤口处苯丙烷代谢关键酶活性的影响

块茎伤口处苯丙烷代谢关键酶的活性决定酚类物质的合成水平。愈伤期间,p-CA处理和对照块茎伤口处的PAL活性均呈单峰型变化,分别在14和5 d时达到峰值,处理块茎的活性在愈伤中后期始终高于对照,14 d时高出对照45.73%（P<0.05）（图3-A）。处理和对照块茎的C4H和CAD活性均随愈伤时间的延长而逐渐上升,处理块茎的活性始终高于对照,14 d时分别比对照高33.36%和17.36%（P< 0.05）（图3-B、D）。愈伤期间,处理和对照块茎的4CL活性在愈伤前期迅速上升,5 d时达到峰值,随后趋于平稳,处理组始终高于对照,5 d时比对照高28.43%（P<0.05）（图3-C）。上述结果表明,p-CA处理激活了块茎伤口处的PAL、C4H、4CL和CAD。

图3

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图3p-CA处理对马铃薯伤口处PAL（A）、C4H（B）、4CL（C）、CAD（D）活性的影响

Fig. 3Effects of p-CA treatment on the activity of PAL (A), C4H (B), 4CL (C) and CAD (D) at wounded sites of tubers during healing

2.4 p-CA处理对愈伤期间块茎伤口处5种酚酸和总酚含量的影响

肉桂酸、p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸是苯丙烷代谢的产物,也是构成聚酚软木脂的重要单体。愈伤期间,p-CA处理和对照块茎伤口处的肉桂酸含量不断增加,处理在愈伤后期（14—21 d）均显著高于对照,14 d时比对照高34.26%（P<0.05）（图4-A）。处理和对照块茎的p-香豆酸和咖啡酸含量均随着愈伤时间的延长不断增加,处理在愈伤中后期显著高于对照,14 d时分别比对照高38.29%和19.31%（P<0.05）（图4-B、C）。处理和对照块茎的阿魏酸和芥子酸含量均随愈伤时间的延长不断提高,处理显著高于对照,21 d时分别比对照高38.33%和20.47%（P<0.05）（图4-D、E）。处理和对照块茎的总酚含量均随愈伤时间的延长先上升后趋于平稳,除第3天外,处理始终高于对照,14 d时比对照高41.04%（P<0.05）（图4-F）。以上结果表明,p-CA处理促进了块茎伤口处肉桂酸、p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸以及总酚的合成。

图4

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图4p-CA处理对马铃薯伤口处肉桂酸（A）、p-香豆酸（B）、咖啡酸（C）、阿魏酸（D）、芥子酸（E）和总酚（F）含量的影响

Fig. 4Effects of p-CA treatment on the content of cinnamic acid (A), p-coumaric acid (B), caffeic acid (C), ferulic acid (D), sinapic acid (E) and total phenolic (F) at wounded sites of tubers during healing

2.5 p-CA处理对愈伤期间块茎伤口处3种木质素单体和木质素含量的影响

肉桂醇、松柏醇和芥子醇是构成木质素的3种单体。p-CA处理和对照块茎伤口处的肉桂醇含量不断增加,处理在愈伤中后期显著高于对照,14 d时比对照高36.93%（P<0.05）（图5-A）。愈伤期间,处理和对照块茎的松柏醇以及芥子醇的含量均不断增加,在愈伤中后期,处理组的含量均高于对照,21 d时处理分别比对照高41.43%和34.05%（P<0.05）（图5-B、C）。愈伤期间,处理和对照块茎的木质素含量不断增加,处理块茎的木质素含量在愈伤的中后期显著高于对照,14 d时比对照高31.66%（P<0.05）（图5-D）。表明p-CA处理促进了块茎伤口处肉桂醇、松柏醇、芥子醇以及木质素的合成。

图5

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图5p-CA处理对马铃薯伤口处肉桂醇（A）、松柏醇（B）、芥子醇（C）和木质素（D）含量的影响

Fig. 5Effects of p-CA treatment on the content of cinnamyl alcohol (A), coniferyl alcohol (B), sinapis alcohol (C) and lignin (D) at wounded sites of tubers during healing

2.6 p-CA处理对愈伤期间块茎伤口处H₂O₂含量和POD活性的影响

H₂O₂和POD是参与块茎伤口处酚类底物氧化交联的重要成分。p-CA处理和对照块茎伤口处的H₂O₂含量均逐渐增加,愈伤中后期,处理组显著高于对照,7 d时比对照高40.25%（P<0.05）（图6-A）。愈伤期间,处理和对照块茎的POD活性均呈上升趋势,处理组在愈伤中后期显著高于对照,21 d时比对照高50.13%（P<0.05）（图6-B）。上述结果表明,p-CA处理促进了马铃薯块茎伤口处H₂O₂的积累,激活了POD活性。

图6

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图6p-CA处理对马铃薯伤口处H₂O₂含量（A）和POD活性（B）的影响

Fig. 6Effects of p-CA treatment on H₂O₂ content (A) and POD activity (B) at wounded sites of tubers during healing

3 讨论

本研究观察到,p-CA处理可有效降低马铃薯损伤块茎愈伤期间的失重率（图1-A）,失重率降低的原因可能是因为p-CA激活了苯丙烷代谢,促进了酚类物质的积累^[7],而酚类物质又是SPP和木质素合成的底物,由于伤口处SPP和木质素的聚合从而有效抑制了水分经由伤口的蒸腾^[9]。p-CA还可促进茉莉酸的合成^[8],茉莉酸作为重要的植物激素可诱导气孔关闭,从而减少水分经由气孔的蒸腾^[23]。此外,p-CA还具有抑制果实呼吸速率的作用,通过降低呼吸强度从而减少底物的消耗^[24]。本研究还观察到p-CA处理有效降低了F. sulphureum损伤接种马铃薯块茎的病情指数,由于p-CA可促进块茎伤口处SPP和木质素的聚合,由此产生的物理屏障可有效抑制病原菌的侵染和扩展^[25]。p-CA还可激活苯丙烷代谢,生成的酚酸和黄酮等物质可直接抑制真菌孢子萌发和菌丝生长^[26]。此外,p-CA还可促进病程相关蛋白的积累,从而破坏病原真菌的细胞结构^[4]。

苯丙烷代谢既为SPP和木质素聚合提供所需底物,也可产生具有抗菌活性的酚类物质^[27]。PAL作为苯丙烷代谢的关键酶和限速酶,催化L-苯丙氨酸脱氨基生成反式肉桂酸^[28],反式肉桂酸在C4H作用下羟基化生成p-香豆酸,p-香豆酸在香豆酸-3-羟基化酶作用下经过羟基化和酯化生成咖啡酸,咖啡酸经儿茶酚氧位甲基转移酶生成阿魏酸,阿魏酸首先羟化生成5-羟基阿魏酸,接着在5-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶作用下催化生成芥子酸,而上述酚酸是SPP合成的重要单体^[29,30]。然后,生成的这些酚酸在4CL的催化下分别生成肉桂酸-CoA、香豆酸-CoA、咖啡酸-CoA、阿魏酸-CoA和芥子酸-CoA,这些酚酸-CoA在CCR 的催化下分别形成芥子醛、松柏醛和香豆醛,又经CAD作用转化形成肉桂醇、松柏醇、芥子醇等木质素合成的底物,然后在POD和漆酶催化下分别形成对-羟基苯基木质素、愈创木基木质素和紫丁香基木质素^[31,32]。本研究观察到,p-CA处理激活了PAL、C4H、4CL和CAD（图3）,促进了肉桂酸、p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸和总酚（图4）以及肉桂醇、松柏醇、芥子醇和木质素（图5）的合成。该结果与p-CA处理提高枣和油菜苯丙烷代谢关键酶活性以及促进苯丙烷代谢产物合成的结果类似^[4,8]。有研究表明,p-CA可促进油菜中茉莉酸的合成,而茉莉酸作为重要的信号分子可激活苯丙烷代谢并促进酚类物质合成^[8]。p-CA还可通过上调油菜中R2R3 MYB转录因子PAP1的表达来调控苯丙烷代谢并促进酚类、类黄酮和花青素等的合成^[8,33]。因此,推测p-CA可能通过调控茉莉酸等植物激素合成,以及上调MYB等转录因子的表达来激活苯丙烷代谢。至于p-CA如何调控马铃薯块茎愈伤期间激素合成以及转录因子表达有待进一步揭示。

SPP和木质素是块茎伤口处愈伤组织的主要成分^[27]。SPP主要由羟基肉桂酸及其衍生物阿魏酸通过酯键和醚键连接形成,具有降低水分蒸腾,抑制病原菌侵染的功能^[9]。木质素主要由肉桂醇、松柏醇和芥子醇聚合形成,具有强化细胞壁,增加机械强度,维持植物细胞壁结构完整性,形成物理屏障抑制病原菌的侵染和扩展的功能^[34]。H₂O₂和POD在SPP和木质素单体氧化交联中具有重要作用^[35]。本研究观察到,p-CA处理显著提高了块茎伤口处H₂O₂含量,该结果与p-CA处理提高枣果实H₂O₂含量的结果类似^[4]。H₂O₂在马铃薯块茎愈伤中具有双重作用,不仅可作为信号分子促进块茎愈伤的防卫应答,又可以参与酚单体与芳香结构域的氧化交联^[10,36]。马铃薯愈伤期间的H₂O₂主要来源于NADPH氧化酶（NADPH oxidase,NOX）,NOX通过给分子氧转移电子产生超氧阴离子,后者由于存活寿命很短,很快在超氧化物歧化酶（SOD）的作用下被歧化为H₂O₂^[27]。研究表明,p-CA可上调枣果实中的Cu/Zn SOD表达,促进H₂O₂积累^[4]。因此,推测p-CA可能在转录水平上通过提高SOD活性从而促进H₂O₂的积累。同时,本研究还观察到,p-CA处理显著提高了块茎伤口处的POD活性,该结果与p-CA处理提高甜樱桃POD活性的结果类似^[5]。p-CA处理还可促进枣果实POD12表达,导致POD活性升高^[4]。因此,推测p-CA可能在转录水平上通过上调POD相关基因表达从而提高POD活性,至于p-CA如何在转录水平上实现对马铃薯块茎愈伤期间POD的调控则有待进一步研究。

4 结论

愈伤期间,p-CA处理激活了马铃薯块茎伤口处苯丙烷代谢关键酶PAL、C4H、4CL和CAD活性,促进了伤口处肉桂酸、p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸和总酚以及肉桂醇、松柏醇、芥子醇和木质素的积累。p-CA处理还提高了块茎伤口处H₂O₂含量和POD活性,H₂O₂和POD通过氧化交联酚酸和木质素单体促进了SPP和木质素在伤口处的沉积,从而有效降低了愈伤期间损伤块茎的失重率和损伤接种F. sulphureum块茎的病情指数,促进了马铃薯的块茎愈伤。

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