魏亚楠^,1, 彭慧¹, 杨乾¹, 郑晓渊¹, 唐中祺², 朱艳¹, 颉建明², 毕阳^,1,21甘肃农业大学食品科学与工程学院,兰州 730070
²甘肃农业大学园艺学院,兰州 730070

Effects of Dark and Light Treatments on Wound Healing of Potato Tubers

WEI YaNan^,1, PENG Hui¹, YANG Qian¹, ZHENG XiaoYuan¹, TANG ZhongQi², ZHU Yan¹, XIE JianMing², BI Yang^,1,21College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070
²College of Horticulture, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070

通讯作者: 毕阳,Tel：0931-7631113;E-mail：bIyang@gsau.edu.cn

责任编辑: 赵伶俐
收稿日期:2020-08-18接受日期:2020-11-30网络出版日期:2021-06-16

基金资助:

国家自然科学基金.31760473

Received:2020-08-18Accepted:2020-11-30Online:2021-06-16
作者简介 About authors
魏亚楠,Tel：18894312480;E-mail：18894312480@163.com。










摘要
【目的】愈伤是马铃薯块茎受损后的典型反应,受外界环境因素影响较大。比较黑暗和光照处理对马铃薯块茎愈伤效果的影响,为马铃薯采后愈伤提供理论支持。【方法】本研究选取‘大西洋’马铃薯原原种为试材,人工切半后用酒精对伤口表面消毒,之后分别在黑暗和光照（11 000 lx）条件下进行（20±3）℃常温（（95±5）% RH）愈伤。通过测定愈伤期间损伤块茎的失重率及损伤接种Fusarium sulphureum 7 d后块茎的病情指数来评价愈伤效果,观察伤口处聚酚软木脂（SPP）、聚酯软木脂（SPA）和木质素的积累量以及伤口表面的色度变化,分析伤口处苯丙烷代谢关键酶活性和相关代谢产物含量的变化。此外,研究光照和黑暗对伤口处过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性,以及对过氧化氢（H₂O₂）含量积累的影响。【结果】愈伤期间,黑暗和光照处理的块茎失重率均逐渐升高。黑暗处理显著低于光照处理,愈伤第7天时,分别比光照处理低54.27％和58.96％。愈伤期间,黑暗和光照处理块茎伤口处的SPP和SPA积累量均逐渐增加,黑暗处理促进了软木脂和木质素在块茎伤口处的积累,愈伤第14天时,聚酚软木脂、聚酯软木脂和木质化细胞层厚度分别比光照处理高38.22%、36.76%和14.71%。愈伤期间,黑暗和光照处理块茎伤口表面的L^*值和b^*值均表现为先下降后上升的趋势。黑暗处理显著降低了伤口表面的L^*和a^*值,增加了b^*值,L^*和a^*值在愈伤第5天时分别低于光照处理13.51%、32.74%。b^*值在愈伤第5天时高于光照处理42.11%。愈伤期间,黑暗处理块茎伤口处的苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性迅速上升,而光照处理的上升缓慢,两种处理块茎伤口处的肉桂酸-4-羟化酶（C4H）活性先上升后趋于平稳,两种处理块茎伤口处的4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）活性先迅速上升后持续下降。黑暗处理块茎伤口处的苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟化酶、4-香豆酸CoA连接酶的活性显著高于光照处理,愈伤第7天时,分别比光照处理高79.56%、10.71%和72.48%。黑暗和光照处理块茎伤口处的H₂O₂含量在愈伤第一周均迅速上升,之后趋于平稳。两种处理块茎伤口处的POD活性在愈伤期间均显著上升。黑暗处理块茎伤口处具有较高的过氧化物酶活性和H₂O₂含量,第5天时分别高于光照处理49.8%和49.85%。此外,黑暗处理还提高了伤口处组织的多酚氧化酶活性,在愈伤第3天时显著高于光照处理12.93%（P＜0.05）。【结论】黑暗对马铃薯块茎愈伤具有促进作用,而光照则对块茎愈伤具有一定程度的抑制。黑暗对愈伤的促进作用与激活块茎伤口处的苯丙烷代谢,加速伤口部位多酚氧化酶和过氧化物酶活性以促进软木脂和木质素的积累密切相关。
关键词： 黑暗和光照;马铃薯块茎;愈伤;苯丙烷代谢

Abstract
【Objective】 Wound healing is a typical reaction in damaged tuber tissue of potato, which is greatly affected by external environmental factors. The effects of dark and light treatments on the wound healing of potato tubers were compared to explore its partial mechanisms. 【Method】In this study, the "Atlantic" potato seeds were selected as the test material. After being cut in half and disinfected, the tubers were healed under light (11 000 lx) and dark at ambient condition ((20±3)℃, RH (95±5)%). The determination was conducted on the basis of weight loss and disease index of tubers after inoculated with Fusarium sulphureum on 7 d during healing to evaluate the efficacy of the wound healing. The accumulation of suberin and lignin, and the chroma at wound sites of the tubers were observed. The activity of the key enzymes of phenylpropanoid metabolism and the activities of peroxidase, polyphenol oxidase and hydrogen peroxide were analyzed in order to explore the partial mechanism of light and dark at the wounded sites of potato tubers. 【Result】During healing, the weight loss of tubers under dark and light was increased gradually. Dark treatment significantly decreased the weight loss of wounded tubers and disease index of inoculated tubers, which were 54.3% and 59.0% lower than that under light after 7 d of healing, respectively. Accumulation of suberin poly phenolic, suberin poly aliphatic and lignin of tubers under dark and light were increased gradually during healing. The dark treatment comparatively improved the accumulation of suberin poly phenolic, suberin poly aliphatic and lignin at the wounded sites of potato tubers. The thickness of suberin poly phenolic, suberin poly aliphatic and lignified cell layers was increased by 38.2 %, 36.8 % and 14.7 % respectively than that under light treatment after 14 d of healing. During healing, L* and b* values of wounded tuber surface under dark and light was decreased first and then increased. The dark treatment reduced the L* and a* and elevated the b* value of the wound surface of tubers. The L* and a* values were lower than that of light by 13.51% and 32.74% on the 5th day of wound healing, respectively. The b* value was 42.11% higher than that of light on day 5 of wound healing. During healing, PAL activity at the wounded sites of tubers in dark treatment increased rapidly, while in light treatment increased slowly, C4H activity at the wounded sites of tubers under both treatments first increased and then stabilized, and 4CL activity in two treatments first increased rapidly and then decreased continuously at the wounded sites. The dark treatment significantly increased the activity of phenylalanine ammonia-lyase, cinnamic acid-4-hydroxylase and 4-coumaryl coenzyme A ligase at the wounded site of tubers, which were 79.6%, 10.7% and 72.5% higher respectively than the ones under light treatment after 7 d of healing. Moreover, the content of H₂O₂ in tuber wound under dark and light increased rapidly in the first week at the wounded sites of tubers and then flatten out. The peroxidase activity and hydrogen peroxide content at the wounded sites of tubers under dark were 49.8% and 49.9% higher than that under the light treatment after 5 d of healing, respectively. In addition, polyphenol oxidase activity was increased obviously at wound sites of tubers treated with dark on the 3rd of healing, which was 12.93% higher than that of light.【Conclusion】Dark improved the wound healing of potato tubers, while the light showed a certain extent inhibition. The improvement mechanism of the dark on wound healing involved in eliciting phenylpropanoid metabolism and the acceleration of polyphenol oxidase and peroxidase activities to promote the accumulation of suberin and lignin at wounded sites of tubers.
Keywords：dark and light;potato tubers;wound healing;phenylpropanoid metabolism


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魏亚楠, 彭慧, 杨乾, 郑晓渊, 唐中祺, 朱艳, 颉建明, 毕阳. 黑暗和光照处理对马铃薯块茎愈伤效果影响的比较[J]. 中国农业科学, 2021, 54(12): 2619-2629 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.12.012
WEI YaNan, PENG Hui, YANG Qian, ZHENG XiaoYuan, TANG ZhongQi, ZHU Yan, XIE JianMing, BI Yang. Effects of Dark and Light Treatments on Wound Healing of Potato Tubers[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2021, 54(12): 2619-2629 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.12.012


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0 引言

【研究意义】愈伤是马铃薯块茎的重要采后特性,通过在块茎伤口处形成愈伤组织可有效抑制水分蒸腾,削弱病原物对块茎的侵染能力^[1]。【前人研究进展】马铃薯块茎的愈伤受温度、湿度等环境因素的影响^[2]。早期人们就观察到,光照会抑制块茎伤口处软木脂的积累,对愈伤不利^[3]。也有研究发现,UV-C照射可促进马铃薯块茎的愈伤,从而有效降低损伤块茎的水分蒸腾^[4]。由于苯丙烷代谢可为马铃薯愈伤提供所需的酚类物质单体^[5],该代谢的诸多关键酶基因表达受转录因子MYB的调控,而光照是调控MYB的最重要环境因素^[6]。由此表明,光照可通过调控苯丙烷代谢来影响马铃薯的块茎愈伤。有研究表明,黑暗会提高鲜切芹菜中多酚氧化酶和过氧化物酶的活性,促进贮藏期间可溶性醌的积累^[7]。还有研究发现,黑暗会提高日本牵牛花CDPK1的表达^[8],促进活性氧的产生。此外,脂肪酸代谢可为马铃薯愈伤组织中聚脂软木脂的形成提供所需的羟基脂肪酸单体^[9]。光照会提高马铃薯块茎的棕榈酸和硬脂酸含量,降低亚麻酸和油酸含量^[10]。由此表明,光照还可通过调控脂肪酸代谢来影响马铃薯的块茎愈伤。【本研究切入点】尽管已有光照抑制马铃薯愈伤的早期现象观察,但缺乏系统的生理生化和细胞学证据。至于黑暗是否影响马铃薯愈伤封闭层的形成尚未见报道。【拟解决的关键问题】本研究以世界范围内广泛栽培且愈伤能力较强的‘大西洋’马铃薯原原种为试材,块茎切半后分别置于人工光照和黑暗条件下,通过测定愈伤期间损伤块茎的失重率和损伤接种块茎的病情指数,观察伤口处组织表面的色度以及软木脂和木质素的积累,分析伤口处苯丙烷代谢关键酶和过氧化物酶活性以及H₂O₂含量,以比较黑暗和光照对马铃薯块茎愈伤效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

供试‘大西洋’马铃薯原原种（Solanum tuberosum L. cv. Atlantic）于2018年7月购自甘肃省定西市甘肃爱兰马铃薯种业有限责任公司。挑选大小均一、无损伤、无虫害的块茎装入网眼袋中（25 kg/袋）,当天运至甘肃农业大学食品科学与工程学院在4℃冷库中贮藏（（95±5）% RH）待用。

供试马铃薯干腐病病原菌硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum Schltdl.）由甘肃省农业科学院植物保护研究所提供,在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar,PDA）培养基上保存待用。

1.1.2 试剂 肉桂酸-4-羟化酶和过氧化氢测试盒为苏州科铭生物技术有限公司产品;4-香豆酰辅酶A连接酶提取液为上海源叶生物科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器和设备 紫外可见分光光度计（UV- 2450,岛津公司,日本）,立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-30KBS,上海申安医疗器械厂,中国）,高速冷冻离心机（H-1850R,长沙湘仪离心机有限公司,中国）,荧光显微镜（BX51,奥林巴斯有限公司,日本）,酶标仪（1510,赛默飞世尔仪器有限公司,美国）,电热恒温水浴锅（HH-2,江苏省金坛市荣华仪器制造公司,中国）;超低温冰箱（DW-HL218,美菱低温科技有限公司,中国）;超净工作台（S.SW- CJ-IFD,上海医疗器械有限公司,中国）;自动全雪花制冰机（IMS-40,常熟市学科电器有限公司,中国）;旋涡混合器（XH-B,江苏健康医疗用品有限公司,中国）;分光光度仪(Ci6x,日本爱色丽有限公司,日本);研磨机（A 11 basic S025,IKA艾卡（广州）仪器设备有限公司,中国）;照度计（TES-1334A,泰仕电子工业股份有限公司,中国）。

1.2 方法

1.2.1 块茎人工损伤及愈伤

参照YIN等^[11]的方法。块茎用自来水清洗干净后在1% NaClO消毒5 min,然后用无菌蒸馏水洗涤3次,晾干后用无菌不锈钢刀沿中部将块茎切成两半。用无菌蒸馏水冲洗切面,然后用75%的乙醇擦拭消毒,并灼烧多余酒精。随后,将块茎放在无菌滤纸上并喷洒无菌水以保持水分,在人工光照气候室（照明灯管为T5支架LED植物灯,长60 cm,单层功率120 W）中常温（（20±3）℃,（95±5）% RH）愈伤。光照处理的块茎切面面向灯管,光照强度为11 000 lx;黑暗处理块茎切面向上,架内关闭光源,用遮光布进行遮光。每处理用切半的块茎200个,重复3次。

1.2.2 愈伤效果的评价

1.2.2.1 失重率和病情指数的测定 失重率的测定采用重量法^[12]。在愈伤的第0、3、5、7和14天（‘大西洋’马铃薯在第14天时伤口表面的愈伤组织已经完全形成）,从人工气候室中取出黑暗和光照处理的块茎称重,计算失重率（%）。每处理用切半块茎8个,重复3次。

病情指数的测定参照李雪等^[13]方法并修改。先配制1×10⁶个孢子/mL的F. sulphureum孢子悬浮液。在愈伤的第0、3、5、7和14天从人工气候室中分别取出黑暗和光照处理的块茎,在伤口表面均匀涂抹30 μL上述孢子悬浮液,待晾干后装入打孔聚乙烯保鲜袋（40 mm×30 mm,厚度0.02 mm）中。黑暗下常温培养7 d后按下式统计病情指数。每处理用切半块茎8个,重复3次。

$\text{ }\!\!%\!\!\text{ }=\frac{\sum{\left( \times \right)}}{\times }\times 100$

其中发病级别的标准：4级为伤口表面全部发病,3级为伤口表面3/4伤口发病;2级为伤口表面1/2发病;1级为伤口表面1/4发病;0级为伤口表面不发病。

1.2.2.2 观察聚酚软木脂、聚脂软木脂和木质素在伤口处的沉积 聚酚软木脂（suberin poly phenolic,SPP）和聚脂软木脂（suberin poly aliphatic,SPA）的沉积观察参照LULAI等^[14]的方法并修改。用手术刀在垂直于块茎伤口表面处切下0.1 mm的切片,放入盛有无菌蒸馏水的离心管中。SPP染色：使用0.1%的小檗碱对切片染色40 min,随后用无菌水冲洗3次,再分别用75%的乙醇溶液和无菌水冲洗3次,切片随后用0.25%甲苯胺蓝染液（由pH 4.4乙酸钠缓冲液配制）染色1.5 min,再分别使用无菌蒸馏水、75%乙醇、无菌蒸馏水冲洗。SPA染色：步骤同SPP,染液分别为0.05%的甲苯胺蓝和1%中性红染液。切片经染色后在荧光显微镜下（激发波长470—495 nm,发射波长510—550 nm）观察拍照。

木质素的沉积观察参照ALBA等^[15]的方法。将黑暗和光照处理下的块茎用手术刀垂直于伤口表面切出0.2——0.3 mm厚的薄片,在蒸馏水中浸泡和冲洗3次除去淀粉颗粒后,用1%间苯三酚-浓盐酸溶液染色2 min,在光学显微镜下观察拍照。

伤口处SPP、SPA和木质化细胞层的厚度根据VAN OIRSCHOT等^[16]的方法,通过IS Capture图像软件进行测量计算。

1.2.3 愈伤组织色度的测定 分别在损伤后的第0、3、5、7和14天将处理块茎从人工光照气候室中取出,将分光光度仪的目标视窗垂直于伤口组织表面测定L*、a*和b*值。每个处理用切半块茎8个,重复3次。

1.2.4 生化测定取样 参照JIANG等^[17]的方法。用手术刀在垂直于块茎伤口表面取伤口表面及垂直下方2 mm处组织,经液氮冷冻后研磨成粉,装入离心管中置于-80℃的低温冰箱中储存待用。

1.2.5 酶活性的测定 参照MARTINEZ-TELLEZ等^[18]方法测定苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase,PAL）活性。称取3.0 g冷冻粉末,加入3 mL 0.1 N的硼酸缓冲液（pH 8.8,内含10% PVPP,1 mmol·L^-1 EDTA和50 mmol·L^-1β-巯基乙醇）,冰浴研磨后于4℃、10 000×g离心25 min,取上清液用于酶活性测定。反应体系：2 mL 7 mmol·L^-1底物混合液（L-苯丙氨酸用硼酸缓冲液配置）,200 μL粗酶液,30℃下反应30 min,加入200 μL 6 mol·L^-1 HCl终止反应,在290 nm处测定吸光度值。以每分钟变化0.01为1个酶活性单位（U）。酶活性用U·g^-1 FW表示,FW表示样品鲜重。

采用试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）方法测定肉桂酸-4-羟化酶（cinnamic acid-4-hydroxylase,C4H）的活性。称取冷冻粉末0.2 g,加入2 mL提取液冰浴匀浆。按照说明书操作,在340 nm处测吸光度值。酶活性用nmol·min^-1·g^-1 FW表示。

参照SCHOCH等^[19]方法测定4-香豆酰辅酶A连接酶（4-coumaryl coenzyme A ligase,4CL）活性。称取3.0 g冷冻粉末,加入3 mL上海源叶生物科技有限公司的提取液,然后于4℃,15 000×g条件下离心20 min,上清液即为粗酶液。反应体系：0.45 mL 15 μmol·L^-1 Mg²⁺（硫酸镁或氯化镁）,0.15 mL 5 μmol·mL^-1 p-香豆酸,0.15 mL 50 μmol·mL^-1 ATP,0.15 mL 1 μmol·mL^-1 CoA以及0.5 mL酶液。40℃下反应10 min,立即在333 nm处测定吸光度值。以每分钟内变化0.01为1个活性单位（U）,酶活性用U·g^-1 FW表示。

参照YUAN等^[20]的方法测定过氧化物酶（peroxidase,POD）的活性。称取3.0 g冷冻粉末,于5 mL乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.5,含1 mmol·L^-1 PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）中冰浴研磨成浆,在4℃、12 000×g条件下离心30 min,上清液即为粗酶液。反应体系：0.03 mL粗酶液,3 mL 25 mmol·L^-1愈创木酚,0.2 mL 5 mmol·L^-1 H₂O₂。反应15 s时于470 nm处测定吸光值2 min。酶活性用mmol·kg^-1 FW表示。

多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）的测定参照YUAN等^[20]的方法。取冷冻样品3 g,于5 mL乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.5,含1 mmol·L^-1 PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）中冰浴研磨成浆,在4℃、12 000×g条件下离心30 min,收集上层酶液即为粗酶液。反应体系：4 mL 50 mmol·L^-1的乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.5）,1 mL 50 mmol·L^-1邻苯二酚溶液,0.1 mL酶提取液。以蒸馏水为参比,在反应进行到15 s时测定混合液在420 nm波长处的吸光值2 min。酶活性以OD₄₂₀·min^-1·g^-1表示。

1.2.6 H₂O₂含量的测定 采用试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）的方法测定。取冷冻粉末0.5 g,加入5 mL试剂1使其匀浆,按照说明书操作,最后在415 nm处测定吸光值,用mmol·g^-1 FW表示H₂O₂含量。

1.2.7 数据统计与分析 上述各项测定至少重复3次。所有数据使用Excel 2016计算平均值和标准误差（±SE）,用SPSS 19.0（SPSS Inc.,USA）进行Duncan’s差异显著性（P＜0.05）分析,采用Excel 2017作图。

2 结果

2.1 黑暗及光照对马铃薯块茎愈伤期间失重率和病情指数的影响

失重率和病情指数是评价马铃薯块茎愈伤效果的重要指标。愈伤期间,黑暗和光照处理的块茎失重率均逐渐升高,黑暗处理的失重率在第3—14天显著低于光照处理,第14天时,比光照处理低56.37%（P＜0.05）（图1-A）。黑暗和光照处理块茎的病情指数随愈伤时间的延长逐渐降低,黑暗处理块茎的病情指数在第3—14天显著低于光照处理,第7天和14天时,分别低于光照处理58.96%和75.00%（P＜0.05）（图1-B）。失重率和病情指数的结果表明,黑暗促进了马铃薯块茎的愈伤,而光照则表现出一定程度的抑制。

图1

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图1黑暗及光照处理对马铃薯块茎愈伤期间失重率（A）和病情指数（B）的影响

*表示差异显著（P＜0.05）。下同
Fig. 1Effects of dark and light treatments on weight loss (A) and disease index (B) of potato tubers during healing

* indicate significant differences (P＜0.05). The same as below

2.2 黑暗及光照对愈伤期间块茎伤口处软木脂和木质素积累的影响

伤口部位的SPP和SPA的积累速率和积累量反映了伤口周皮的形成程度。愈伤期间,黑暗和光照处理块茎伤口处的SPP和SPA的积累量均逐渐增加,与光照相比,黑暗处理下SPP和SPA的积累量更高（图2-A、B）。黑暗和光照处理SPP和SPA积累的显著差异始于愈伤第5天,第14天时,黑暗处理SPP和SPA的细胞层厚度分别高于光照处理38.22%和36.76%（图2-D、E）。在愈伤期间,无论黑暗还是光照,块茎伤口处木质素的积累量均逐渐增加,但黑暗处理的积累量显著高于光照处理（图2-C）。黑暗和光照处理木质素积累的差异起始于愈伤第3天,愈伤第14天时,黑暗处理的木质化细胞层厚度高于光照处理14.71%（图2-F）。上述结果表明,黑暗促进了软木脂和木质素在块茎伤口处的积累,而光照则表现出一定程度的抑制。

图2

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图2黑暗及光照处理对愈伤期间块茎伤口处SPP（A）、SPA（B）和木质素（C）的积累以及伤口处SPP（D）、SPA（E）和木质化（F）细胞层厚度的影响

箭头分别指向形成的SPP、SPA以及木质素
Fig. 2Effects of dark and light treatments on the accumulation of SPP (A), SPA (B) and lignin (C), and cell layers thickness of SPP (D), SPA (E) and lignified (F) at the wound sites of potato tubers during healing

Arrows point to deposited SPP, SPA and lignin, respectively

2.3 黑暗及光照对愈伤期间块茎伤口表面色度的影响

伤口表面的色度一定程度上反映了酚类物质的氧化程度。愈伤期间,黑暗和光照处理块茎伤口表面的L*值和b*值均先下降后上升,黑暗处理块茎的L*值在整个愈伤期间均低于光照处理,第5天时低于光照处理13.51%（P＜0.05）（图3-A）。黑暗处理块茎伤口表面的a*值在愈伤早期迅速上升,中后期趋于平稳;光照处理的a*值在愈伤期间持续上升。黑暗处理块茎的a*显著偏低,愈伤第5天时,低于光照处理32.74%（P＜0.05）（图3-B）。黑暗处理下块茎伤口表面的b*值在第5天和第7天时显著高于光照处理,其中第5天时高于光照处理42.11%（P＜0.05）（图3-C）。色度测定结果表明,黑暗促进了马铃薯块茎伤口表面的褐变,而光照则表现出一定程度的抑制。

图3

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图3黑暗及光照处理对愈伤期间块茎伤口表面的L*值（A）、a*值（B）和b*值（C）的影响

Fig. 3Effects of dark and light treatments on L* (A), a* (B) and b* (C) values on the wound surface of potato tubers during healing

2.4 黑暗及光照对愈伤期间马铃薯块茎伤口处苯丙烷代谢关键酶活性的影响

苯丙烷代谢关键酶在块茎愈伤中具有重要作用,不仅催化形成SPP和木质素所需的酚单体,还可合成具有抗菌活性的类黄酮。愈伤期间,黑暗处理块茎伤口处的PAL活性迅速上升,而光照处理的上升缓慢,黑暗处理的PAL活性始终高于光照,在愈伤第7天时比光照处理高79.56%（P＜0.05）（图4-A）。两种处理块茎伤口处的C4H活性先上升后趋于平稳,黑暗处理块茎的活性增加时间更为提前。除第5天时光照处理高于黑暗处理外,其他时间点黑暗处理块茎伤口处的C4H活性均显著高于光照处理（图4-B）,愈伤第7天时,比光照处理高10.71%。两种处理块茎伤口处的4CL活性先迅速上升后持续下降,黑暗处理块茎的4CL活性始终高于光照,第7天时,高于光照处理72.48%（P＜0.05）（图4-C）。上述结果表明,黑暗激活了马铃薯块茎伤口处的苯丙烷代谢关键酶,其中对PAL的作用最为明显。

图4

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图4黑暗及光照处理对愈伤期间马铃薯块茎伤口处PAL（A）、C4H（B）和4CL（C）活性的影响

Fig. 4Effects of dark and light treatments on the activity of PAL (A), C4H (B) and 4CL (C) at wound sites of potato tuber during healing

2.5 黑暗及光照对愈伤期间马铃薯块茎伤口处H₂O₂含量和POD活性的影响

H₂O₂和POD是参与木质素和软木脂单体聚合的重要因素。黑暗和光照处理块茎伤口处的H₂O₂含量在愈伤第一周均迅速上升,之后趋于平稳。黑暗处理块茎的H₂O₂含量在愈伤第3、5和7天显著高于光照,分别比光照处理高1.3倍、49.85%和13.72%（P＜0.05）（图5-A）。黑暗和光照处理块茎伤口处的POD活性在愈伤期间均显著上升,黑暗处理的POD活性明显高于光照,第7天时比光照处理高73.46%（P＜0.05）（图5-B）。上述结果表明,黑暗促进了愈伤早期和中期块茎伤口处H₂O₂的积累,提高了中期和后期伤口处的POD活性。

图5

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图5黑暗及光照处理对愈伤期间马铃薯块茎伤口处H₂O₂含量（A）和POD活性（B）的影响

Fig. 5Effects of dark and light treatments on the H₂O₂ content (A) and POD activity (B) at wound sites of potato tubers during healing

2.6 黑暗及光照对愈伤期间马铃薯块茎伤口处PPO活性的影响

PPO是参与酚类物质氧化褐变的重要酶。愈伤期间,黑暗处理块茎伤口处的PPO活性在第3和14天显著高于光照处理,分别比光照处理高12.93%和5.4%（P＜0.05）（图6）。上述结果表明,黑暗提高了愈伤早期和后期伤口处的PPO活性,促进了块茎伤口处酚类物质的氧化褐变。

图6

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图6黑暗及光照处理对愈伤期间马铃薯块茎伤口处PPO活性的影响

Fig. 6Effects of dark and light treatments on the PPO activity at wound sites of potato tubers during healing

3 讨论

本研究发现,黑暗抑制了愈伤期间马铃薯块茎的失重率,而光照则表现出一定程度的促进。这主要是由于大量水分会通过伤口表面和表皮皮孔流失,少部分失重则缘于呼吸底物的消耗。光照下,马铃薯块茎伤口处形成的软木脂连续性不好,会导致更多的水分蒸发^[3]。本研究还观察到黑暗降低了接种块茎的病情指数,这可能是由于黑暗条件下更多的软木脂和木质素积累量所致。软木脂和木质素会在伤口形成物理屏障,可有效阻止病原物在伤口处的扩散,提高块茎对病原物侵染的抵抗能力,同时也加强了细胞保护,防止了水分蒸发^[21]。

苯丙烷代谢在马铃薯愈伤中具有至关重要的作用,可为软木脂和木质素的聚合提供酚类单体^[22]。作为关键酶和限速酶,PAL参与苯丙烷代谢的第一步反应^[13],催化苯丙氨酸去氨基转化为反式肉桂酸,之后在C4H的作用下转化为香豆酸、阿魏酸和咖啡酸等酚酸,产生的酚酸通过4CL催化生成香豆酸-CoA、阿魏酸-CoA和咖啡酸-CoA^[23]。另外,生成的羟基肉桂酸及其衍生物阿魏酸等可作为SPP的合成单体^[24]。肉桂酰辅酶A还原酶和肉桂醇脱氢酶催化酚酸-CoA形成松柏醇、芥子醇和对香豆醇,可作为木质素的合成单体^[5]。有报道表明,光照作为重要的环境因子可调控苯丙烷代谢^[23]。PARVEZ等^[25]发现,光照会提高玉米胚芽鞘细胞壁中的PAL活性。KUBASEK等^[26]也发现,光照会增强拟南芥发芽幼苗中C4H和4CL的表达。本研究观察到光照对马铃薯块茎愈伤期间的PAL、C4H、4CL活性表现出一定程度的抑制,该结果与前人观察到的结果相反,可能与马铃薯块茎苯丙烷代谢关键酶基因家族不同成员对光的敏感性存在差异有关。但具体光照或黑暗如何调控相关基因家族成员表达仍有待揭示。

当块茎受到伤害胁迫时,伤口处会发生氧爆^[27]。导致氧爆的活性氧（reactive oxygen species,ROS）主要由$\mathrm{O}_{2}^{\overline{.}}$和H₂O₂组成,$\mathrm{O}_{2}^{\overline{.}}$主要来源于NADPH氧化酶（NOX）^[28]。当块茎受到损伤后,伤口处细胞胞质外的Ca²⁺内流,胞质内Ca²⁺浓度升高,钙依赖蛋白激酶（CDPK）感知并结合Ca²⁺后活化,其进一步通过磷酸化激活NOX^[2],NOX将一个电子从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）中转移到O₂中从而产生$\mathrm{O}_{2}^{\overline{.}}$,但由于$\mathrm{O}_{2}^{\overline{.}}$存活寿命较短,很快会被超氧化物歧化酶歧化成寿命较长的H₂O₂^[29]。此外,多胺氧化酶和细胞壁过氧化物酶也会生成少量的H₂O₂用于块茎的愈伤^[30]。通常,块茎机械损伤后会发生两次氧爆,第一次产生于块茎损伤后的早期,少量的ROS可作为第二信使激活糖代谢、脂肪酸代谢、莽草酸途径、苯丙烷代谢等,以提供愈伤所需的底物;第二次产生于块茎损伤后的中后期,大量的ROS参与了软木脂的聚合及栓化过程^[31]。有研究表明,日本牵牛花的根、下胚轴和子叶PnCDPK1的mRNA在黑暗条件下的表达高于光照,表明黑暗可促进ROS的生成^[8]。POD可在H₂O₂存在的情况下促进SPP和木质素单体的氧化交联^[24]。研究表明,黑暗显著提高鲜切芹菜POD的活性^[7],这与本试验观察到的结果一致。SPP主要由大量的酚类单体通过酯键和醚键连接形成^[32],积累在细胞壁中。随后,脂肪酸单体通过酯键相连构成SPA^[33]。之后,在甘油的作用下SPP和SPA通过POD氧化交联,再嵌入可溶性蜡质,形成木栓质层积在细胞壁内侧^[34]。松柏醇、芥子醇和香豆醇会在POD和H₂O₂的作用下聚合形成木质素,作为苯丙烷代谢的终产物。木质素是细胞壁次生壁的组成物质,也是伤口周皮的主要成分,可使细胞壁更加坚固,有效维持细胞内的水分^[35]。SPA底物主要来源于脂肪酸代谢^[5],这些脂肪酸单体主要包括一系列ω-羟基脂肪酸（16%—21%,主要为18:1）、饱和脂肪酸（12%—20%,16:0—28:0）、α、ω-二元酸（50%—55%,主要为18:1）和阿魏酸等^[28]。本研究观察到黑暗条件下,马铃薯块茎伤口处木质素和软木脂的积累更快,积累量更多。原因可能是黑暗促进了木质素和软木脂的积累,但黑暗调控马铃薯块茎愈伤期间软木脂和木质素单体合成以及聚合的机制仍有待进一步揭示。

愈伤期间本试验观察到块茎伤口表面褐变逐渐加深,这类褐变主要缘于酶促褐变^[36],由PPO氧化酚类物质生成醌类物质,最终形成类黑素沉积在伤口表面^[27]。有报道称,光照能显著抑制鲜切芹菜的PPO活性,降低醌的积累和褐变指数^[7]。另有研究观察到,黑暗会促进鲜切莴苣的组织褐变^[37]。这些结果与本试验观察到的结果类似。酚类物质的氧化不仅导致褐变,而且形成的醌类物质还具有抑菌作用,可以抑制接种病原菌在块茎体内的扩展。

4 结论

黑暗激活了马铃薯块茎伤口处的苯丙烷代谢关键酶,提高了POD和PPO活性以及H₂O₂含量,加快了软木脂和木质素在伤口部位的积累,加速了伤口表面的褐变,有效降低了块茎愈伤期间的失重率和病情指数,促进了马铃薯块茎的采后愈伤。而光照则在一定程度上抑制了马铃薯块茎的愈伤。

参考文献 View Option 原文顺序
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被引期刊影响因子

[1] LULAI E C, FREEMAN T P. The importance of phellogen cells and their structural characteristics in susceptibility and resistance to excoriation in immature and mature potato tuber (Solanum tuberosum L.) periderm
Annals of Botany, 2001,88(4):555-561.
DOI:10.1006/anbo.2001.1497URL [本文引用: 1]

[2] 姜红, 王毅, 毕阳. 马铃薯块茎的愈伤过程、机制和影响因素
园艺学报, 2019,46(9):1842-1852.
[本文引用: 2]

JIANG H, WANG Y, BI Y. The process, mechanism and influential factors of wound healing of potato tubers
Acta Horticulturae Sinica, 2019,46(9):1842-1852. (in Chinese)
[本文引用: 2]

[3] PRIESTLEY J H, WOFFEN L M. The healing of wounds in potato tubers and their propagation by cut sets
Annals of Applied Biology, 2008,10(1):96-115.
DOI:10.1111/aab.1923.10.issue-1URL [本文引用: 2]

[4] JAKUBOWSKI T. Use of UV-C radiation for reducing storage losses of potato tuber
Bangladesh Journal of Botany, 2018,47(3):533-537.
DOI:10.3329/bjb.v47i3.38722URL [本文引用: 1]

[5] LULAI E C. Skin-set, wound-healing and related defects//Vreugdenhil Dick. Potato biology and biotechnology: Advances and Perspectives
The Netherlands: Elsevier Limited, 2007: 471-500.
[本文引用: 3]

[6] MOL J, JENKINS G, SCHAFER E, WEISS D, WALBOT D V. Signal perception, transduction, and gene expression involved in anthocyanin biosynthesis
Critical Reviews in Plant Sciences, 1996,15(5):525-557.
DOI:10.1080/07352689609382369URL [本文引用: 1]

[7] ZHAN L J, HU J Q, LIM L T, PANG L Y, LI Y, SHAO J F. Light exposure inhibiting tissue browning and improving antioxidant capacity of fresh-cut celery (Apium graveolens var. dulce)
Food Chemistry, 2013,141(3):2473-2478.
DOI:10.1016/j.foodchem.2013.05.035URL [本文引用: 3]

[8] JAWORSKI K, PAWELEK A, SZMIDT-JAWORSKA A, KOPCEWICZ J. Expression of calcium-dependent protein kinase gene (PnCDPK1) is affected by various light conditions in Pharbitis nil seedlings
Journal of Plant Growth Regulation, 2010,29(3):316-327.
DOI:10.1007/s00344-010-9138-zURL [本文引用: 2]

[9] 郑晓渊, 王调兰, 张静荣, 姜红, 王斌, 毕阳. 二氧化氯处理促进厚皮甜瓜果实的采后愈伤
中国农业科学, 2019,52(3):512-520.
[本文引用: 1]

ZHENG X Y, WANG T L, ZHANG J R, JIANG H, WANG B, BI Y. Using chlorine dioxide treatment to promote wound healing of postharvest muskmelon fruit
Scientia Agricultura Sinica, 2019,52(3):512-520. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[10] RAHNAMA H, MORADI A B, MIRROKNI S H, MORADI F, SHAMS M R, FOTOKIAN M H. Comparative compositional analysis of transgenic potato resistant to potato tuber moth (PTM) and its non-transformed counterpart
Transgenic Research, 2018,27(3):301-313.
DOI:10.1007/s11248-018-0075-0URL [本文引用: 1]

[11] YIN Y, LI Y C, BI Y, CHEN S J, LI Y C, YUAN C, YUAN L, WANG Y, GONG D. Postharvest treatments with ?-aminobutyric acid induces resistance against dry rot caused by Fusarium sulphureum in potato tuber
Agricultural Sciences in China, 2010(9):1372-1380.
[本文引用: 1]

[12] DUAN J Y, WU R Y, BERNADINE C S, ZHAO Y Y. Effect of edible coatings on the quality of fresh blueberries (Duke and Elliott) under commercial storage conditions
Postharvest Biology and Technology, 2011,59(1):71-79.
DOI:10.1016/j.postharvbio.2010.08.006URL [本文引用: 1]

[13] 李雪, 吴觉天, 王毅, 姜红, 毕阳, 司敏, 张静荣, 徐洁. 采后ABA处理促进‘陇薯3号’马铃薯块茎愈伤形成
中国农业科学, 2017,50(20):4003-4011.
[本文引用: 2]

LI X, WU J T, WANG Y, JIANG H, BI Y, SI M, ZHANG J R, XU J. Postharvest ABA treatment promote wound healing of potato ‘Longshu No.3’ tubers
Scientia Agricultura Sinica, 2017,50(20):4003-4011. (in Chinese)
[本文引用: 2]

[14] LULAI E C, CORSINI D L. Differential deposition of suberin phenolic and aliphatic domains and their roles in resistance to infection during potato tuber (Solanum tuberosum L.) wound-healing
Physiological and Molecular Plant Pathology, 1998,53(4):209-222.
DOI:10.1006/pmpp.1998.0179URL [本文引用: 1]

[15] ALBA C M, FORCHETTI S M D, TIGIER H A. Phenoloxidase of peach (Prunus persica) endocarp: Its relationship with peroxidases and lignification
Physiologia Plantarum, 2010,109(4):382-387.
DOI:10.1034/j.1399-3054.2000.100403.xURL [本文引用: 1]

[16] VAN OIRSCHOT Q E A, REES D, AKED J, KIHURANI A. Sweetpotato cultivars differ in efficiency of wound healing
Postharvest Biology and Technology, 2006,42(1):65-74.
DOI:10.1016/j.postharvbio.2006.05.013URL [本文引用: 1]

[17] JIANG H, WANG B, MA L, ZHENG X Y, GONG D, XUE H L, BI Y, ZHANG Z, PRUSKY D. Benzo-(1, 2, 3)-thiadiazole-7-carbothioic acid s-methyl ester (BTH) promotes tuber wound healing of potato by elevation of phenylpropanoid metabolism
Food Chemistry, 2020,309:125608.
DOI:10.1016/j.foodchem.2019.125608URL [本文引用: 1]

[18] MARTINEZ-TELLEZ M A, LAFUENTE M T. Effect of high temperature conditioning on ethylene, phenylalanine ammonia-lyase, peroxidase and polyphenol oxidase activities in flavedo of chilled ＜Fortune> mandarin fruit
Journal of Plant Physiology, 1997,150(6):674-678.
DOI:10.1016/S0176-1617(97)80282-9URL [本文引用: 1]

[19] SCHOCH G A, NIKOY G N, ALWORTH W L, WERCK-REICHHART D. Chemical inactivation of the cinnamate 4-hydroxylase allows for the accumulation of salicylic acid in elicited cells
Plant Physiology, 2002,130(2):1022-1031.
DOI:10.1104/pp.004309URL [本文引用: 1]

[20] YUAN C X, DING J. Effects of water stress on the content of IAA and the activities of IAA oxidase and peroxidase in cotton leaves
Acta Phytophysiologica Sinica, 1990,16(3):179-180.
[本文引用: 2]

[21] BAUCHER M, HALPIN C, PETIT-CONIL M, BOERJAN W. Lignin: Genetic engineering and impact on pulping
Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2003,38(4):305-350.
DOI:10.1080/10409230391036757URL [本文引用: 1]

[22] BERNARDS M A, SUSAG L M, BEDGAR D L, ANTEROLA A M, LEWIS N G. Induced phenylpropanoid metabolism during suberization and lignification: A comparative analysis
Journal of Plant Physiology, 2000,157(6):601-607.
DOI:10.1016/S0176-1617(00)80002-4URL [本文引用: 1]

[23] 巢牡香, 叶波平. 环境非生物因子对植物次生代谢产物合成的影响
药物生物技术, 2013,20(4):365-368.
[本文引用: 2]

CHAO M X, YE B P. Influence of environmental abiotic factors on plant secondary metabolite biosynthesis
Pharmaceutical Biotechnology, 2013,20(4):365-368. (in Chinese)
[本文引用: 2]

[24] LULAI E C, SUTTLE J C, PEDERSON E S M. Regulatory involvement of abscisic acid in potato tuber wound-healing
Journal of Experimental Botany, 2008,59(6):1175-1186.
DOI:10.1093/jxb/ern019URL [本文引用: 2]

[25] PARVEZ M M, WAKABAYASHI K, HOSON K, KAMISAKA S. White light promotes the formation of diferulic acid in maize coleoptile cell walls by enhancing PAL activity
Physiologia Plantarum, 1997,99(1):39-48.
DOI:10.1111/ppl.1997.99.issue-1URL [本文引用: 1]

[26] KUBASEK W L, SHIRLEY B W, MCKILLOP A, GOODMAN H M, BRIGGS W, AUSUBEL F M. Regulation of flavonoid biosynthetic genes in germinating Arabidopsis seedlings
The Plant Cell, 1992,4(10):1229-1236.
DOI:10.2307/3869409URL [本文引用: 1]

[27] WOOLFSON K N, HAGGITT M L, ZHANG Y, KACHURA A, BJELICA A, REY-RINCON M A, KABERI K M, BERNARDS M A. Differential induction of polar and non-polar metabolism during wound-induced suberization in potato (Solanum tuberosum L.) tubers
The Plant Journal, 2018,93(5):931-942.
DOI:10.1111/tpj.2018.93.issue-5URL [本文引用: 2]

[28] THIPYAPONG P, JOEL D M, STEFFENS J C. Differential expression and turnover of the tomato polyphenol oxidase gene family during vegetative and reproductive development
Plant Physiology, 1997,113(3):707-718.
DOI:10.1104/pp.113.3.707URL [本文引用: 2]

[29] RAZEM F A, BERNARDS M A. Reactive oxygen species production in association with suberization: evidence for an NADPH-dependent oxidase
Journal of Experimental Botany, 2003,54(384):935-942.
DOI:10.1093/jxb/erg094URL [本文引用: 1]

[30] SHETTY N P, JORGENSEN H J L, JENSEN J D, COLLINGE D B, SHETTY H S. Roles of reactive oxygen species in interactions between plants and pathogens
European Journal of Plant Pathology, 2008,121(3):267-280.
DOI:10.1007/s10658-008-9302-5URL [本文引用: 1]

[31] THIPYAPONG P, JOEL D M, STEFFENS J C. Differential expression and turnover of the tomato polyphenol oxidase gene family during vegetative and reproductive development
Plant Physiology, 1997,113(3):707-718.
DOI:10.1104/pp.113.3.707URL [本文引用: 1]

[32] GRACA J, PEREIRA H. Suberin structure in potato periderm: glycerol, long-chain monomers, and glyceryl and feruloyl dimmers
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000,48(11):5476-5483.
DOI:10.1021/jf0006123URL [本文引用: 1]

[33] KOLATTUKUDY P E. Biochemistry and function of cutin and suberin
Canadian Journal of Botany, 2011,62(12):2918-2933.
DOI:10.1139/b84-391URL [本文引用: 1]

[34] BERNARDS M A. Demystifying suberin
Canadian Journal of Botany, 2002,80(3):227-240.
DOI:10.1139/b02-017URL [本文引用: 1]

[35] SHAO X F, TU K, TU S C, SU J, ZHAO Y. Effects of heat treatment on wound healing in Gala and red Fuji apple fruits
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010,58(7):4303-4309.
DOI:10.1021/jf904273mURL [本文引用: 1]

[36] 王丽, 王万兴, 索海翠, 胡新喜, 秦玉芝, 曾璐, 李小波, 熊兴耀. 马铃薯块茎酶促褐变及与相关生理指标的关系
园艺学报, 2019,46(8):1519-1530.
[本文引用: 1]

WANG L, WANG W X, SUO H C, HU X X, QIN Y Z, ZENG L, LI X B, XIONG X Y. The Relationship between enzymatic browning and relevant physiological index of potato tubers
Acta Horticulturae Sinica, 2019,46(8):1519-1530. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[37] ZHAN L J, LI Y, HU J Q, PANG L Y, FAN H P. Browning inhibition and quality preservation of fresh-cut romaine lettuce exposed to high intensity light
Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2012,14(2):70-76.
DOI:10.1016/j.ifset.2012.02.004URL [本文引用: 1]