GC-MS分析慢性氨气应激对肉鸡血清代谢物的影响

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孙永波, 王亚, 萨仁娜^,, 张宏福中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室,北京 100193

Effects of Chronic Ammonia Stress on Serum Metabolites of Broilers Based on GC-MS

SUN YongBo, WANG Ya, SA RENNA^,, ZHANG HongFuState Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Science/Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100193

通讯作者: 萨仁娜,E-mail: sa6289@126.com

责任编辑: 林鉴非
收稿日期:2019-04-29接受日期:2019-07-3网络出版日期:2020-04-16

基金资助:

国家重点研发计划.2016YFD0500509
现代农业产业技术体系建设专项资金.CARS-41
中国农业科学院科技创新工程.ASTIP-IAS07

Received:2019-04-29Accepted:2019-07-3Online:2020-04-16
作者简介 About authors
孙永波,E-mail: ybsun2014@163.com。

摘要
【目的】随着养殖业集约化和规模化的发展,舍内环境对畜禽生长的影响日益突出。在密闭舍饲条件下,不断产生有毒有害气体,其中氨气的危害最大,降低畜禽生产性能,威胁动物健康。为此开展慢性氨气应激对肉鸡血清代谢物影响的研究,从小分子物质和代谢途径方面探究氨气导致机体代谢发生的变化,为舍内氨气的合理调控提供数据支持。【方法】试验采用单因素完全随机设计,将96只21日龄健康AA肉鸡随机分成对照组和试验组,每组设4个重复,每个重复12只鸡。对照组氨气浓度为0 mg·kg ^-1,试验组氨气浓度为45 mg·kg ^-1。试验在人工模拟呼吸舱内进行,呼吸舱采用全自动化控制温湿度等养殖条件,采用网上平养,自由采食和饮水,24h 光照,试验期为21d。在肉鸡42日龄时,从每个重复中随机抽取2只,翅静脉采血,分离血清。将血清样品预处理后,采用气相色谱/质谱联用技术（gas chromatograph tandem mass spectrometer technology, GC-MS）检测代谢产物,利用质谱数据库对其进行鉴定。通过主成分分析、偏最小二乘法判别分析、正交偏最小二乘法判别分析、t-检验等,寻找差异代谢物,并利用生物信息学方法对差异代谢物进行通路富集分析。【结果】（1）利用 GC-MS 方法,结合质谱数据库对检测到的代谢物进行快速鉴定,在肉鸡血清中共检测到204种代谢物。将代谢组数据导入SIMCA-P软件进行多元统计分析,结合t-检验筛选出 23种差异代谢物,其中上调19个,下调4个。（2）差异代谢物主要涉及能量代谢（乳酸、α-酮戊二酸）、氨基酸代谢（L-别苏氨酸、L-高丝氨酸、烟酰甘氨酸）、脂肪酸代谢（硬脂酸、亚麻酸、亚油酸、胆固醇）以及核苷酸代谢（次黄嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶）等。（3）代谢通路富集分析表明,氨气应激主要影响了肉鸡血清的脂肪代谢通路,如亚油酸代谢、花生四烯酸代谢以及α-亚麻酸代谢。【结论】GC-MS较为全面地检测到血清的代谢物,能够准确地筛选出差异代谢物,同时慢性氨气应激显著影响肉鸡的血清代谢物含量,主要影响脂肪代谢通路,为阐明氨气应激影响营养代谢的机制提供参考。
关键词： 肉鸡;代谢组学;血清;代谢物;气相色谱/质谱联用技术

Abstract

【Objective】With the development of intensive and large-scale broiler breeding, the impact of environmental conditions on the growth of livestock and poultry has become increasingly prominent. Under high-density feeding conditions, a large amount of toxic and harmful gases is generated constantly, among which ammonia is the most harmful gas which reduces the performance of livestock and poultry and threatens animal health. The purpose of this experiment was to study the effects of chronic ammonia stress on serum metabolites in broiler chickens, and to explore the changes of metabolism caused by ammonia stress in terms of small molecules and metabolic pathways, so as to provide data support for reasonable regulation of ammonia in the poultry house. 【Method】Ninety-six 21-day-old healthy AA broilers were randomly divided into control group and experimental group by a single factor completely random design, with 4 replicates in each group and 12 chickens per replicate. The control group ammonia concentration was 0 mg·kg ^-1, the test group ammonia concentration was 45 mg·kg ^-1. The experiment was carried out in an artificial simulated respiratory chamber, which was fully automated to control the temperature and humidity and the other environmental conditions. Broilers were raised in the nets and the feed and water were provided ad libitum during the entire experimental period. The trial lasted 21 days with 24 h lighting program. They were routinely managed according to the AA broiler feeding manual and immunized according to the routine procedures. Two broiler chickens pre replicate from each treatment were chosen randomly and blood samples were collected from the wing vein at 42 day-old. After pretreatment of serum samples, the metabolites were detected by GC-MS technology, and identified by mass spectral database. Principal component analysis (PCA), partial least-squares discriminant analysis (PLSDA), orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLSDA) and t-test were used to find the different metabolites, and then the bioinformatics methods was used to analyze the differential metabolic pathways. 【Result】Results showed that: (1) A total of 204 metabolites were detected in serum of broiler chickens by GC-MS combining with rapid identification of the detected metabolites performed with a mass spectrometry database. Metabolomics data were imported into SIMCA-P software for multivariate statistical analysis, and then t-test. Twenty-three different metabolites were identified, of which 19 were up-regulated and 4 were down-regulated. (2) Differential metabolites mainly involved energy metabolism (lactic acid, α-ketoglutaric acid), amino acid metabolism (L-Allothreonine acid, L-Homoserine, Nicotinylglycine), fatty acid metabolism (stearic acid, linolenic acid, linoleic acid, cholesterol) and nucleotide metabolism (hypoxanthine, uracil, thymine) and so on. (3) Metabolic pathway enrichment analysis showed that ammonia stress mainly affected the fat metabolism pathway in serum of broiler chickens, including linoleic acid metabolism, arachidonic acid metabolism and α-linolenic acid metabolism. 【Conclusion】 It can be seen that GC-MS can detect serum metabolites comprehensively, and screen differential metabolites accurately. Chronic ammonia stress significantly affected serum metabolites content of broilers, mainly affected fat metabolism pathway.

Keywords：broiler;metabonomics;serum;metabolites;GC-MS

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孙永波, 王亚, 萨仁娜, 张宏福. GC-MS分析慢性氨气应激对肉鸡血清代谢物的影响[J]. 中国农业科学, 2020, 53(8): 1688-1698 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.08.017
SUN YongBo, WANG Ya, SA RENNA, ZHANG HongFu. Effects of Chronic Ammonia Stress on Serum Metabolites of Broilers Based on GC-MS[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2020, 53(8): 1688-1698 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.08.017

0 引言

【研究意义】血液理化指标能够反映动物的健康状况,分析肉鸡血液指标的变化情况能够了解其生理状态^[1]。由于粪便和垫料等含氮有机物的发酵,畜禽舍内持续性的存在低浓度的氨气。动物经呼吸作用吸入氨气,一部分直接与呼吸系统黏膜接触并溶于黏膜表面,一部分通过肺泡的气血屏障进入血液循环^[2]。因此,通过测定长期氨气应激肉鸡的血清代谢物的变化,对于了解氨气的有害作用及对肉鸡代谢通路的影响,分析其对畜禽健康影响的作用机制,进而科学调控养殖环境具有重要意义。【前人研究进展】氨气是一种无色、强刺激性的有毒气体,是畜禽舍内危害较大的气体,长期氨气应激损害动物的健康、诱发各种疾病^[3,4]。氨气通过呼吸作用到达肺泡,然后进入血液,与血液中的血红蛋白结合,使血红素变为正铁血红素,进而降低血红蛋白的携氧能力,降低畜禽的抵抗力^[5]。随着鸡舍氨气浓度的升高,血清GSH-Px活性呈二次曲线降低,CAT活性呈线性降低^[6]。氨气应激显著降低肉鸡的抗氧化能力,使血液中抗氧化酶活性降低,丙二醛含量升高^[7]。BORELL等^[8]研究报道,50 mg·kg^-1浓度氨气导致保育猪血液中巨噬细胞数量、淋巴细胞数量及皮质酮含量显著增加。WEI等^[9]研究表明,70 mg·kg^-1浓度氨气导致肉鸡血清球蛋白含量和溶菌酶活性降低。宋弋等^[10]发现,高浓度氨气显著降低肉鸡血液中溶菌酶活性以及NK细胞杀伤活性。氨气应激还影响血液中细胞因子的含量,损害肉鸡的免疫功能^[11]。李聪等^[12]研究舍内不同浓度氨气对肉鸡免疫反应的作用,发现50 mg·kg^-1处理组显著降低42日龄肉鸡血清中IL-6以及IL-1β浓度。【本研究切入点】目前国内外研究大多数集中在氨气应激对肉鸡血液中少量的理化指标的影响,缺乏系统性的研究。代谢组学能够反应机体出现的动态复杂的代谢应答和变化,具备其他技术所不具备的优势,在近些年越来越得到广泛的应用^[13,14,15]。目前,有关氨气应激对肉鸡血清代谢物影响的研究未见报道。【拟解决的关键问题】本试验使用气相色谱–质谱联用（gas chromatography- mass spectrum,GC-MS）技术,研究慢性氨气应激条件下肉鸡血清中小分子代谢产物浓度的变化,探究氨气对肉鸡代谢的影响及可能的作用机理,从代谢方面揭示氨气的危害性,为畜禽舍舒适环境参数的制定以及合理调控舍内环境提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2018年4—6月在人工呼吸代谢舱内进行（动物营养学国家重点实验室昌平基地）,呼吸舱内环境参数（如温湿度等）通过计算机进行有效控制,使得养殖环境条件保持一致。本试验利用单因子完全随机设计,将21日龄爱拔益加（AA）雄性雏鸡共96只,随机分为2组,每组设置4个重复,每个重复有12只肉仔鸡。对照组氨气浓度为（0±3）mg·kg^-1,试验组氨气浓度为（45±3）mg·kg^-1。舱外连接氨气瓶,通过减压阀和流量计控制舱内的氨气。每个舱通过Innoval 1412红外光声谱气体监测仪实时监测舱内氨气浓度,保证试验期舱内氨气浓度稳定。试验期3周。

1.2 饲粮与管理

基础饲粮为玉米-豆粕型,参照中国鸡饲养标准（2004）营养需要量配制,代谢能和蛋白质含量分别为12.76 MJ·kg^-1和19.94%。肉鸡饲养于单层平养鸡笼内,自由采食和饮水,按照AA肉鸡饲养管理手册进行日常管理,24 h 连续光照。

1.3 测定指标和方法

1.3.1 样品采集试验结束时（42日龄）,禁食12h后在每个重复中随机选择2只健康肉鸡,进行翅静脉采血,收集血液,自然倾斜静置一段时间后,进行离心,3 000r/min处理5min,分离血清后保存在-80℃冰箱中,待测。

1.3.2 样品前处理及GC/MS 分析肉鸡血清样品从-80℃冰箱中取出后在 4℃冰箱解冻,每管取出 80 μL血清样品转移至 1.5 mL EP管中;加入 10 μL的内标（L-2-氯-苯丙氨酸,0.3 mg·mL^-1,甲醇配置）,混匀。加入240 μL甲醇-乙腈（2﹕1）溶液,混匀。超声提取后在-20℃下静置,然后低温离心10min（12 000 r/min,4℃）,取上清液于衍生瓶中,冷冻干燥挥干样本后加入浓度为15mg·mL^-1的甲氧胺盐酸吡啶溶液 80 μL的,混匀, 37℃ 肟化反应 1.5 h;然后加入80 μL的衍生试剂（含1%TMCS的BSTFA）和 20 μL的正己烷,混匀,70℃反应1 h。最后取出样本,室温静置,待上机分析。

气相色谱质谱联用仪型号为7890A-5975C（Agilent, USA）。1μL衍生化后的样品用无分流模式注入GC-MS 系统,经毛细管柱分离后进入质谱系统进行检测。本试验所用载气是高纯度的氦气,流速设置为1.0 mL·min^-1。程序升温设置如下：初始温度设定为60℃,以8℃·min^-1的速度升温至 310℃,并维持 6 min。电子轰击离子源（EI）温度设置为 230℃,四极杆温度设置为 150℃,电子能量 70EV。扫描方式为全扫描模式（SCAN）,质量扫描范围：m/z 在50—600;采用随机顺序进行连续样本分析,尽量降低或避免因仪器信号波动而造成的影响。

1.4 数据分析

本试验中GC-MS 的原始下机数据经 Chroma TOF软件预处理,然后导出数据的矩阵,去除假阳性峰以及内标峰,去冗余以及峰合并。使用工作站软件对每个化合物的特征离子片段谱的碎片质荷比和丰度与 NIST 数据库、Feihn代谢组学数据库的标准离子片段谱库进行比对,以及进行物质结构定性^[16]。将数据归一化,然后导入 SIMCA-P 14.0 软件包,进行无监督的主成分分析（PCA）,偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）以及正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）。变量权重值（variable important in projection, VIP）大于 1 的变量被认为是差异代谢物。采用200 次响应排序检验的方法来评价模型拟合程度。OPLS-DA 和t-检验相结合,筛选对照组和氨气应激组肉鸡血清的差异代谢物（VIP>1,P<0.05）。利用MetaboAnalyst进行代谢通路富集分析及拓扑分析。

2 结果

2.1 代谢物总离子流色谱图

图1为肉鸡血清代谢物 GC-MS 的总离子流色谱图。可以看出,氨气应激组与对照组肉鸡血清中各种小分子物质分离情况较好,通过与NIST 数据库比对,共鉴定出204种代谢物。为了进一步深入分析不同处理组代谢物质种类和含量的变化,结合多元变量分析,对差异的代谢物进行定性、定量分析并进行生物学阐释。

图1

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图1肉鸡血清总离子流色谱图（A为对照组,B为试验组）

Fig.1Total ion chromatograms of serum of broilers. (A is the control group and B is the experimental group)

2.2 主成分分析

对数据进行无监督的PCA分析后得到得分散点图（图2）,每个点代表一个样本。由图可知,对照组和氨气应激试验组间不能较好地区分开。此外,该模型的R²X=0.569,Q²=0.0352,Q²<0.5（Q²>0.5表明模型拟合较好）,组内各试验动物间分布也比较离散,需要对数据进一步分析。

图2

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图2肉鸡血清代谢物的主成分分析图

C1代表对照组样本1,T1代表试验组样本1,其他类推。下同
Fig. 2The PCA score scatter plot of serum metabolites in broilers

C1 represents control sample 1, T1 represents test sample 1, and so on. The same as below

2.3 偏最小二乘判别分析（PLS-DA）

为了消除其他因素的影响,采用有监督PLS-DA分析,主要是消除组内差异,凸显组间差异。对肉鸡血清样本代谢组数据进行PLS-DA分析,详见图3。结果显示,对照组和试验组之间无明显的交叉重叠部分,区分度较好（R²X=0.399,R²Y=0.989,Q²=0.744）,说明试验处理组长期氨气应激对肉鸡血清代谢物的影响显著。

图3

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图3肉鸡血清代谢物偏最小二乘判别分析图

Fig. 3The PLS-DA score scatter plot of serum metabolites in broilers

2.4 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）

OPLS-DA对PLS-DA模型进行正交矫正,可以更好地区分组间差异,提高模型的有效性和解析能力。为了找出发生显著变化的生物标志物,对数据进行OPLS-DA分析（图4）。由图4可知,试验组和对照组能够很好地分开（R²X=0.399,R²Y=0.989 ,Q²=0.635）,说明两组之间的代谢物发生明显改变。PLS-DA 模型置换检验（200 次迭代）的结果见图5,R²=（0.0,0.784）Q²=（0.0,-0.271）,图中所有 Q² 均在 R² 之下,且 Q² 的回归直线与 y 轴的交点在负半轴,说明OPLS-DA模型未过度拟合,是稳健可靠的。

图4

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图4肉鸡血清代谢物正交偏最小二乘判别分析图

Fig. 4The OPLS-DA score scatter plot of serum metabolites in broilers

图5

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图5OPLS-DA 模型验证图

Fig. 5Model validation plots of OPLS-DA

2.5 差异代谢物的筛选

OPLS-DA 分析后,根据以下条件：VIP>1,t检验P<0.05,共筛选到23个差异代谢物,其中上调19个,下调4个（表1）。由表1可知,氨气应激肉鸡的血清代谢物α-酮戊二酸、肌醇、3-羟基丁酸、L-高丝氨酸等含量显著升高,而次黄嘌呤、尿嘧啶、乳酸、胸腺嘧啶等含量显著降低。主要引起了肉鸡核苷酸代谢、碳水化合物代谢以及氨基酸代谢等的变化。

Table 1
表1
表1肉鸡血清主要差异代谢物
Table 1main significant metabolites in serum of broilers

代谢物 Metabolites	变化趋势 Change trend	VIP 值 VIP value	P值 P value
乳酸 Lactic acid	↓	1.5807	0.0352
α-酮戊二酸 Alpha-ketoglutaric acid	↑	1.7845	0.0082
苏糖醇 Threitol	↑	1.4728	0.0354
肌醇 Myo-inositol	↑	1.4704	0.0412
硬脂酸 Stearic acid	↑	1.4236	0.0384
亚麻酸 Linolenic acid	↑	1.6603	0.0178
亚油酸 Linoleic acid	↑	1.6483	0.0134
反式-9-十八碳烯酸 Elaidic acid	↑	1.9429	0.0031
棕榈酸 Palmitic acid	↑	1.6947	0.0154
十八烯酸 Oleic acid	↑	1.7048	0.0128
花生四烯酸 Arachidonic acid	↑	1.8747	0.0048
亚油酸甲酯 Linoleic acid methyl ester	↑	1.4729	0.0356
D-甘油酸 D-Glyceric acid	↑	1.4868	0.0239
胆固醇 Cholesterol	↑	1.4233	0.0357
2-羟基丁酸 2-hydroxybutanoic acid	↑	1.8462	0.0072
3-羟基丁酸 3-hydroxybutyric acid	↑	2.2048	0.0003
次黄嘌呤 Hypoxanthine	↓	1.6020	0.0239
尿嘧啶 Uracil	↓	1.5908	0.0186
胸腺嘧啶 Thymine	↓	1.5775	0.0197
羟基脲 Hydroxyurea	↑	1.5766	0.0207
L-别苏氨酸 L-Allothreonine	↑	1.5866	0.0300
L-高丝氨酸 L-homoserine	↑	2.1316	0.0010
烟酰甘氨酸 Nicotinoylglycine	↑	1.5466	0.0211

“↑”表明上调“↓”表明下调;
“↑” means up-regulated expression, and “↓” indicates down-regulated

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火山图（图6）中每个点代表一个代谢物,在图中显示了两个重要的指标,横坐标表示变化差异倍数（取以2为底的对数,试验组/对照组）,纵坐标表示t检验的 P-value（取以10为底的对数）,能够直观且合理地筛选出试验组和对照组间的显著性生物标志物。由图6可知,氨气应激导致肉鸡血清中显著升高2倍以上的代谢物有3-羟基丁酸、反式-9-十八碳烯酸、亚麻酸、L-别苏氨酸,显著降低2倍以上的代谢物有胸腺嘧啶、次黄嘌呤。这些代谢物可以作为氨气应激对肉鸡血清代谢物影响的潜在标志物,有待进一步研究。

图6

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图6肉鸡血清代谢物火山图

每个点代表一个代谢物,红色代表上调2倍及以上,蓝色代表下调2倍及以上
Each point represents a metabolite, the red representative is up 2 times and above, and the blue represents 2 times and more
Fig. 6Volcano plot of serum metabolite of broilers

2.6 代谢物通路分析

对所鉴定出的显著差异代谢物利用在线工具MetaboAnalyst 3.0进行代谢通路富集分析以及拓扑分析,筛选标准为影响因子>0.2及P<0.05,结果见图7。图中横坐标Pathway impact表征由拓扑分析计算所得的代谢通路的重要性值（值越大,表明试验处理对此代谢通路影响越大）,纵坐标-lg(P)表示代谢通路富集分析的显著性水平。与对照组相比,氨气慢性应激主要影响了肉鸡的脂肪代谢通路,如花生四烯酸代谢、亚油酸代谢以及α-亚麻酸代谢等。

图7

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图7代谢通路变化

A：亚油酸代谢;B：α-亚麻酸代谢;C：花生四烯酸代谢。颜色越深表明P值越小
Fig. 7Topology analysis of metabolic pathways identified in the serum

A：Linoleic acid metabolism;B：alpha-Linolenic acid metabolism;C：Arachidonic acid metabolism. The darker the color, the smaller the P value

3 讨论

3.1 肉鸡血清代谢谱

动物机体的代谢产物在基因调控、信号转导以及蛋白质功能等互作网络的最下游位置,是基因组、转录组、蛋白组等受到机体内外双重因素影响后的最终结果^[17]。通过定性和定量分析代谢产物,能够从整体上比较全面的评价动物机体功能状态及其变化,是生物学现象的最终表现^[18]。目前,代谢组学技术的应用在动物营养研究中已经越来越普遍,如聂存喜等^[19]研究报道了酵母发酵豆粕对肉鸡脂质代谢的影响;孙玲伟等^[20]分析了临床酮病、亚临床酮病和健康的奶牛血浆代谢谱差异;范子玲等^[21]观测了卵巢静止奶牛和正常发情奶牛的血浆差异代谢物;肖英平等^[22] 在分析了仔猪早期断奶过程中血清氨基酸代谢谱的动态变化情况下,研究了谷氨酰胺对仔猪代谢的改善作用;AMETAJ等^[23]应用代谢组学分析了奶牛饲喂不同比例大麦谷物,瘤胃代谢产物的差异。GC-MS具有一系列的优点,如其灵敏度高、分辨率高、无需衍生化处理等,能够较为敏捷地识别代谢物并进行分析;此外,GC-MS具有较完备的数据库供检索,能够同时测定有机酸、氨基酸、糖、脂肪酸等上百种化合物^[24]。本试验基于气相色谱质谱联用技术研究氨气应激对肉鸡血清代谢物的影响,获得了大量有效的代谢物数据,结合SIMCA-P、NIST等分析软件和数据库能够准确的分析鉴定出204种代谢物,其中23种发生显著变化,应用MetaboAnalyst 3.0分析参与的代谢途径,氨气应激主要影响了肉鸡血清的脂肪代谢通路。本研究分析了养殖环境因子氨气影响肉鸡血清代谢产物的变化情况,为阐释氨气应激影响肉鸡健康的作用机制提供了依据。

3.2 长期氨气应激对肉鸡代谢的影响

宋弋等^[25]研究报道,氨气通过呼吸道经肺泡进入血液循环,一部分转化为尿酸,但是大部分的氨气存留在肉鸡血液中,升高了血氨浓度。高血氨可能影响肉鸡的能量代谢。乳酸是糖酵解的产物,本研究发现氨气应激导致肉鸡血清乳酸含量显著降低,表明在氨气刺激条件下肉鸡的糖酵解途径被减弱。有研究表明,PM2.5应激导致大鼠血清和肝脏乳酸含量显著降低^[26,27]。结合本试验结果,表明环境污染可能导致糖酵解代谢通路发生改变,影响机体能量代谢。三羧酸循环（tricarboxylic acid,TCA）是三大营养物质氧化供能的共同代谢途径,是机体能量代谢水平的综合反映,其中α-酮戊二酸（alpha-ketoglutarate,AKG）是TCA重要中间代谢产物,在能量代谢中起到关键作用。有研究发现,脂肪肝^[28]或慢性心衰^[29]导致血液中的α-酮戊二酸含量升高。本试验结果显示,试验组肉鸡的血清α-酮戊二酸含量显著升高,可能由于肉鸡长期缓慢吸入有害气体,对心脏和肝脏等器官造成损伤,出现糖代谢和脂肪代谢紊乱。但也有研究发现^[30],高血氨使体外培养的人原代肝细胞代谢产物柠檬酸、α-酮戊二酸和苹果酸等表达水平显著降低。这种差异与处理因素、作用时间、剂量以及靶器官相关,具体途径需有针对性的深入研究。

张西雷等^[31]报道,舍内高浓度氨气（770 mg·kg^-1）显著升高肉鸡血清总蛋白、球蛋白含量,表明高浓度氨气影响肉鸡的蛋白质代谢。氨基酸是构成蛋白质的基本组分,是机体内许多重要的含氮化合物的前体物质,还是构成机体免疫系统的基本物质。本研究发现慢性氨气应激导致肉鸡血清L-别苏氨酸、L-高丝氨酸、烟酰甘氨酸含量显著升高。有研究表明,肝性脑病患者血清中别苏氨酸含量升高^[32];糖尿病大鼠血清高丝氨酸含量显著升高^[33];烟酰甘氨酸是烟酸与甘氨酸结合产物,是代谢综合征的潜在生物标志物,糖尿病患者烟酰甘氨酸含量显著升高^[34]。本试验结果显示,慢性氨气应激影响肉鸡氨基酸代谢,以及肉鸡糖代谢,说明氨气影响了肝脏功能,导致肉鸡亚健康并诱发潜在疾病。

研究表明,随着氨气浓度的升高,肉鸡血清中高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和高、低密度脂蛋白胆固醇之比呈线性增加,当氨气浓度达到75 mg·kg^-1时,血清中HDL-C含量显著升高^[35];此外,氨气应激显著改变肉鸡腿肌脂肪酸组成,进而影响肉鸡的脂肪代谢^[36]。陈威妮等^[37]研究报道,糖尿病患者体内具有较高的游离脂肪。郭延生等^[38]研究发现,热应激导致奶牛血液亚麻酸、亚油酸、棕榈酸等含量显著升高,表明应激奶牛通过增强脂肪酸β-氧化,释放大量的能量来抵抗应激。本试验结果显示,慢性氨气应激导致肉鸡血清硬脂酸、亚麻酸、亚油酸、反式-9-十八碳烯酸、棕榈酸、十八烯酸、花生四烯酸、D-甘油酸、胆固醇等含量显著升高,脂质代谢出现紊乱,这可能由于氨气应激导致能量负平衡,进而引发机体的脂肪动员。代谢物通路分析表明,氨气慢性应激影响了肉鸡的脂肪代谢通路,主要是亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢和花生四烯酸代谢等。此外,本试验还发现慢性氨气应激导致肉鸡血清中2-羟基丁酸和3-羟基丁酸含量显著升高。2-羟基丁酸是由α-酮丁酸产生的,后者与苏氨酸、蛋氨酸以及谷胱甘肽代谢有关^[39],本试验2-羟基丁酸含量的增加可能是由于慢性氨气应激使肉鸡氧化应激加强^[6],后者导致肝脏谷胱甘肽合成增加,以及胰岛素抵抗引起脂肪氧化增加引起的^[40]。3-羟基丁酸是脂肪酸在肝脏氧化分解产生的代谢物,是线粒体氧化还原状态的标识物,其含量高低反映肝脏中的脂肪酸氧化以及生酮氨基酸分解代谢^[41]。本试验3-羟基丁酸水平升高,表明肝脏脂类代谢异常,可能是由于氨气应激引起TCA障碍而导致肝脏脂肪动员增加,肝外组织能量利用障碍,因此,慢性氨气应激与机体氧化应激反应有关,造成机体脂肪代谢异常。

尿酸是由嘌呤类核苷酸在酶的作用下生成的代谢物。魏凤仙等研究表明,高氨显著升高肉仔鸡血清尿酸含量^[42]。姚中磊等^[43]研究报道,随鸡舍中氨气浓度的升高,肉鸡血清尿酸浓度逐渐升高。王琼叶等^[30]利用人原代肝细胞建立了高血氨细胞模型,发现高氨处理使黄嘌呤和尿嘧啶、胞嘧啶等水平降低。本研究发现氨气应激导致肉鸡血清次黄嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶等含量显著降低,与上述研究结果相似,表明慢性氨气应激使嘌呤嘧啶代谢受到影响。

4 结论

本试验研究了慢性氨气应激条件下肉鸡血清小分子代谢物的改变,总共筛选到 23个差异代谢物,主要涉及脂肪代谢、糖代谢、氨基酸代谢和核酸代谢等。代谢物通路分析表明,氨气应激主要影响了肉鸡的脂肪代谢通路,为今后深入探讨氨气影响肉鸡健康的机制,改善养殖环境,提高畜禽抗病能力提供了新的方向。

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被引期刊影响因子

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乔娜, 干驰, 朱佳琪, 徐旭俊, 陈建泉, 成国祥 . 转hLF基因山羊血液生理生化指标检测分析
南京农业大学学报, 2016, ( 3):483-487.