石甜甜¹, 何杰丽², 高志军³, 陈凌⁴, 王海岗⁴, 乔治军^,4, 王瑞云^,1,41 山西农业大学农学院,山西太谷030801
2 山西农业大学文理学院,山西太谷030801
3 内蒙古鄂尔多斯市农牧业科学研究院,内蒙古鄂尔多斯017000
4 山西省农业科学院农作物品种资源研究所/农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室/杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室,太原 030031

Genetic Diversity of Common Millet Resources Assessed with EST-SSR Markers

SHI TianTian¹, HE JieLi², GAO ZhiJun³, CHEN Ling⁴, WANG HaiGang⁴, QIAO ZhiJun^,4, WANG RuiYun^,1,4 1 College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi
2 College of Arts and Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi
3 Erdos Institute of Agriculture and Animal Husbandry, Erdos 017000, Inner Mongolia
4 Institute of Crop Germplasms Resources of Shanxi Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau, Ministry of Agriculture, Taiyuan 030031

通讯作者: 王瑞云,Tel：15234420135;E-mail：wry925@126.com乔治军,Tel：0351-7065530;E-mail：nkypzs@126.com

责任编辑: 李莉
收稿日期:2019-06-13接受日期:2019-08-17网络出版日期:2019-11-16

基金资助:

现代农业产业技术体系建设专项.CARS-06-13.5-A16 国家自然科学基金.31271791 山西省回国留学人员科研资助项目.2016-066 山西省重点研发计划(一般项目)(农业)项目.201803D221008-5 2019山西省研究生创新项目.2019SY202

Received:2019-06-13Accepted:2019-08-17Online:2019-11-16
作者简介 About authors
石甜甜,Tel：15234420893;E-mail：tt15234420893@163.com









摘要
【目的】用微卫星标记分析糜子种质资源（国内外6个不同生态区）的遗传多样性水平,揭示不同来源糜子种质资源的亲缘关系和遗传结构差异,便于对糜子资源分类和优异种质的筛选利用。【方法】 用144个（高、低碱基序列重复分别为64和80个）SSR标记评估96份国内外（国内、国外分别为71和25份）糜子资源;用PowerMarker 3.25和PopGen 1.32计算遗传多样性参数,用MEGA 5.0和Structure 2.2进行遗传距离和结构聚类,用Ntsys 2.11进行主成分分析。【结果】 144个EST-SSR标记共检测出368个观测等位变异（Na）,每个位点检测到等位变异2—3个,平均为2.5556个;观测杂合度（Ho）为0.4070（RYW15）—0.9789（RYW85）,平均为0.8288;期望杂合度（He）为0.4369（RYW59）—0.6693（RYW58）,平均为0.5535;Nei's基因多样性指数（Nei）为0.4344（RYW59）—0.6653（RYW58）,平均为0.5505;多态性信息含量（PIC）为0.1811（RYW68）—0.7508（RYW58）,平均为0.4279。Shannon多样性指数（I）为0.6474—1.0956,平均为0.8415。就6个生态区材料的遗传多样性参数而言,北方春糜子区材料的PIC值和Shannon多样性指数最高,西北春夏糜子区材料最低。就不同生态区糜子种质间的遗传距离和遗传一致度而言,不同生态区糜子种质间的遗传距离为 0.0111—0.1425,遗传一致度为 0.8672—0.9889,北方春糜子区和黄土高原春夏糜子区间遗传距离最小和遗传一致度最高,西北春夏糜子区和华北夏糜子区间遗传距离最大。基于UPGMA聚类将试验材料划归3个类群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）。类群Ⅰ主要为北方春糜子区材料;类群Ⅱ主要为国外材料;类群Ⅲ主要为北方春糜子区和黄土高原春夏糜子区材料;基于Structure聚类将糜子资源划归4个群组,红色群组,主要为北方春糜子区和黄土高原春夏糜子区材料,代表北方和黄土高原基因库;绿色群组,主要为北方春糜子区材料,代表北方基因库;蓝色群组,主要包括黄土高原春夏糜子区材料,代表黄土高原基因库;黄色群组,代表国外基因库。就各分类群的遗传多样性参数而言,群组Ⅱ的PIC值最大（0.4606）,群组Ⅳ最小（0.3539）;主成分分析将试材划归6类,与其地理来源一致。【结论】 144个SSR标记可以准确评估96份糜子资源的遗传变异,基于不同依据划分的类群与6个生态区材料的地理来源基本一致,北方春糜子区材料的遗传多样性较丰富。
关键词： 糜子;SSR;聚类分析;遗传结构;主成分分析

Abstract
【Objective】The objective of this study is to analyze the genetic diversity and relationship of common millet accessions (six different ecotopes at home and abroad) by microsatellite markers, to provide available data for classification, selection and utilization of elite germplasm resources. 【Method】 One hundred and forty-four SSRs (64 high motif nucleotide sequence repeat and 80 low ones) are used to identify polymorphisms in ninety-six common millet accessions (71 home accessions and 25 abroad accessions). Genetic diversity parameters were calculated using software PowerMarker 3.25 and PopGen 1.32. Genetic distance and Structure on accessions were classified with software MEGA 5.0 and Structure 2.2, respectively. PCA (principal component analysis) was conducted by software Ntsys 2.11. 【Result】 Using 144 EST-SSR markers, a total of 368 observed alleles (Na) were detected with 2-3 alleles (mean = 2.5556) per locus. The observed heterozygosity (Ho) ranged from 0.4070 (RYW15) to 0.9789 ( RYW85) with an average of 0.8288. The expected heterozygosity (He) ranged from 0.4369 ( RYW59) to 0.6693 ( RYW58) with an average of 0.5535. The Nei's gene diversity index ranged from 0.4344 (RYW59) to 0.6653 (RYW58) with a mean of 0.5505. The polymorphism information content (PIC) ranged from 0.1811 (RYW68) to 0.7508 (RYW58) with an average of 0.4279. The Shannon diversity index (I) range was 0.6474 to 1.0956 with an average of 0.8415. In the case of genetic diversity parameters, the PIC and I of common millet accessions from Northern spring-sowing region were the most abundant than that of others. On the contrary, the accessions from Northwest spring & summer-sowing region were the lowest. For the different geographical regions accessions, the range of genetic distance was 0.0111 to 0.1425 and the scope of genetic consistency was 0.8672 to 0.9889. The genetic distance of accessions between Loess Plateau spring & summer-sowing region and Northern spring-sowing region was the least and their genetic consistency was the highest. The genetic distance between Northwest spring & summer-sowing region and North of China summer-sowing region was the largest and their genetic consistency was the lowest. UPGMA analysis divided 96 accessions into three groups (GroupⅠ, Ⅱ and Ⅲ). Group I were mainly Northern spring-sowing region common millet, Group Ⅱ were mainly foreign accessions, and Group Ⅲ were mainly Loess Plateau spring & summer-sowing region and Northern spring-sowing region accessions. Structure cluster divided resources into four groups. The red group contained Loess Plateau spring & summer-sowing region and Northern spring-sowing region accessions, which represented the gene pool of Loess Plateau and North. The green group included Northern spring-sowing region accessions, which represented the North gene pool. The blue group were Loess Plateau spring & summer-sowing region accessions, which represented the gene pool of Loess Plateau. The yellow group represented foreign gene pool. In terms of diversity parameters, the PIC value of GroupⅡwas the highest at 0.4606 and the Group Ⅳ was the lowest at 0.3539. The PCA analysis classified all accessions into six clusters, which are related to their geographical region. 【Conclusion】144 SSRs can evaluate 96 common millet resources accurately. The genetic relationships are related to their geographical region. Genetic diversity of accessions from Northern spring-sowing region are more abundant.
Keywords：common millet;SSR;cluster analysis;genetic structure;principal component analysis


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石甜甜, 何杰丽, 高志军, 陈凌, 王海岗, 乔治军, 王瑞云. 利用EST-SSR评估糜子资源遗传差异[J]. 中国农业科学, 2019, 52(22): 4100-4109 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.22.014
SHI TianTian, HE JieLi, GAO ZhiJun, CHEN Ling, WANG HaiGang, QIAO ZhiJun, WANG RuiYun. Genetic Diversity of Common Millet Resources Assessed with EST-SSR Markers[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2019, 52(22): 4100-4109 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.22.014

0 引言

【研究意义】糜子(Panicum miliaceum L.)属禾本科黍属,又称黍稷或糜黍,抗旱耐瘠,在中国、俄罗斯、印度和美国主要用作粮食和饲料^[1,2,3]。随着全球气温日益变暖、未来环境渐趋干旱,作为哺育中华民族的载体作物和战略储备作物,糜子在保障国际粮食安全中起重要作用^[4]。了解糜子种质现状,准确评估资源遗传背景,有助于加速糜子优异种质的发掘,并为其高效利用提供理论基础。【前人研究进展】糜子分布广,种植历史超过一万年,是中国北方冷凉地区的主粮,也是美国大平原小麦旱作农业系统中的轮作作物^[5,6]。在印度国际半干旱热带作物研究所（International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics,ICRISAT）和中国农业科学院种质资源研究所国家种质资源库（Institute of Crop Germplasm Resources, Chinese Academy of Agricultural Sciences,ICGR- CAAS）分别保存有29 000余份和9 885份糜子^[2,3]。首先,基于表型性状调查,发现糜子农艺性状遗传多样性丰富。2008年,对8 016份（来自ICGR-CAAS）糜子资源的11个农艺性状进行主成分和聚类分析,结果归纳为8个主成分,聚为5个群组,群组4综合性状表现较好^[7]。2016年,调查8 515份糜子资源（来自ICGR-CAAS）的7个农艺性状,发现株高为80—200 cm,野生型偏低,农家种偏高;落粒性程度（轻度<5%,中度6%—10%,重度>11%）的分布呈区域性差异,轻度落粒性和株高较高（高产潜势）存在协同选择效应（植株越矮,落粒程度越严重）^[8]。2019年,调查849份糜子资源（来自ICRISAT）的18个农艺性状,发现播种至开花的时间为26—50 d,株高为20—133 cm（平均62 cm）,穗长为22—400 mm（平均209 mm）^[2]。第二,基于基因型检测,鉴定到糜子资源存在诸多遗传差异。简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）在基因组中含量丰富、多态性高、重复性好,是研究群体遗传变异常用的分子检测工具,已广泛用于高粱等作物的遗传多样性评估^{[9,10,11,12,13]}。2009年,用46个糜子非特异性SSR分析118份糜子资源（中国110份、美国6份和俄罗斯2份）,发现黄土高原生态栽培区材料的遗传多样性最丰富^[14]。2010年,基于基因组DNA富集SSR文库,25个糜子特异性微卫星标记首次被开发^[15]。2011年,用其中16个标记分析98份欧亚大陆糜子资源,发现基于遗传距离划分的东部和西部2个群组与地理来源相符,东部类群进一步划分为4个亚类群或基因库,而西部类群划分为2个亚类群。东部群组的材料来源于中国、蒙古、尼泊尔、印度东北部、俄罗斯远东地区、韩国和日本,西部群组的材料来源于乌克兰、俄罗斯北高加索、俄罗斯欧洲大陆部分、中亚、印度西北部、巴基斯坦、中国和蒙古^[16]。2015年,用其中19个标记分析来自7个地理群组的96份（95份来自中国6个省,1份来自俄罗斯）糜子资源,发现山西资源的遗传多样性最丰富^[17]。2017年,对其中的15个标记标注荧光后,检测来源于中国11个省/自治区的132份糜子资源,获得107个等位变异,平均每个位点为7个,中国资源来自4个基因库（东北地区、黄土高原、北方地区和西北地区）,其丰富的遗传变异主要存在于材料间^[18]。2018年,用其中16个SSR和2个GBSSI标记分析341份欧亚大陆糜子资源（195份来自中国）,发现黄土高原西部为糜子的主要驯化地^[19]。近年来,利用转录组测序手段,构建出一批糜子中开发的EST-SSR,基于这些标记进行了一系列糜子遗传多样性研究。2016年,利用67个SSR分析来自中国7个糜子主产区的88份糜子资源,检测到179个等位变异,基于遗传距离将试材聚为4个群组^[20]。同年,利用63个SSR评估来自国内外10个不同地理来源群体的192份糜子资源,检测到161个等位变异,平均PIC值为0.4855,发现内蒙、东北和黄土高原地区种质资源遗传多样性最丰富^[21]。2017年,基于85个高基元SSR标记扩增中国6个糜子生态栽培区的96份糜子资源,检测到232个等位变异,发现黄土高原春夏糜子区和北方春糜子区资源遗传多样性最丰富^[22]。2018年,用103个SSR评估国内外12个群体的146份糜子资源（85份国内野生资源和61份国外地方品种）,检测到308个等位变异,PIC为0.5544,发现中国河北群体的遗传多样性最丰富^[23];对雁黍5号进行高通量测序,挖掘到8 139个全基因组EST-SSR,这些标记有望用于农艺性状定位、连锁图谱构建和分子育种等遗传研究^[24]。【本研究切入点】丰富的糜子资源在旱作生态农业建设中起重要作用,而搞清其遗传背景是合理利用的前提。但作为小宗作物,其遗传多样性评估研究偏少,亟待深入开展。【拟解决的关键问题】本研究利用144个糜子中开发的EST-SSR标记评估96份国内外糜子资源,搞清不同生态区资源的遗传差异,为糜子优异种质的鉴定和筛选提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试材为来自国内5个生态区和国外的96份糜子资源（表1,电子附表1）。

Table 1
表1
表1糜子资源的生态区分布
Table 1Ecotope distribution of common millet accessions in this study

生态区 Ecotope	来源 Origin	数量 Accession number
北方春糜子区 NSP	中国青海 Qinghai, China	3	30
	中国甘肃 Gansu, China	9
	中国内蒙古 Inner Mongolia, China	12
	中国山西 Shanxi, China	6
西北春夏糜子区 NWSS	中国新疆 Xinjiang, China	3	3
黄土高原春夏糜子区 LPSS	中国山西 Shanxi, China	13	26
	中国陕西 Shaanxi, China	7
	中国宁夏 Ningxia, China	6
东北春糜子区 NES	中国黑龙江 Heilongjiang, China	1	4
	中国吉林 Jilin, China	2
	中国辽宁 Liaoning, China	1
华北夏糜子区 NSU	中国河北 Hebei, China	6	8
	中国河南 Henan, China	1
	中国山东 Shandong, China	1
国外 Abroad	印度India	22	25
	波兰Poland	3
合计Total		96

NSP: Northern spring-sowing ecotope; NWSS: Northwest spring & summer-sowing ecotope; LPSS: Loess plateau spring & summer-sowing ecotope; NES: Northeast Spring-sowing ecotope; NSU: Northern Summer-sowing ecotope. The same as below
NSP：北方春糜子区;NWSS：西北春夏糜子区;LPSS：黄土高原春夏糜子区;NES：东北春糜子区;NSU：华北夏糜子区。下同

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1.2 方法

1.2.1 DNA提取及其质量检测 剪取三叶期糜子叶片,提取基因组DNA,用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,用核酸检测仪测定DNA的纯度。

1.2.2 PCR反应体系及扩增程序 用山西农业大学糜子分子育种实验室构建的SSR引物（电子附表2）在BIO-GENER基因扩增仪（GT9612）上扩增糜子材料,反应总体积为20 μL：DNA模板1 μL、2×工员MasterMix（中科瑞泰2×Taq PCR MasterMix）10 μL、前后引物各0.8 μL和ddH₂O 7.4 μL。PCR程序为94℃ 5 min;94℃ 40 s,退火40 s,72℃ 1 min,36个循环;72℃ 10 min。银染检测PCR产物。

1.2.3 数据统计与分析 读取电泳结果,同一位置有扩增条带的记为1,否则记为0,在Excel中将整理好的（0,1）原始矩阵数据转换成不同软件相应格式。

用PowerMarker 3.25^[25]和PopGen1.32^[26]计算遗传多样性衡量指标,用MEGA5.0^[27]和Structure2.2^[28]分别基于遗传距离和结构构建聚类图。用Ntsys2.11^[29]进行主成分分析。

2 结果

2.1 SSR标记的多态性分析

用144对糜子中开发的引物评估糜子资源的遗传多样性（电子附表3）,结果发现96份材料在144个位点共检出368个观测等位变异,每个位点检测到2—3个,平均为2.5556个;Shannon多样性指数为0.6474（RYW92）—1.0956（RYW58）,平均为0.8415;观测杂合度为0.4070（RYW15）—0.9789（RYW85）,平均为0.8288;期望杂合度为0.4369（RYW59）—0.6693（RYW58）,平均为0.5535;Nei's基因多样性指数为0.4344（RYW59）—0.6653（RYW58）,平均为0.5505;多态性信息含量为0.1811（RYW68）—0.7508（RYW58）,平均为0.4279。

分析不同生态区糜子资源的遗传多样性参数（表2）,发现就PIC值和Shannon多样性指数而言,北方春糜子区材料最高,西北春夏糜子区材料最低,说明前者遗传多样性丰富。分析不同生态区糜子资源的遗传距离与遗传一致度参数（表3）,发现北方春糜子区和黄土高原春夏糜子区间的遗传距离最小、遗传一致度最高,西北春夏糜子区和华北夏糜子区间的遗传距离最大、遗传一致度最低,表明地理位置越近,亲缘关系越近,遗传相似性越高;地理位置越远,亲缘关系越远,遗传相似性越低。

Table 2
表2
表2不同生态区糜子的遗传多样性参数
Table 2Parameters of genetic diversity of common millet populations

来源地 Origin	资源数 Sample	观测等位变异 Na	有效等位变异 Ne	Shannon多样性指数 I	观测杂合度 Ho	期望杂合度 He	多态性信息含量 PIC
北方春糜子区NSP	30	2.5069±0.5017	2.269±0.3391	0.8393±0.1623	0.8221±0.1358	0.5596±0.0649	0.4259
西北春夏糜子区NWSS	3	2.2778±0.4796	2.0895±0.4045	0.7530±0.1977	0.7928±0.2824	0.6097±0.1324	0.2898
黄土高原春夏糜子LPSS	26	2.5069±0.5017	2.2345±0.3050	0.8288±0.1516	0.8362±0.1255	0.5557±0.0593	0.3878
东北春糜子区NES	4	2.3333±0.5017	2.1077±0.4075	0.7657±0.2028	0.7894±0.2481	0.5824±0.1223	0.3196
华北夏糜子区NSU	8	2.4375±0.4978	2.1687±0.3530	0.7998±0.1683	0.8038±0.1752	0.5643±0.0827	0.3637
国外Abroad	25	2.5000±0.5017	2.2125±0.3135	0.8191±0.1520	0.8478±0.1320	0.5508±0.0628	0.3719

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Table 3
表3
表3不同群体糜子资源的遗传距离与遗传一致度
Table 3Genetic distance and genetic identity of common millet resources with different population

生态区 Ecotope	北方春糜子区 NSP	西北春夏糜子区 NWSS	黄土高原春夏糜子区 LPSS	东北春糜子区 NES	华北夏糜子区 NSU	国外 Abroad
北方春糜子区NSP		0.9264	0.9889	0.9420	0.9703	0.9800
西北春夏糜子区NWSS	0.0764		0.9320	0.9018	0.8983	0.9169
黄土高原春夏糜子区LPSS	0.0112	0.0704		0.9438	0.9715	0.9822
东北春糜子区NES	0.0598	0.1033	0.0578		0.9362	0.9311
华北夏糜子区NSU	0.0301	0.1072	0.0290	0.0660		0.9671
国外Abroad	0.0202	0.0867	0.0180	0.0714	0.0335

Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)
Nei氏遗传一致度（对角线以上）和遗传距离（对角线以下）

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2.2 不同糜子资源的聚类分析

基于UPGMA对材料进行聚类分析（图1）。可以看出,96份糜子划分为3个类群（类群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）。类群Ⅰ共24份,主要为北方春糜子区材料（12份）;类群Ⅱ共38份,主要为国外材料;类群Ⅲ共34份,主要为北方春糜子区和黄土高原春夏糜子区材料。

图1

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图196份糜子种质资源聚类图

▲国外Abroad;◇华北夏糜子区Northern Summer-sowing ecotope;▉西北春夏糜子区Northwest spring & summer-sowing ecotope;□北方春糜子区Northern spring-sowing ecotope;●黄土高原春夏糜子区Loess plateau spring & summer-sowing ecotope;○东北春糜子区Northeast Spring-sowing ecotope
Fig. 1Cluster diagram of 96 accessions of common millet

2.3 基于模型的糜子遗传群体结构分析

通过对96份供试材料进行遗传群体结构分析（图2）,发现Delta K在K=4处出现峰值,将供试材料分为4个群组（图3）。红色群组（26份）,主要为北方春糜子区和黄土高原春夏糜子区材料,代表北方和黄土高原基因库;绿色群组（12份）,主要为北方春糜子区材料,代表北方基因库;蓝色群组（18份）,主要包括黄土高原春夏糜子区材料,代表黄土高原基因库;黄色群组（40份）,代表国外基因库。

图2

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图2运用 Structure对糜子基因库数目建模

Fig. 2Modelling genepools’ number in common millet accessions by Structure

图3

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图3糜子种质资源群体遗传结构图（K=4）

横坐标的数字代表糜子材料序号
Fig. 3Population genetic structure graph of common millet germplasm resources (K=4)

Numbers in the horizontal axis represent serial number of accession


分析K=4遗传结构图各分类群的遗传多样性参数（表4）,发现就PIC值而言,群组Ⅱ最大（0.4606）,群组Ⅳ最小（0.3539）。

Table 4
表4
表4各遗传结构群体的多样性参数
Table 4Genetic diversity parameters of different common millet structure cluster

群组 Cluster	资源数 Accessions	观测等位变异 Na	有效等位变异 Ne	Shannon多样性指数 I	观测杂合度 Ho	期望杂合度 He	多样性信息含量 PIC
Ⅰ	26	2.4931±0.5017	2.2437±0.3440	0.8281±0.1632	0.8251±0.1352	0.5554±0.0676	0.4052
Ⅱ	12	2.4931±0.5017	2.2379±0.3710	0.8285±0.1717	0.7677±0.1929	0.5663 ±0.0777	0.4606
Ⅲ	18	2.5347±0.5005	2.2271±0.3292	0.8292±0.1563	0.8181±0.1429	0.5576±0.0663	0.4165
Ⅳ	40	2.5069±0.5017	2.2264±0.2962	0.8256±0.1484	0.4495±0.1167	0.5434±0.0577	0.3539

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2.4 主成分分析

对供试材料进行PCA分析（图4）,可以看出,96份资源划归6个类群（G1—G6）,G1有30份,均来自北方春糜子区;G2有3份,均来自西北春夏糜子区;G3有26份,均来自黄土高原春夏糜子区;G4有4份,均来自东北春糜子区;G5有8份,均来自华北夏糜子区;G6有25份,全为国外材料。

图4

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图496份糜子资源遗传多样性的主成分分析

Fig. 4Principle component analysis of 96 common millet accessions



前3个主成分PC1、PC2和PC3分别解释总变异的21.21%、3.17%和2.35%,总变异26.73%。

3 讨论

在作物资源的遗传多样性评估中,基于遗传距离和结构划分的类群,常发生交叉现象或出现个别例外,这在三大粮食作物中均有体现,而运用PCA分析则可以得到合理解释^[30,31,32]。2010年,基于359个SSR评估1 537份优良玉米自交系种质的群体结构和遗传多样性,发现基于遗传结构与遗传距离的聚类结果基本一致,但也出现个别例外。如遗传结构群组G3主要由Flint组成,但1份Stiff Stalk材料也划归其中;而Lancaster材料则在4个群组（G1—G4）中均有分布。主成分分析则将上述特例划归相应群组。2019年,王舒婷等^[33]基于27个微卫星标记分析57份山西糜子资源的遗传特性,基于UPGMA聚类,类群Ⅱ主要为黄土高原春夏糜子区材料,但北方春糜子区材料（13号忻州定襄大红黍）也划归其中;而黄土高原春夏糜子区的材料则在3个类群中均有分布。基于Structure聚类,红色群组主要为黄土高原春夏糜子区基因库,但北方春糜子区材料（7号朔州白糜子）也划归其中;而北方春糜子区材料（如7号、1号和3号）在红、绿和蓝色群组均有分布。但利用PCA分析却将上述个例划归相应类群,如13、7、1和3号材料均归于PC1中,黄土高原春夏糜子区材料均归于PC2中。本研究也得到了类似的结果,基于UPGMA聚类,群组Ⅱ主要为国外材料,但一份山东资源（54号山东益都黑黍子）也划归其中;而山西材料则分布在3个群组,并未归于同一群组。基于Structure聚类,黄色群组主要为黄土高原夏糜子区基因库,但2份新疆资源（12号红糜和13号黄糜）也划归其中;而陕西材料在4个群组中均有分布。而主成分分析则将试材划分为6个类群,合理解释了上述资源划分出现交叉的现象,聚类群组中的特例在PCA中均划归到相应类群,如国外材料都归于G6中,山东资源（54号山东益都黑黍子）划分到G5中,山西资源均划归在G3中,新疆、陕西材料则分别G2和G3中。

作为简单序列重复的DNA标记,基于序列来源,SSR分为基因组SSR（genomic SSR/G-SSR）和表达序列标签SSR（expressed sequence tag-SSR/EST-SSR）。与G-SSR相比,EST-SSR具可在物种间进行转移的优势,已广泛应用于遗传连锁图谱构建、种质资源鉴定和遗传多样性分析等方面^{[21-23, 34-36]}。2011年,用G-SSR与EST-SSR评估5个杨树不同种的15份资源的遗传差异,结果发现EST-SSR比G-SSR在杨树种间通用性更好、揭示的遗传多样度更高,聚类分析表明EST-SSR能更准确反映杨树不同种间的遗传差异和亲缘关系^[35]。对小麦（Triticum aestivum L.）、水稻（Oryza sativa L.）、毛果杨（Populus trichocarpa）和木豆（Cajanus cajan（L.）Millspaugh）的研究发现,SSR开发中多态性得率介于10%—83.8%^{[37,38,39,40]}。2010年,CHO等^[15]运用改进的生物素-链霉亲和素捕捉法,经过酶消化、杂交和磁珠吸附等一系列程序,从糜子基因组DNA中构建了含有504个推定重组克隆的SSR富集文库;去除24个冗余序列后,发现480个特异克隆中有157个为SSR克隆,设计143对引物进行多态性筛选获得25个多态性G-SSR（2、3、4核苷酸序列重复SSR分别为9、13和3个）,多态性得率为17.4%。2017年,刘笑瑜^[34]基于糜子（黄糜子（00005272）、镇原大糜子（00002942）、287（00002661）、老糜子（00005435））转录组测序结果,从151对引物中筛选出有扩增条带的126对,其中85对具多态性EST-SSR,多态性得率56.3%。2018年,JIANG等^[24]从8 734对引物中设计了8 139对,随机选取24对,发现21对有扩增条带,3对具多态性,多态性得率12.5%。本研究所用标记的多态性得率为47%（高、低基元碱基重复多态性得率分别为56.3%和40%）,高于JIANG等^[24]、低于刘笑瑜^[34]的研究结果,这与前者所用标记基本为低基元（2、3碱基重复分别为11.1%和83.6%）、多态性得率低,而后者所用标记全部为高基元、多态性得率高有关。

4 结论

144个EST-SSR可以准确评估96份国内外糜子资源,基于不同依据划分的类群与6个生态区材料的地理来源基本一致,北方春糜子区材料的遗传多样性较为丰富。

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