沙葱萤叶甲气味结合蛋白GdauOBP20的基因克隆、原核表达及其结合特性

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李玲, 谭瑶, 周晓榕, 庞保平^,内蒙古农业大学草原昆虫研究中心,呼和浩特 010020

Molecular Cloning, Prokaryotic Expression and Binding Characterization of Odorant Binding Protein GdauOBP20 in Galeruca daurica

LI Ling, TAN Yao, ZHOU XiaoRong, PANG BaoPing^,Research Center for Grassland Entomology, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010020

通讯作者: 庞保平,E-mail：pangbp@imau.edu.cn

责任编辑: 岳梅
收稿日期:2019-03-11接受日期:2019-04-18网络出版日期:2019-10-16

基金资助:

国家自然科学基金.31360441

Received:2019-03-11Accepted:2019-04-18Online:2019-10-16
作者简介 About authors
李玲,E-mail：279165876@qq.com。

摘要
【目的】 沙葱萤叶甲（Galeruca daurica）是近年来在内蒙古草原上暴发成灾的新害虫,本文旨在克隆沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20的cDNA全长序列,明确其重组蛋白与寄主植物挥发物的结合特性,为揭示沙葱萤叶甲嗅觉的分子机理打下基础。【方法】 基于沙葱萤叶甲转录组数据,利用RACE技术对沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20进行cDNA全长克隆;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;通过原核表达系统表达目的蛋白,并使用Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行重组蛋白纯化。最后采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN）为荧光探针,检测GdauOBP20重组蛋白与13种主要寄主挥发物的结合情况。【结果】GdauOBP20的cDNA全长序列为567 bp（GenBank登录号MK250532）,其中5′末端非编码区长24 bp,3′末端非编码区长123 bp,具有ployA尾结构;开放阅读框（ORF）全长为420 bp,编码139个氨基酸。氨基酸序列中含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。预测蛋白三级结构中含有6个α螺旋和两对由半胱氨酸形成的二硫键。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。重组蛋白GdauOBP20与荧光探针1-NPN的结合常数为12.8 μmol·L ^-1,结合能力较好,可作为本试验的荧光报告子。在所测的13种主要寄主植物挥发物中,除与二烯丙基三硫醚无结合能力外,GdauOBP20重组蛋白与其他12种寄主植物挥发物均有不同程度的结合能力,其中与对二甲苯和环庚三烯的结合能力最强,解离常数分别为22.91和26.55 μmol·L ^-1,而与月桂烯结合能力最弱,解离常数为116.29 μmol·L ^-1。【结论】 沙葱萤叶甲GdauOBP20能与寄主植物的多种主要挥发性物质结合,推测其可能在沙葱萤叶甲对寄主植物的定位过程中发挥重要的作用。
关键词： 沙葱萤叶甲;气味结合蛋白;RACE克隆;原核表达;荧光竞争结合试验

Abstract

【Objective】Galeruca daurica is a new pest with outbreak status in the Inner Mongolia grasslands in recent years. The objective of this study is to clone the full-length cDNA sequence of GdauOBP20, and clarify the binding property of the recombinant protein to main host plant volatiles, which will lay a necessary foundation for revealing the molecular mechanism of olfaction in G. daurica.【Method】 RACE technique was used to clone the full-length cDNA of GdauOBP20 based on the transcriptome database of G. daurica. The physicochemical properties and structural characteristics of the encoded protein were predicted and analyzed by bioinformatics software. The recombinant protein GdauOBP20 was induced to express by constructing prokaryotic expression system, and purified by using the Ni-NTA Agarose affinity column. Finally, the fluorescence competitive assay was applied, and N-phenyl-1-naphthylamine (1-NPN) was selected as the fluorescence probe to measure the binding profiles of GdauOBP20 recombinant protein with 13 main host plant volatiles.【Result】 The full-length cDNA of GdauOBP20 is 567 bp (GenBank accession number: MK250532), with the non-coding regions of 5′ and 3′ ends of 24 bp and 123 bp, respectively, and a ployA tail structure. The open reading frame (ORF) is 420 bp, encoding 139 amino acids. The amino acid sequence of GdauOBP20 contains 4 conserved cysteine residues, indicating that it belongs to Minus-C OBP subfamily. The three-dimensional structure prediction of GdauOBP20 contains six alpha helix and two pairs of disulfide bonds formed by cysteine. The recombinant expression vector was successfully constructed, and the recombinant protein with high purity was obtained. The binding capacity of the recombinant protein GdauOBP20 to the fluorescence probe 1-NPN was strong with a binding constant of 12.8 μmol·L ^-1, indicating that it could be used as the fluorescence reporter in this experiment. Affinities of recombinant protein GdauOBP20 with 13 main host plant volatiles were tested. Among them, except diallyl trisulfide, other 12 volatiles showed certain binding capacities with the recombinant protein, and p-xylene and 1,3,5-cycloheptatriene displayed the strongest affinity with the dissociation constants of 22.91 and 26.55 μmol·L ^-1, respectively, whereas myrcene exhibited the weakest binding affinity with the dissociation constant of 116.29 μmol·L ^-1.【Conclusion】 GdauOBP20 has a certain binding capacity with main host plant volatiles, suggesting that it may play an important role in the localization of host plants.

Keywords：Galeruca daurica;odorant binding protein;RACE cloning;prokaryotic expression;fluorescence competitive binding assay

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李玲, 谭瑶, 周晓榕, 庞保平. 沙葱萤叶甲气味结合蛋白GdauOBP20的基因克隆、原核表达及其结合特性[J]. 中国农业科学, 2019, 52(20): 3705-3712 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.20.020
LI Ling, TAN Yao, ZHOU XiaoRong, PANG BaoPing. Molecular Cloning, Prokaryotic Expression and Binding Characterization of Odorant Binding Protein GdauOBP20 in Galeruca daurica[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2019, 52(20): 3705-3712 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.20.020

0 引言

【研究意义】在昆虫的众多感觉系统中,嗅觉感受系统对于其生命活动起到了至关重要的作用,昆虫通过嗅觉感器接触和分析外界气味信息,从而保证其寻偶、觅食和产卵等生命活动的正常进行^[1,2]。气味结合蛋白（odorant binding protein,OBP）是一类水溶性小分子蛋白,它能选择性地结合并运输疏水性气味分子通过感受器淋巴液到达相应的气味受体,从而产生神经冲动,在化学信号转导过程中起着关键的作用^[2,3,4,5]。研究昆虫OBP与挥发物的结合能力,对揭示其嗅觉机理具有重要意义。【前人研究进展】沙葱萤叶甲（Galeruca daurica）属鞘翅目（Coleoptera）,叶甲科（Chrysomelidae）,萤叶甲亚科（Galerucinae）,是一种主要危害沙葱（Allium mongolium）、多根葱（Allium polyrhizum）、野韭（Allium ramosum）等百合科葱属植物的寡食性害虫,自2009年在内蒙古锡林郭勒盟草原上首次大面积暴发成灾以来,危害程度日益加重,已经成为内蒙古草原上重要的害虫,严重影响了草原的生态环境质量和畜牧业的可持续发展^[6,7]。笔者实验室前期从沙葱萤叶甲成虫转录组中鉴定出29条编码气味结合蛋白的基因,并对它们的表达谱进行了分析,其中GdauOBP20特异性地表达于成虫触角中,表明其可能在沙葱萤叶甲气味识别中起关键作用^[8]。目前对OBP功能的研究多集中于其对不同气味物质结合特性,涉及到的昆虫种类有美洲大蠊（Periplaneta americana）、中华蜜蜂（Apis cerana cerana）、松褐天牛（Monochamus alternatus）、枣实蝇（Carpomya vesuviana）、棉铃虫（Helicoverpa armigera）、美洲斑潜蝇（Liriomyza sativae）、梨小食心虫（Grapholita molesta）及斜纹夜蛾（Spodoptera litture）等^{[9,10,11,12,13,14,15,16]},也有研究者开始应用RNAi^{[17,18,19,20,21]}和CRISPR/Cas9^[22]研究OBP的功能,有助于揭示昆虫的化学感受机理。【本研究切入点】气味结合蛋白在沙葱萤叶甲与环境化学信息交流中起着重要作用,然而,目前对沙葱萤叶甲气味结合蛋白功能的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】采用RACE技术克隆GdauOBP20的cDNA全长序列,并通过构建原核表达载体诱导重组蛋白大量表达,利用荧光竞争结合试验对重组蛋白与寄主植物的主要挥发物的结合能力进行测定,为揭示沙葱萤叶甲嗅觉感受机理打下基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

2017年5月于内蒙古锡林郭勒盟镶黄旗采集沙葱萤叶甲幼虫,置于人工气候培养箱中以沙葱进行饲养。饲养条件为温度（26±1）℃,相对湿度60%—80%,光周期16L﹕8D。待成虫羽化3 d后用手术刀切取雄虫触角,用液氮速冻后存放于-80℃冰箱保存备用。

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

取3日龄雄成虫触角40 mg,液氮迅速冷冻研磨后使用TaKaRa Mini BEST Universal RNA Extraction Kit提取总RNA,分别用1.5%的琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计NanoPhotometer? P 330（Implen,Germany）检测RNA完整性和测定RNA浓度。使用反转录试剂盒PrimeScript^TM1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）合成cDNA第一链。

1.3 GdauOBP20全长cDNA克隆

根据笔者实验室测得的转录组数据筛选并分析得到OBP20的中间片段,在序列两端设计引物（表1）,以雄成虫触角cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系：cDNA模板1 μL,正反向引物各1 μL,Premix Taq^TM（V2.0 plus dye）（TaKaRa）12.5 μL,ddH₂O 9.5 μL。反应条件：94℃预变性3 min;94℃变性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸1 min,30个循环;72℃延伸10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段,连接pMD19-T克隆载体（TaKaRa）,转化到大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞DH5α（TIANGEN）后涂布含氨苄Ampicillin（Amp）的LB固体培养基,37℃培养12 h,挑取白色单菌落进行PCR验证,然后将验证正确的菌液于LB液体培养基中过夜培养,再将菌液进行送样测序。

Table 1
表1
表1本研究所用引物
Table 1Primers used in this study

名称 Name	引物序列Primer sequence (5′-3′)	引物用途 Use of primers
GdauOBP20-5′ GSP	CACGGTCGAAAATTCCTTTTTTGCC	RACE末端扩增 RACE end amplification
GdauOBP20-3′ GSP	TTGGCCCCATCTAAAGTTGCCGACG	RACE末端扩增 RACE end amplification
GdauOBP20-5′ NGSP	TGGATCCGTAATCTCCATTAAGGGA	巢氏PCR Nested PCR
GdauOBP20-3′ NGSP	TGGAGCTTGTCACAACAAAGTCGCA	巢氏PCR Nested PCR
GdauOBP20-F1	ATGTTTCGGGAGCTTCTA	中间片段扩增 Middle fragment amplification
GdauOBP20-R1	TTAGAATATTATAAAGAGTTC	中间片段扩增 Middle fragment amplification
GdauOBP20-F2	AGTCACACACCATGTTTCG	cDNA全长验证 Verification of full-length cDNA
GdauOBP20-R2	GATTTTTATTTATTTCTACAAAGAG	cDNA全长验证 Verification of full-length cDNA
GdauOBP20-F3	GAATTCAATCCCTTAATGGAGAT	原核表达 Prokaryotic expression
GdauOBP20-R3	CTCGAGTTAGAATATTATAAAGAGTT	原核表达 Prokaryotic expression

下划线部分为酶切位点The restriction sites are underlined

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GdauOBP20 3′-和5′-末端序列扩增：根据上一步测序验证结果,设计3′-和5′-特异性引物（表1）,按照SMARTer? RACE 5′/3′ Kit（TaKaRa）试剂盒说明书进行末端扩增,采用降落式PCR程序如下：94℃ 30 s,72℃ 2 min,5个循环;94℃ 30 s,70℃ 30 s,72℃ 2 min,5个循环;94℃ 30 s,68℃ 30 s,72℃ 2 min,20个循环。再以扩增产物为模板进行巢氏PCR,程序如下：94℃ 30 s,68℃ 30 s,72℃ 2 min,25个循环。得到扩增产物处理方法同上。测序得到的3′-、5′-目的片段序列与中间片段进行拼接,最终得到该基因cDNA全长序列。

1.4 GdauOBP20序列的生物信息学分析

使用PredictProtein（https://www.predictprotein. org/）预测氨基酸序列中的二硫键位置和蛋白二级结构;运用在线软件Swiss-Model（https://www. swissmodel.expasy.org/）对蛋白三级结构进行预测。

1.5 GdauOBP20重组蛋白的诱导表达与纯化

根据GdauOBP20开放阅读编码框序列,设计带有Xho I和EcoR I酶切位点的引物（去除信号肽）（表1）。将PCR产物克隆到pMD19-T载体,测序成功的pMD19-T/GdauOBP20质粒和表达载体pET-28a进行双酶切,然后将载体片段与目的片段经T4 DNA Ligase（New England Biolabs,NEB）连接。连接产物转入DH5α后涂布含卡那霉素Kanamycin的LB固体培养基,37℃过夜培养,鉴定为阳性克隆送样测序。将测序验证后的pET28a/GdauOBP20表达质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）（TIANGEN）中,挑取单菌落经PCR鉴定,阳性克隆菌落接种于1 mL LB液体培养基中,37℃振荡过夜培养。次日,将所得菌液按1/100的比例接种于新鲜培养基中,37℃振荡培养,当OD₆₀₀值达到0.6—0.8时,吸取一半的菌液于新的无菌EP管中,加入终浓度为1 mmol·L^-1IPTG,另一半作为阴性对照,37℃振荡培养4 h。用SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况。将表达良好的重组蛋白进行大量诱导,离心收集菌体,经超声波破碎后分别收集上清和沉淀,用SDS-PAGE检测重组蛋白表达形式。

使用Ni-NTA Agarose亲和层析柱（QIAGEN）进行重组蛋白纯化,用3 500 Da的透析袋在PBS缓冲液中过夜透析。经3 000 Da的超滤管浓缩后,用BCA法测定蛋白浓度。

1.6 GdauOBP20重组蛋白的配基结合试验

试验所用荧光探针1-NPN和气味标准品均购自SIGMA-ALDRICH公司,使用色谱级的甲醇配制成1 mmol·L^-1的储备液。用HITACHI（F-7000）荧光分光光度计测定重组蛋白和1-NPN的结合能力。仪器参数设置如下：激发狭缝10 nm,发射狭缝10 nm,灵敏度2 s,激发光波长337 nm,扫描发射光波长范围350—700 nm。取2 mL 2 μmol·L^-1的重组蛋白溶液于1 cm宽的石英比色皿中,逐次加入2 μmol·L^-1 1-NPN直至荧光强度值达到饱和值。每次加入1-NPN后进行扫描并记录荧光值。利用其荧光值计算出该蛋白与1-NPN的结合常数,在GraphPad Prism 7.0软件中进行Scatchard分析。然后通过竞争结合试验测定气味物质和蛋白的结合能力。在竞争结合试验中,将被测气味物质逐次加入重组蛋白GdauOBP20与1-NPN的混合体系中至终浓度为100 μmol·L^-1,每次记录荧光强度值。每个气味重复测定3次。利用公式Ki= IC₅₀/（1+[1-NPN]/K_1-NPN）计算结合常数,其中IC₅₀为荧光强度降至50%时加入的配基浓度,[1-NPN]为未结合的1-NPN浓度,K_1-NPN为重组蛋白GdauOBP20与1-NPN的结合常数^[23]。

2 结果

2.1 GdauOBP20全长cDNA的克隆及序列分析

经3′和5′ RACE克隆和中间片段拼接得到GdauOBP20 cDNA全长序列567 bp（图1）,已在GenBank中注册,登录号为MK250532。其中5′末端非编码区长24 bp,3′末端非编码区长123 bp,具有ployA尾结构。开放阅读框全长420 bp,编码139个氨基酸,含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。蛋白二级结构预测表明,该蛋白中α螺旋（helix）、β折叠（strand）和卷曲环（loop）分别占56.1%、12.9%和30.9%。以西方蜜蜂（Apis mellifera）ASP5（SMTL ID：3r72.1 ）为模板对其进行蛋白三级结构预测,目的蛋白与模板的氨基酸序列相似性为26.09%。模型结果显示GMQE值为0.66,GMEAN值为-2.21,该值>-4.0,说明模型的质量较高^[24]。从图2可以看出,该蛋白含有6个α螺旋,由4个半胱氨酸残基形成的两对二硫键Cys38- Cys69和Cys107-Cys127分别连接着α1-α3和α4-α6,维持着该蛋白空间结构的稳定。

图1

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图1GdauOBP20 cDNA核苷酸序列和氨基酸序列

起始密码子和终止密码子用方框标注,信号肽用下划线标注,保守的半胱氨酸用圆圈标注
Fig. 1Nucleotide and amino acid sequences of GdauOBP20

The start and stop codons are boxed, signal peptide is underlined, and conversed cysteine residues are circled

图2

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图2GdauOBP20蛋白的3-D结构预测模型

Fig. 2Three-dimensional prediction structure of GdauOBP20 protein

2.2 GdauOBP20重组蛋白的表达与纯化

诱导表达结果显示,在15 kD左右出现一条蛋白条带。对重组蛋白进行不同IPTG浓度下诱导表达,结果表明GdauOBP20重组蛋白在IPTG终浓度为0.5—0.8 mmol·L^-1范围内诱导表达效果最好（图3-A）。表达形式检测结果显示,GdauOBP20重组蛋白在上清中不表达,而是存在于沉淀中以包涵体的形式表达（图3-B）。因此,对包涵体进行复性处理后过柱纯化得到GdauOBP20重组蛋白。

图3

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图3GdauOBP20 重组蛋白的诱导表达（A）和分离纯化（B）

M：蛋白分子量标准 Protein molecular weight marker;1：未诱导对照组 Control group without induction;2—6：经不同浓度IPTG诱导的表达产物（0.1、0.5、0.8、1.0、1.5 mmol·L^-1） Expressed products induced by different concentrations of IPTG;7：上清蛋白 Protein in bacterial supernatant;8：包涵体蛋白 Protein in bacterial inclusion;9：纯化的GdauOBP20重组蛋白 Separated and purified recombinant protein GdauOBP20
Fig. 3Expression induced by IPTG (A) and purification (B) of recombinant protein GdauOBP20

2.3 GdauOBP20重组蛋白与配基的结合试验

重组蛋白GdauOBP20与荧光探针1-NPN的结合曲线见图4-A。随1-NPN浓度的增加,荧光强度逐渐增强,多项式拟合相关系数为0.9966,结合常数为12.8 μmol·L^-1。Scatchard分析线性相关系数为0.9414（图4-B）。以1-NPN为探针,测定了13种沙葱挥发物与GdauOBP20重组蛋白的结合能力。结果显示（表2）,除与二烯丙基三硫醚没有结合能力外,GdauOBP20重组蛋白与其他12种寄主植物挥发物均有不同程度的结合能力,其中与对二甲苯的结合能力最强,解离常数K_i值为22.91 μmol·L^-1,其次为环庚三烯,K_i值为26.55 μmol·L^-1。其他10种寄主植物挥发物的结合能力从大到小依次为二甲基三硫醚、二甲基二硫醚、苯甲酸甲酯、2-己烯醛、二烯丙基硫醚、顺-2-己烯-1-醇、己醛、1,3-二噻烷、二烯丙基二硫及月桂烯,K_i值范围为31.01—116.29 μmol·L^-1。

图4

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图4GdauOBP20与1-NPN的结合分析（A、B）及与配基的荧光竞争结合（C、D）

Fig. 4Binding curves of GdauOBP20 to 1-NPN (A, B) and fluorescence competition with ligands (C, D)

Table 2
表2
表2GdauOBP20重组蛋白与所测配基的亲和力
Table 2Binding affinities of selected ligands with recombinant GdauOBP20

化学配基 Chemical ligand	IC₅₀ (μmol·L^-1)	解离常数Ki Dissociation constant (μmol·L^-1)
二烯丙基硫醚 Diallyl sulfide	42.30	42.10
二烯丙基二硫 Diallyl disulphide	50.97	50.73
二烯丙基三硫醚 Diallyl trisulfide	—	—
二甲基二硫醚 Dimethyl disulfide	31.79	31.64
二甲基三硫醚 Dimethyl trisulfide	31.16	31.01
1,3-二噻烷 1,3-Dithiane	49.86	49.63
己醛Hexanal	49.05	48.83
2-己烯醛2-Hexenal	37.97	37.80
苯甲酸甲酯 Methyl benzoate	37.37	37.19
对二甲苯p-Xylene	23.07	22.91
顺-2-己烯-1-醇 (Z)-2-Hexen-1-ol	47.01	46.80
月桂烯Myrcene	116.83	116.29
环庚三烯 1,3,5-Cycloheptatriene	26.68	26.55

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3 讨论

在前期研究中从沙葱萤叶甲成虫转录组中鉴定出29条OBP基因,半定量RT-PCR和qRT-PCR检测结果表明,GdauOBP20在触角中高度表达,而在头（去掉触角）、胸、腹、足和翅等组织中不表达,推测其在沙葱萤叶甲寻找寄主植物或配偶过程中起着重要作用^[8]。本研究采用RACE技术克隆得到了GdauOBP20的cDNA全长序列,并在原核表达系统中成功诱导表达出重组蛋白,为进一步研究其功能打下了基础。

笔者课题组采用顶空收集法和GC-MS技术从其最适寄主植物——沙葱中鉴定出32种挥发性化合物（未发表）,本研究从中选取13种主要化合物进行了荧光竞争结合试验。结果表明,GdauOBP20与4种有机硫化物均能结合,其中二烯丙基二硫（别名大蒜素）是沙葱挥发物中含量最高的组分。这些硫化物具有强烈的刺激性气味,也是葱、蒜等百合科葱属植物的标志性成分^[25,26,27]。这一结果与沙葱萤叶甲只取食沙葱、多根葱、野韭等百合科葱属植物相一致^[6]。因此,GdauOBP20可能在沙葱萤叶甲寻找寄主植物过程中起着重要作用。对二甲苯、环庚三烯和苯甲酸甲酯在浓度为100 μmol·L^-1时,能将相对荧光强度降至15%,说明GdauOBP20与这3种环状化合物均能较好地结合,推测该蛋白在结构上可能更易于与环状化合物相结合。GdauOBP20与月桂烯的结合能力较弱,解离常数为116.29 μmol·L^-1,这一结果与二化螟（Chilo suppressalis）Minus-C CsupOBP1的结合特性一致^[28],而B型烟粉虱（Bemisia tabaci）BtabOBP8与月桂烯的结合能力较强,解离常数为21.53 μmol·L^-1[29],并且月桂烯对B型烟粉虱有吸引作用^[30]。造成这一差异的原因可能是月桂烯为花香气味物质,广泛存在于绿色开花植物中^[29],对B型烟粉虱等广食性昆虫具有引诱作用,而沙葱萤叶甲和二化螟等寡食性昆虫是以其寄主植物特异性挥发物作为寻找寄主的信号物质。总体上看,GdOBP20对多数供试的主要寄主挥发物的结合能力不强,可能与供试的寄主挥发物种类较少有关,也可能是其本身结合能力较弱。因此,在今后的研究中应增加寄主挥发物的种类,同时采用行为学试验、EAG及RNAi等技术进一步验证GdauOBP20在寄主植物定位中的作用。

4 结论

沙葱萤叶甲气味结合蛋白GdauOBP20具有PBP-GOBP家族的典型结构,属于Minus-C OBP亚家族。该蛋白与其寄主植物的多种主要挥发性气味物质具有不同程度的结合能力,推测其在沙葱萤叶甲对寄主植物的定位过程中可能发挥重要的作用。

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文献年度倒序
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DOI:10.11733/j.issn.1007-0435.2014.04.027 Magsci [本文引用: 2]

沙葱萤叶甲（Galerucadaurica Joannis）为近年来严重危害内蒙古草原的重要害虫，为揭示其成灾机制，在室内测定了13种内蒙古草原常见牧草对沙葱萤叶甲幼虫生长发育、存活和取食的影响。结果表明：沙葱萤叶甲幼虫食性窄，主要取食沙葱（Allium mongolium）、野韭（A.ramosum）及多根葱（A.polyrhizum）等百合科葱属植物，其他供试植物基本无取食现象。沙葱、野韭及多根葱对沙葱萤叶甲幼虫期、蛹期和取食量有显著影响，而对其存活率影响不显著。幼虫取食沙葱、野韭和多根葱时，幼虫期和蛹期分别为24.27，27.87，33.13d和6.61，7.40，8.43d，取食量分别为393.76，442.51和496.09mg（鲜重），3龄幼虫食量最大，占幼虫期总食量的63.45%~67.46%，约为2龄幼虫的3倍、1龄幼虫的5倍。因此，沙葱是沙葱萤叶甲幼虫的最适寄主植物，其次为野韭，然后是多根葱；化学防治时，应在幼虫3龄以前进行。

HAO

, ZHOU X

, PANG B

, ZHANG Z

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李红亮, 张林雅, 庄树林, 倪翠侠, 韩宝瑜, 商晗武 . 中华蜜蜂普通气味结合蛋白ASP2的气味结合功能模式分析
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DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.018 Magsci [本文引用: 1]

【目的】研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana）体外重组普通气味结合蛋白AcerASP2与不同气味信息的结合功能和模式。【方法】通过诱导条件的优化和纯化，在获得的重组AcerASP2蛋白基础上，研究竞争性荧光探针1-NPN及不同结构气味信息与蛋白的相互作用关系，并通过同源建模和分子对接解析蛋白与气味信息的结合模式和机理。【结果】通过条件摸索获得了可溶性表达的重组中蜂ASP2蛋白，荧光光谱分析1-NPN与AcerASP2的解离常数K1-NPN为7.38 μmol•L-1，结合位点数n为1.0321。在7种气味信息中，4-烯丙基藜芦醚亲和力最强，其IC50和解离常数KD分别达到7.09和3.46 μmol•L-1。分子对接显示AcerASP2具有1个呈狭长的口袋状的疏水性结合内腔，4-烯丙基藜芦醚绝大部分位于该预测疏水性内腔中，且与Lys74产生2个氢键。【结论】中华蜜蜂AcerASP2由于特殊的空间结构而具有较强的气味信息结合能力，且易通过与疏水内腔中的赖氨酸残基产生氢键而促进结合。

LI H

, ZHANG L

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. Interpretation of odorant binding function and mode of general odorant binding protein ASP2 in Chinese honeybee (Apis cerana cerana)
Scientia Agricultura Sinica, 2013,46(1):154-161. (in Chinese)

DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.018 Magsci [本文引用: 1]

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李兆群, 张帅, 周淑芬, 雒珺瑜, 崔金杰 . 棉铃虫气味结合蛋白HarmOBP16的组织表达谱及配基结合特性分析
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DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.05.008 Magsci [本文引用: 1]

【目的】克隆与鉴定美洲斑潜蝇（Liriomyza sativae）气味结合蛋白（odorant binding protein,OBP）基因,并对其序列特征、表达情况、系统发育及蛋白功能进行研究,为深入研究美洲斑潜蝇嗅觉机制提供依据。【方法】通过PCR技术克隆美洲斑潜蝇OBP13编码区全长,用DNAMAN对其进行序列分析,用BLAST进行同源性比较,并使用MEGA6.0构建进化树,进行系统发育分析。通过实时定量PCR对OBP13在美洲斑潜蝇不同组织中的表达情况进行分析。构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白纯化,获取重组蛋白。设定荧光分光光度计的激发波长为337 nm,以1-NPN为荧光探针,研究OBP13与25种不同气味配基的结合特性。使用间接免疫荧光染色技术及制备的OBP13的特异性多克隆抗体,对其在组织中的分布情况进行定位。将美洲斑潜蝇触角进行包埋、切片、免疫染色,并在激光共聚焦显微镜下进行观察,了解OBP13在触角感器中的亚细胞分布。【结果】获得了一个美洲斑潜蝇气味结合蛋白基因,命名为LsatOBP13（GenBank登录号：KT250751）。LsatOBP13开放阅读框全长462 bp,编码153个氨基酸,预测成熟蛋白分子量为17.80 kD,等电点为5.75,N-末端的前17个氨基酸为信号肽序列。具有4个保守的半胱氨酸位点,为Minus-C OBP。系统发育分析显示,其与地中海实蝇CcapOBP99a-like位于同一小分支上,亲缘关系较近。检测LsatOBP13在不同组织的表达水平,发现LsatOBP13在触角中的表达量远远高于其他组织。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。对25种气味配基的结合能力检测,发现LsatOBP13与反式-2-己烯醛、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、α-紫罗兰酮、苯并噻唑、β-紫罗兰酮具有较强的结合能力,解离常数分别为12.592、10.995、11.165、11.224、10.336、9.218 μmol·L-1,其中与β-紫罗兰酮亲和能力最强。通过免疫荧光定位,发现其在触角中主要定位在毛形感器和锥形感器上,在触角嗅觉窝及触角芒连接处也有分布。【结论】美洲斑潜蝇OBP13为非典型的气味结合蛋白Minus-C OBP。表达情况、气味结合特性、免疫定位结果表明,OBP13主要存在于美洲斑潜蝇触角中,参与触角对绿叶植物中大量存在的气味物质的识别过程,推测其在美洲斑潜蝇嗅觉识别、寄主植物定位中发挥功能。

CHEN D

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. Identification and function of the OBP13 protein from the leafminer (Liriomyza sativae)
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DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.05.008 Magsci [本文引用: 1]

陈秀琳, 苏丽, 陈丽慧, 李怡萍, 仵均祥, 李广伟 . 梨小食心虫Minus-C气味结合蛋白的分子克隆、表达谱及结合特性分析
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气味结合蛋白（odorant binding proteins， OBPs）在昆虫对寄主气味的感受中起重要作用，但有关Minus-C OBP及其功能的报道很少。本研究通过基因组数据分析并利用RACE技术，克隆和鉴定了二化螟Chilo suppressalis (Walker)的一个Minus-C OBP基因，命名为CsupOBP1（GenBank登录号： KC492498）。CsupOBP1基因的开放阅读框长423 bp，编码141个氨基酸，其中N端的18个氨基酸为预测的信号肽序列，成熟蛋白序列中具有4个保守的半胱氨酸位点。实时定量PCR分析显示，该基因在幼虫头部及成虫雌雄足、翅和雄性触角等化感组织中高表达，其中在雄虫触角内的表达量显著高于雌虫触角。利用荧光竞争结合实验对CsupOBP1重组蛋白与38种化合物的结合特性的测定表明，重组CsupOBP1与β紫罗兰酮的结合能力最强（Ki=9.53 μmol/L）。触角电位测定表明，二化螟成虫可对β-紫罗兰酮产生显著的触角电生理反应，但雄虫反应明显强于雌虫，与结合试验及雄虫触角中CsupOBP1的表达量显著高于雌虫触角的测定结果相一致。鉴于β-紫罗兰酮是水稻等植物中普遍存在的一种芳香气味组分，推测CsupOBP1可能通过对该气味的结合和运输，从而在二化螟对寄主植物的嗅觉定向中起作用。

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. Molecular cloning and functional identification of a Minus-C odorant binding protein from the rice striped stem borer, Chilo suppressalis (Lepidoptera: Pyralidae)
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王然, 张晓曼, 李峰齐, 吴帆, 李红亮, 罗晨 . 烟粉虱MED隐种气味结合蛋白OBP的克隆、原核表达及植物挥发物的结合特性
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曹凤勤, 刘万学, 范中南, 万方浩, 程立生 . B型烟粉虱对三种寄主植物及其挥发物的行为反应
昆虫学报, 2008,51(8):830-838.

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利用Y型嗅觉仪，测定了B型烟粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）雌虫对3种寄主植物、挥发物提取液、挥发物标样以及寄主植物挥发物模拟样的行为反应，并比较鉴定寄主植物挥发物的组分和含量，以期明确植物挥发物在B型烟粉虱寄主定向行为中的作用。结果表明：1）番茄植株和甘蓝植株及其相应的挥发物提取物对烟粉虱雌成虫均具有显著的引诱作用，而辣椒植株和挥发物提取物的引诱作用不明显；3种寄主植物和挥发物提取物分别两两之间比较时，烟粉虱的选择行为均极显著地表现为番茄 > 甘蓝 > 辣椒。2）番茄、甘蓝和辣椒具有不同的挥发物化学图谱，且挥发物组分的相对百分含量差异很大；番茄挥发物总量远远大于甘蓝和辣椒；从组分来看，番茄挥发物中主要为萜烯类（89.8%），甘蓝挥发物中主要为烷烃类（53.0%）。3）8种寄主植物挥发物标样（10-1～10-6 μL/μL）中，除1,8-桉树脑始终对烟粉虱具有引诱作用外，丁子香酚、苎烯、里那醇和月桂烯则是分别在10-4～10-6，10-1～10-4，10-1～10-4和10-1～10-4μL/μL时，才具有引诱作用；α-蒎烯、顺-3-已烯-1醇则在高浓度下（10-1和10-2 μL/μL）对烟粉虱具有排斥作用，低浓度下对烟粉虱没有任何影响；正十二烷在任何浓度下对烟粉虱均没有任何作用。4）在辣椒上分别喷施番茄挥发物模拟样和甘蓝挥发物模拟样，均显著增加对烟粉虱的引诱作用，而在番茄上喷施辣椒挥发物模拟样则无明显增效作用。综合分析认为，挥发性物质在B型烟粉虱对不同寄主植物的选择偏好时具有重要的行为导向作用。

CAO F

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. Behavioural responses of Bemisia tabaci B-biotype to three host plants and their volatiles
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