, 宿红艳2 1. 鲁东大学 生命科学学院，山东 烟台 264025;
2. 鲁东大学 农学院，山东 烟台 264025
收稿日期：2020-11-10；接收日期：2021-01-14
基金项目：山东省重点研发计划(No. 2019GSF107091)，山东省海洋与渔业科技创新计划(No. 2017YY04) 资助
摘要：灿烂弧菌Vibrio splendidus作为一种水产条件致病菌，可以感染多种水产养殖动物，给水产养殖业带来巨大的经济损失。文中将核酸外切酶Ⅲ酶切信号放大策略和纳米金标记DNA探针核酸试纸条相结合，建立了一种新型高效的灿烂弧菌检测方法，检测结果可凭肉眼直接判定，并突破了常规免疫试纸条单克隆抗体制备困难的障碍。经过实验条件优化，该核酸试纸条对灿烂弧菌人工合成寡核苷酸DNA片段的检测限是5 ng/mL，对灿烂弧菌基因组DNA实际样本的检测限是10 ng/mL，较PCR法灵敏度高，并对灿烂弧菌具有检测特异性。研究结果实现了核酸试纸条的快捷制备及对灿烂弧菌的高效检测，为水产病害的防治开辟了新的途径。
关键词：灿烂弧菌纳米金核酸外切酶Ⅲ试纸条核酸检测
A novel test strip assay based on gold nanoparticles-labeled nucleic acid probe for rapid detection of Vibrio splendidus
Lizhi Zhang1, Ya'nan Weic1, Xuehui Wang1, Jingzhuang Xue1, Jiali Qi1, Xianyu Wang1, Lei Wang1
, Hongyan Su2 1. College of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025, Shandong, China;
2. College of Agriculture, Ludong University, Yantai 264025, Shandong, China
Received: November 10, 2020; Accepted: January 14, 2021
Supported by: Key Technology Research and Development Program of Shandong Province, China (No. 2019GSF107091), Marine and Fisheries Science and Technology Innovation Program of Shandong Province, China (No. 2017YY04)
Corresponding author: Lei Wang. Tel: +86-535-6685003; E-mail: wanglei9909@163.com;
Hongyan Su. Tel: +86-535-6664665; E-mail: suhongyan66@126.com.
Abstract: Vibrio splendidus is an opportunistic pathogen in aquaculture. It can infect a variety of aquaculture animals and has caused huge losses to the aquaculture industry. In this study, a novel and efficient method for detecting V. splendidus was developed by combining the exonuclease Ⅲ amplification strategy with a nucleic acid test strip developed based on gold nanoparticles-labeled DNA probe. The results could be directly visualized by naked eyes, and this system overcame the difficulty in preparation of the monoclonal antibody used in conventional immunostrip. Upon optimization of experimental conditions, the detection limit of the strip was 5 ng/mL for the synthetic oligonucleotide DNA fragment and 10 ng/mL for the actual genomic DNA sample of V. splendidus. This test strip was more sensitive compared with the PCR method and was specific for the detection of V. splendidus. The rapid preparation of nucleic acid strip and the efficient detection of V. splendidus open a new way for the prevention and control of aquatic diseases.
Keywords: Vibrio splendidusgold nanoparticlesexonuclease Ⅲtest stripnucleic acid detection
灿烂弧菌Vibrio splendidus属弧菌科Vibrionaceae弧菌属Vibrio，是一种分布在盐湖和海洋中的条件致病菌，宿主范围广泛[1]，可以引起大菱鲆、牙鲆、大西洋鲑、鳟鱼、鲈鱼、海参、蛤蜊、扇贝、牡蛎等多种水产养殖动物产生疾病，给水产养殖业带来不可估量的经济损失[2-3]。Reid等和王印庚等报道灿烂弧菌是大菱鲆“黑瘦症”的主要致病菌，鱼苗感染灿烂弧菌后死亡率高达80%–90%[4-5]；Zhang等和Sun等报道灿烂弧菌可导致刺参患“腐皮综合征”，发生大面积死亡[6-7]。因此，建立一种灵敏、高效的灿烂弧菌检测方法对水产养殖业的健康可持续发展具有重要意义。
目前针对灿烂弧菌已建立了两大检测体系：基于蛋白质水平的免疫学检测技术(如酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、间接荧光抗体检测法等) 和基于核酸水平的分子生物学检测技术(如聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)、斑点杂交、环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP) 等)[8-12]。但这些方法普遍对专业要求比较高，需要专业的检测人员和设备，并且PCR、斑点杂交和LAMP容易造成假阳性，免疫学方法则需要制备抗体，操作步骤烦琐[13-14]。因此，水产养殖领域迫切需要建立一种简便、快速、高效、适合现场检测的新技术。
纳米金(Gold nanoparticles，AuNPs) 免疫层析检测试纸条是20世纪80年代在纳米金标记抗体技术和薄膜层析技术基础上快速兴起的一种蛋白快速检测技术[15]。它利用抗原和抗体的特异性结合反应形成抗原-抗体-AuNPs颗粒复合物，在试纸条上富集形成有色沉淀线从而将免疫反应转化成可视化信号，具有携带方便、操作简便、凭肉眼直接判断结果等优点，已广泛应用于疾病诊断、药物残留检测、环境监测等领域[16-17]。然而，研制免疫层析试纸条的关键是制备特异性高、亲和力强的单克隆抗体，这需要经历烦琐的杂交瘤实验和长期的筛选过程，耗费大量的人力与物力，实验成功率低，并且抗体偶联金标的过程也较为复杂，这些都成为免疫试纸条研发的重要瓶颈[18]。
本研究将核酸探针杂交技术与纳米金层析技术相结合，研制开发了一种快速制备型纳米金核酸检测试纸条，以纳米金标记的寡核苷酸探针取代金标抗体用于对病原微生物的检测，打破了试纸条对抗体的依赖，探针可直接在生物公司合成，方便快捷、成本低廉。并结合核酸外切酶Ⅲ (Exonuclease Ⅲ，Exo Ⅲ) 的循环酶切策略实现了信号放大，提高了检测的灵敏度。该检测技术为灿烂弧菌的快速、高效、可视化检测提供了新的思路，为核酸试纸条的发展及推广奠定了基础。
1 材料与方法1.1 材料与试剂灿烂弧菌、鳗弧菌Vibrio anguillarum、副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus、哈维氏弧菌Vibrio harveyi和溶藻弧菌Vibrio alginolyticus等海洋病原菌购于中国海洋微生物菌种保藏管理中心，由本实验室保藏。
氯金酸、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 购自国药集团化学试剂有限公司；十二烷基硫酸钠(SDS) 购自华美生物工程有限公司；吸收垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane，简称NC膜)、黏贴底板购自上海杰一生物有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit购自北京全式金生物技术有限公司；核酸外切酶Exo Ⅲ购自大连宝生物工程有限公司。
1.2 仪器与设备电热恒温培养箱购自宁波市科技园区新江南仪器有限公司；高速冷冻离心机购自美国Thermo公司；电泳仪购自北京市六一仪器厂；凝胶成像仪购自上海山富科学仪器有限公司；空气浴振荡器购自哈尔滨市东明医疗仪器厂；真空干燥箱购自上海新苗医疗器械制造有限公司；PCR仪购自美国伯乐(Bio-Rad) 公司；微量分光光度计购自美国通用电气(GE) 公司。
1.3 实验方法1.3.1 引物设计在NCBI数据库中查找灿烂弧菌不同菌株的基因组序列，经同源性分析发现灿烂弧菌的特异性保守区域，以此为根据设计发卡DNA (Hairpin DNA) 和探针2 (Probe 2)，再设计出探针1 (Probe 1)、探针3 (Probe 3) 以及用于PCR检测的引物VSgyrB-F和VSgyrB-R。其中探针1为发卡DNA的环状部分(loop)，探针2与灿烂弧菌的保守区域互补，探针3与探针1互补，具体序列见表 1，以上序列均由大连宝生物工程有限公司合成并纯化，获得的冻干粉用TE缓冲液溶解。
表 1 探针及扩增引物序列Table 1 Probes and amplification primers used in the experiment
| Name | Sequence (5'–3') |
| Probe 1 | SH-AAAAAATCCAGTATACTCGACGTCAG |
| Probe 2 | TTGGGTTCTCGATAAGGAAC |
| Probe 3 | CTGACGTCGAGTATACTGGA |
| Hairpin DNA | GTTCCTTATCGAGAACCCAATCCAGTATACTCGACGTCAGTTGGGTTCTCGATAAGGAACTCAGACAG |
| VSgyrB-F | ACCAACAAAACCCCGATCATC |
| VSgyrB-R | AGCATCATCACCTGATGTTGC |
表选项
1.3.2 实验用基因片段及核酸样品的制备根据灿烂弧菌基因组的保守区段设计一段用于检测的目标寡核苷酸片段(Target DNA)，具体序列为：5'-CTGTCTGAGTTCCTTATCGAGAACCCAACAGAAG-3'。
另外，为了确保检测方法的实用性和可靠性，对标准水产病原菌的基因组DNA进行检测。将灿烂弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌和溶藻弧菌等菌种接种到2216E液体培养基中，于28 ℃、180 r/min过夜培养。培养好的菌液按照细菌基因组DNA提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司) 说明书提取基因组DNA。提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测并通过紫外分光光度计测定含量，-20 ℃保存备用，该样品用于实际样本检测及试纸条的灵敏度和特异性检测。
1.3.3 核酸试纸条的制备(1) AuNPs的制备
利用柠檬酸钠还原法[19-20]合成AuNPs，具体步骤如下：取1.0 mmol/L氯金酸溶液100 mL，搅拌加热沸腾后，立刻加入10 mL的柠檬酸钠溶液(33.8 mmol/L)，当溶液的颜色从浅黄色变为酒红色，继续加热20 min后停止加热，待溶液自然冷却至室温，4 ℃避光备用。
(2) AuNPs的表征
紫外-可见(UV-Vis) 吸收光谱表征：利用UV-Vis分光光度计对制备的AuNPs进行300–700 nm波长范围吸收光谱扫描。透射电镜(TEM)表征：取10 μL的AuNPs溶液滴至覆炭铜网表面，室温干燥后，在100 kV电压下观察其形貌特征、粒径大小及其分散情况。
(3) AuNPs-探针1复合物的制备
取上述制备的AuNPs溶液1 mL，4 ℃、10 000 r/min离心10 min。弃上清，100 μL ddH2O重悬沉淀，分别调节pH值至6.6、6.8、7.0、7.2和7.4，加入不同体积的10 μmol/L的探针1 (1、5、10、20、30和40 μL)，混匀后4 ℃避光放置24 h，加入60 μL含20 mmol/L磷酸缓冲液(Phosphate buffer，PB：20 mmol/L NaH2PO4·H2O和20 mmol/L的Na2HPO4·12H2O，pH 7.0) 和0.6 mol/L NaCl的混合液。4 ℃下避光放置48 h后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min。弃上清，用含10 mmol/L PB (pH 7.0) 和0.3 mol/L NaCl的混合液500 μL重悬沉淀，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，弃上清。最后用200 μL含10 mmol/L PB (pH 7.0) 和0.3 mol/L NaCl的混合液重悬沉淀，进行UV-Vis吸收光谱扫描检测，4 ℃避光保存备用。
(4) 核酸检测试纸条的制备
本研究制备的核酸试纸条由样品垫、金标结合垫、杂交膜、吸收垫及黏贴底板组成。其中样品垫(17 mm×5 mm) 由玻璃纤维制成，将其在缓冲液(0.25% TritonX-100、20 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl，pH 8.0) 中浸泡2 h，37 ℃干燥2 h。金标结合垫(8 mm×5 mm) 由玻璃纤维制成，将25 μL的AuNPs-探针1复合物滴加到玻璃纤维上，在室温下避光干燥过夜。杂交膜(25 mm×5 mm) 分别选用上海杰一生物公司NC-a102、NC-a103、NC-b111三种不同型号的NC膜和型号为NL-b105的尼龙膜，首先在0.3 mol/L NaCl和10 mmol/L PB (pH 7.0) 的混合液中浸泡2 h，37 ℃干燥2 h；然后使用划线工具在膜上分别划上10 μmol/L的探针2作为检测线(Test line)、10 μmol/L的探针3作为质控线(Control line)，两条线之间的间隔为5.0 mm；最后紫外线照射进行交联固定2 h。吸收垫(30 mm×5 mm) 由吸水纸组成，用0.3 mol/L NaCl和10 mmol/L PB (pH 7.0) 的混合液中浸泡2 h，经37 ℃干燥2 h。于黏贴底板(77 mm×5 mm) 上依次粘贴上样品垫、金标结合垫、杂交膜和吸收垫，各部分之间有3 mm左右的重叠，以确证被检样品溶液及展开液在各部分之间发生位移。组装完成后的试纸条用重物压实过夜，4 ℃下密封干燥保存。
1.3.4 Exo Ⅲ酶切处理取DNA样品(寡核苷酸DNA或基因组DNA) 2 μL，加入13 μL双蒸水和4 μL的杂交缓冲液(0.1 mol/L PB，3 mol/L NaCl，0.1% SDS)，95 ℃水浴加热5 min后迅速置于冰浴中。另取10 μmol/L的发卡DNA溶液5 μL，加入15 μL双蒸水中，95 ℃水浴加热5 min后，慢慢冷却至室温。将上述处理的DNA样品溶液和发卡DNA溶液均匀混合，42 ℃加热30 min后，加入5 μL 10× Exo Ⅲ酶切缓冲液和4 μL Exo Ⅲ，定容至50 μL，混匀后37 ℃下孵育60 min。酶切结束后，70 ℃加热10 min，使Exo Ⅲ失活，酶切溶液自然冷却至室温用于试纸条检测。
1.3.5 试纸条检测将上述50 μL酶切产物滴加至试纸条样品垫上，5 min之后再滴加100 μL展开液(10 mmol/L PB，0.3 mol/L NaCl，pH 7.0) 冲洗试纸条，以确保AuNPs-探针1复合物在展开液的推动下从金标结合垫上释放，进而沿NC膜移动。将试纸条置于湿盒内，37 ℃孵育20 min后观察最终的结果。若检测线及质控线都显示红色条带，则检测样品为阳性；若只有质控线显示红色条带，则检测样品为阴性；若检测线及质控线均无条带显现，则说明检测结果无效。
1.3.6 试纸条灵敏度初步评价检测样品将Target DNA用Exo Ⅲ酶切后，将酶切液的梯度稀释，分别对应Target DNA的浓度为100 ng/mL、50 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL和1 ng/mL，分别滴加至试纸条上进行检测，观察实验结果，确定试纸条的检测限。
1.3.7 实际样本检测(1) PCR检测
将提取的灿烂弧菌基因组DNA分别稀释至10 000、1 000、100、10和1 ng/mL，以VSgyrB-F和VSgyrB-R为引物(序列见表 2)，进行PCR检测。PCR反应体系：DNA模板2 μL，10×PCR Mix 3 μL，正、反向引物各2 μL，无菌双蒸水补齐至30 μL。将反应液充分混合后，按照以下程序进行扩增：94 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，循环30次；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
(2) 核酸试纸条检测
将提取的灿烂弧菌基因组DNA按照步骤1.3.4和1.3.5进行Exo Ⅲ酶切处理和试纸条检测，判定检测结果。
(3) 灵敏度检测
参考对Target DNA灵敏度的检测结果，将灿烂弧菌基因组DNA分别稀释为100、50、10、5和1 ng/mL等不同浓度，分别进行核酸试纸条检测，根据实验结果确定试纸条检测法对灿烂弧菌的最低检测限。
(4) 特异性检测
参考步骤1.3.2提取灿烂弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌和溶藻弧菌等海洋病原菌的基因组DNA，将浓度均一至100 ng/mL，分别用核酸试纸条检测，确定该核酸检测试纸条的特异性。
(5) 重现性检验
分别取100、50、10、5和1 ng/mL的灿烂弧菌基因组DNA，用试纸条重复检测5次，确定该核酸检测试纸条的重现性。
(6) 稳定性检验
将试纸条密闭保存于自封袋内，置于4 ℃冰箱内，每隔一个月取出试纸条，检测100、50、10、5和1 ng/mL等不同浓度的灿烂弧菌基因组DNA，确定该核酸检测试纸条的稳定性。
2 结果与分析2.1 检测原理2.1.1 酶切信号放大原理试纸条在实施试纸条检测之前，我们首先通过Exo Ⅲ循环酶切将信号放大，具体原理如图 1所示：在变性条件下，发卡DNA茎环结构打开，其3'端(图 1中的红色部分) 可与灿烂弧菌的保守区域发生互补，当检测核酸样品(DNA sample)中有灿烂弧菌序列存在时，便可与发卡DNA发生杂交结合。随后用Exo Ⅲ处理，该酶只能作用于互补双链中的DNA单链，并沿3'→5'方向酶切，但无法切割游离的DNA单链。由于杂交后的DNA sample序列两端和发卡DNA的5'端是游离的，因此Exo Ⅲ只能从3'端切割发卡DNA的互补双链部分(红色部分)，导致此部分降解，发卡DNA 5'端游离的DNA片段(图 1中的黑色部分) 和DNA sample则释放出来。释放的DNA sample又可再次与发卡DNA发生杂交，再经Exo Ⅲ酶切又释放出DNA sample和发卡DNA的5'端部分，如此循环往复，最终使发卡DNA的5'端片段(黑色部分，即DNA fragments) 得到累积，这样，通过Exo Ⅲ酶切可以将微量的灿烂弧菌DNA片段转化成大量的用于检测的DNA片段，实现了信号的放大。酶切后的溶液即可滴加到试纸条样品垫上进行可视化检测。如果样品DNA中不含有灿烂弧菌的序列，则不能与发卡DNA发生杂交，上述的循环放大就不能进行。
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| 图 1 基于Exo Ⅲ酶切的信号放大原理示意图 Fig. 1 Schematic diagram of signal amplification based on Exo Ⅲ digestion. |
| 图选项 |
2.1.2 试纸条显色原理本核酸试纸条整体结构与常规的免疫试纸条相同，也是由样品垫、金标结合垫、杂交膜、吸收垫及黏贴底板5个部分组成。但该试纸条完全不需要抗体，在接合垫上滴加的是AuNPs-探针1结合物，NC膜上检测线和质控线的成分分别为核酸探针探针2和探针3。当检测液中有目的DNA存在时可于发卡DNA杂交，经Exo Ⅲ反复酶切富集产生可用于检测的DNA片段，将此DNA片段滴加至样品垫，在毛细作用下慢慢迁移至金标结合垫，可与其上的AuNPs-探针1杂交形成AuNPs-探针1-检测DNA复合物，并沿条带继续向上移动到NC膜。当复合物中的检测DNA片段与检测线上的探针2发生结合后，AuNPs被吸附于检测线呈现红色条带，多余的AuNPs-探针1继续向上迁移至质控线时，探针1可与质控线上的探针3结合，导致AuNPs在质控线上聚集而显色，最终检测线和质控线均显色。而当检测溶液中不存在目标灿烂弧菌DNA片段时，发卡DNA没有杂交对象与之杂交，无法被Exo Ⅲ循环酶切，就不会有检测DNA片段产生。再用试纸条检测时由于没有检测DNA片段与AuNPs-探针1结合形成复合物，试纸条不能在检测线上捕获AuNPs，因此检测线不显红色条带；而AuNPs-探针1则可与质控线上的探针3结合，所以仅质控线显红色条带。
2.2 试纸条制备2.2.1 AuNPs的合成与表征由图 2A可以看出合成的AuNPs溶液在自然光下颜色呈酒红色，澄清透明、无明显的沉淀与悬浮物。用紫外分光光度计对AuNPs溶液进行UV-Vis吸收光谱扫描，溶液在520 nm处有一个明显的吸收峰(图 2B中红色曲线)，与AuNPs的特征等离子共振吸收峰相一致[21]。并且吸收峰的峰形较窄，说明制备的AuNPs颗粒的粒径分布较为均匀。
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| 图 2 纳米金溶液照片(A) 和紫外-可见光谱图(B) Fig. 2 Image of AuNPs solution (A) and UV-Vis spectra of AuNPs (B). |
| 图选项 |
AuNPs的质量对试纸条的制备起着十分重要的作用，形状大小不规则的AuNPs颗粒常常因不能被DNA探针均匀包裹而发生聚集，将影响AuNPs迁移和最终试纸条的显色[22]。在室温下放置6个月仍能保持稳定，无沉淀析出。利用透射电子显微镜对AuNPs的大小、形貌与分散性进行观察，由图 3可看出AuNPs颗粒均呈球形，粒径均匀，大小约为13–15 nm，分散良好，适合用于试纸条的制备。
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| 图 3 纳米金的透射电镜照片 Fig. 3 Transmission electron microscopeimage of AuNPs. |
| 图选项 |
2.2.2 AuNPs-探针1偶联条件的优化(1) 最适pH的确定
为了研究探针1修饰AuNPs的最适pH值条件，将反应溶液调节至不同pH值，观察最终的反应情况。当溶液pH未达到AuNPs同探针1结合的最适pH时，反应液中NaCl的盐离子效应会中和游离的AuNPs表面的负电荷，导致聚沉现象发生，颜色由红变蓝。能维持溶液保持酒红色且不发生沉淀的临界pH值即是探针1与AuNPs发生偶联的最适pH[23]。结果如图 4所示：当pH为6.6时，溶液呈淡蓝色并伴随有少量沉淀析出；当pH为6.8时，溶液显蓝灰色并有沉淀伴随析出；当pH为7.0时，溶液虽然为酒红色但有少量沉淀析出；当pH为7.2时，溶液呈现酒红色并无沉淀析出。因此pH 7.2为DNA修饰AuNPs的最适pH值。
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| 图 4 探针1修饰AuNPs的最适pH的确定 Fig. 4 Optimal pH for modifying AuNPs by Probe 1. |
| 图选项 |
(2) 最适探针1加入量的确定
调节AuNPs溶液的pH值至最适pH值7.2，各管分别加入不同体积的探针1溶液，观察偶联反应情况。当反应体系中探针1的体积逐渐减少时，游离的AuNPs会在NaCl的作用下发生聚集，溶液颜色由红变蓝。由图 5可以看出，探针1的体积在20 μL以下的各管中都有沉淀析出，随着探针1加入体积的减少，溶液逐渐由深酒红色变为浅红，最后变为蓝色。最终确定30 μL 10 μmol/L的探针1溶液为修饰AuNPs的最适加入量。
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| 图 5 探针1修饰AuNPs的最适加入量的确定 Fig. 5 Optimal volume of Probe 1 for modifying AuNPs. |
| 图选项 |
在最适条件下将AuNPs与探针1偶联后测定其UV-Vis吸收光谱，最高吸收峰位置发生了改变，由519 nm上升至522 nm (图 2B中黑色曲线)，说明修饰后AuNPs体积增大，出现了吸收峰红移，证明了AuNPs与探针1的成功交联。
(3) 杂交膜的选择
杂交膜是试纸条的关键部分，它是核酸样本与探针杂交发生的场所，直接影响到膜的层析速度和杂交显色的情况，展开速度适中、杂交效果好才能保证显色信号的清晰度。本实验分别选用上海杰一生物公司NC-a102、NC-a103、NC-b111三种不同型号的NC膜和NL-b105型尼龙膜作为试纸条的杂交膜。为了排除其他因素干扰、方便检测，我们只在杂交膜上用探针3划出一条质控线，在样品垫上滴加展开液，通过观察AuNPs的层析速度和质控线的显色情况确定最佳的杂交膜材料。
实验结果如图 6所示：NC-b111、NL-b105层析爬速较快，质控线不能很好显色；NC-a103层析爬速较慢，在短时间内质控线显色不太清晰；NC-a102层析速度适中，检测线显色最清晰，既能保证AuNPs-探针1与探针3有充足的时间杂交、使较多的AuNPs固定聚集，又能使质控线在较短时间内清晰显现。通过上述实验，我们选定NC-a102型NC膜作为制备试纸条的杂交膜。
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| 图 6 杂交膜的筛选 Fig. 6 Screening of hybrid membranes. 1: type NC-a103 NC membranes; 2: type NC-a102 NC membranes; 3: type NC-b111 NC membranes; 4: type NL-b105 nylon membrane. |
| 图选项 |
2.3 试纸条制备与灵敏度评价为了便于开展试纸条的研究，我们首先以人工合成的灿烂弧菌寡核苷酸DNA片段(Target DNA) 为检测对象。将Target DNA通过核酸外切酶Exo Ⅲ进行信号放大，酶切后的酶切液进行梯度稀释，稀释后对应的Target DNA的浓度分别为100、50、10、5和1 ng/mL，然后用试纸条检测，初步判定试纸条的灵敏度。
结果如图 7所示：随着DNA浓度的降低，检测线的颜色逐渐减弱，当样品浓度为5 ng/mL时检测线显示微弱的条带；当浓度降至1 ng/mL时试纸条上的检测线消失。而质控线均显示清晰的条带，证明所有用于测试的试纸条均显色有效。因此本灿烂弧菌核酸检测试纸条对人工合成的Target DNA的检测灵敏度是5 ng/mL。
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| 图 7 试纸条对人工合成目标DNA片段的灵敏度分析 Fig. 7 Sensitivity analysis of the test strips to the synthetic target DNA fragment. 1: 100 ng/mL; 2: 50 ng/mL; 3: 10 ng/mL; 4: 5 ng/mL; 5: 1 ng/mL. |
| 图选项 |
2.4 实际样本的检测2.4.1 PCR检测为了对比本试纸条的检测效果，在检测灿烂弧菌标准菌株实际样本时，首先以常规分子生物学检测技术——PCR技术作为参考和验证。将灿烂弧菌基因组DNA梯度稀释后，用特异引物进行PCR扩增，PCR扩增产物进行琼脂糖电泳检测，结果如图 8所示。浓度为10 000、1 000和100 ng/mL的样品可扩增出大于250 bp的条带，与预期目的条带大小(258 bp) 一致。当样品为100 ng/mL时可产生模糊的扩增条带，当浓度下降到10 ng/mL时则没有扩增条带，因此本实验条件下PCR方法对灿烂弧菌的最低检测限是100 ng/mL。
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| 图 8 PCR对实际样本的灵敏度分析 Fig. 8 Sensitivity analysis of PCR to actual samples. M: DL2000 marker; 1: 10 000 ng/mL; 2: 1 000 ng/mL; 3: 100 ng/mL; 4: 10 ng/mL; 5: 1 ng/mL. |
| 图选项 |
2.4.2 核酸试纸条检测(1) 灵敏度检测
为研究试纸条对实际样本的检测灵敏度，首先将提取的灿烂弧菌基因组DNA与发卡DNA混合后Exo Ⅲ酶切，将得到的酶切液梯度稀释，分别加至试纸条的样品垫上进行检测。结果如图 9所示：所有试纸条的质控线均显色，说明试纸条显色有效。检测线的颜色则随着DNA浓度的降低而逐渐减弱。5 ng/mL和1 ng/mL浓度对应试纸条的检测线没有出现条带，呈阴性；10 ng/mL试纸条显示微弱的条带，说明核酸试纸条检测法对灿烂弧菌实际样本的检测限为10 ng/mL，较PCR检测法更为灵敏。
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| 图 9 检测试纸条对实际样本的灵敏度分析 Fig. 9 Sensitivity analysis of test strips to actual samples. 1: 100 ng/mL; 2: 50 ng/mL; 3: 10 ng/mL; 4: 5 ng/mL; 5: 1 ng/mL. |
| 图选项 |
(2) 特异性检测
为研究试纸条的检测特异性，分别提取鳗弧菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌和溶藻弧菌的基因组DNA，经Exo Ⅲ酶切后在试纸条上进行检测。结果如图 10所示：只有灿烂弧菌样品对应试纸条的检测线和质控线均显色，而其他菌种只有质控线显色，证明本研究建立的核酸试纸条特异性良好，不会受到其他水产病原菌的干扰。
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| 图 10 检测试纸条的特异性分析 Fig. 10 Specificity analysis of test strip. 1: V. splendidus; 2: V. anguillarum; 3: V. harveyi; 4: V. parahaemolyticus; 5: V. alginolyticus. |
| 图选项 |
(3) 重现性检测
分别用试纸条检测100、50、10、5、1 ng/mL等不同浓度的灿烂弧菌基因组DNA酶切液，每个浓度重复检测5次，结果表明，所有检测结果均一致，即样品浓度在检测限以下时，试纸条仅质控线显色；当样品浓度在检测限以上时，试纸条的检测线和质控线均显色。试纸条具有良好的检测重现性。
(4) 稳定性检测
用4 ℃保存1–6个月的试纸条对100、50、10、5、1 ng/mL等不同浓度的灿烂弧菌基因组DNA的酶切液进行检测，检测结果均未发生改变，说明试纸条具有很好的稳定性，可满足实际应用的需要。
3 讨论灿烂弧菌是水产养殖动物的重要致病菌，可导致海参的腐皮综合征，并造成鱼类鳍条基部和尾部充血、皮肤溃疡腐烂、内脏糜烂等，引发严重的传染性疾病，给我国水产养殖业造成了巨大的经济损失。因此，需要尽快对灿烂弧菌实施早期诊断，以便及时采取有效的防治措施，控制病害的传播和蔓延。通过多年的研究和探索，人们已针对灿烂弧菌建立了各种较为成熟的检测方法，但这些方法普遍存在成本高、耗时长、依赖专业检测人员和设备等缺点，一定程度上限制了在养殖基层的现场检测及应用推广[24]。相比之下，检测试纸条操作简单，无需检测仪器设备，凭肉眼即可判定结果，受到养殖基层的青睐。目前市面上的检测试纸条几乎全部都是免疫试纸条，受到抗体制备的制约，开发周期漫长。与之相对应的核酸检测试纸条使用的核酸探针可针对检测对象灵活设计，并在生物公司订单式合成，成功绕开了制备抗体的瓶颈，有望为试纸条研发带来新突破。
然而，核酸检测试纸条目前尚处于探索阶段，受检测灵敏度的影响，其应用与推广程度极其有限。虽然目前有不少核酸检测试纸条的报道，但其本质上依然是免疫试纸条，试纸条上的检测探针依然是抗体，最终只是以试纸条代替了琼脂糖凝胶电泳检测过程，利用免疫试纸条检测PCR扩增的目标核酸产物。该技术在PCR扩增的上下游引物中引入半抗原标记，经过PCR扩增的产物便带有双半抗原标记，能够与试纸条纳米金及检测线上的抗体结合，从而在试纸条上显色[25-26]。这种检测方法并没有使试纸条脱离对抗体的依赖，不能从根本上简化试纸的制备和缩短检测过程。
本研究建立的基于纳米金标记的核酸检测试纸条结合了核酸外切酶Exo Ⅲ循环酶切放大策略，不需要借助抗体和PCR扩增，真正实现了以核酸为检测探针的核酸试纸条的建立，极大地简化了制备和检测过程。该试纸条突破了现有免疫试纸条对抗体的依赖，合成组装方便快捷，生产成本低廉，无需专业人员和专门的仪器，实现了针对灿烂弧菌的可视化检测，简便、快速、灵敏，非常适合现场使用。研究结果表明该检测系统对灿烂弧菌人工寡核苷酸DNA片段和实际样品的最低检测限分别为5 ng/mL和10 ng/mL，并且可以将灿烂弧菌与其他水产病原菌区分开来，具有很好的灵敏性和特异性。本研究为灿烂弧菌的快速检测开辟了新的途径，为核酸检测试纸条的推广与应用奠定了基础。
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