1. 山西医科大学 基础医学院, 出生缺陷与细胞再生山西省重点实验室, 山西 太原 030001;
2. 中国科学院广州生物医药与健康研究院, 呼吸疾病国家重点实验室, 广东 广州 510530
收稿日期：2020-09-09；接收日期：2020-10-21；网络出版时间：2020-11-26
基金项目：国家自然科学基金(No. 31900917)，山西省博士科研启动基金(No. SD1812)，山西医科大学博士科研启动基金(No. XD1812)，山西省教育厅高校科技创新计划(No. 2019L0423)，广东省科技计划项目(No. 2015A030312017) 资助
摘要：人分泌型磷脂酶A2 GIIE (Human secreted phospholipase A2 GIIE，hGIIE) 通过发挥酶催化作用，参与炎症反应和脂代谢过程。为了揭示hGIIE的底物选择机制，文中对hGIIE进行了定点突变，采用毕赤酵母Pichia pastoris重组表达突变体蛋白，然后通过阳离子交换和分子排阻两步法纯化蛋白，最后用等温微量热滴定仪测定酶活性。hGIIE的结构分析显示，氨基酸E54可能与GIIE的底物头基选择性有关，经过同源序列比对，拟将E54突变为丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F) 和赖氨酸(K)。突变体E54A、E54F和E54K在毕赤酵母组成型表达系统中实现重组表达，通过两步纯化，纯度达到90%以上。酶活性实验显示，突变体与底物1, 2-二己酰卵磷脂(1, 2-dihexanoyl-sn- glycero-3-phosphocholine，DHPC) 和1, 2-二己酰磷酸甘油(1, 2-dihexyl phosphate glycerol，DHPG)的亲和力发生改变，其中突变体E54K与DHPG的Km值为突变前的0.39倍，亲和力明显增强；突变体E54F与DHPC的Km值为突变前的1.93倍，亲和力明显减弱。hGIIE的E54突变体蛋白与磷脂底物的亲和力发生明显改变，说明E54在hGIIE的磷脂底物选择性水解过程中起重要作用。
关键词：分泌型磷脂酶A2GIIE异源表达突变底物选择性
Effect of E54 mutation of human secreted phospholipase A2 GIIE on substrate selectivity
Shulin Hou1,2, Junping Bai1, Xin Lu1, Yulong Zhang2, Tingting Xu2, Jun Xie1
1. Shanxi Key Laboratory of Birth Defect and Cell Regeneration, College of Basic Medical Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi, China;
2. State Key Laboratory of Respiratory Disease, Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510530, Guangdong, China
Received: September 9, 2020; Accepted: October 21, 2020; Published: November 26, 2020
Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31900917), Science Research Start-up Fund for Doctor of Shanxi Province of China (No. SD1812), Science Research Start-up Fund for Doctor of Shanxi Medical University, China (No. XD1812), Science and Technology Innovation Plan of Colleges and Universities of Education Department of Shanxi Province, China (No. 2019L0423), Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, China (No. 2015A030312017)
Corresponding author: Jun Xie. Tel: +86-351-3985008; E-mail: junxie@sxmu.edu.cn.
Abstract: Human secreted phospholipase A2 GIIE (hGIIE) is involved in inflammation and lipid metabolism due to its ability of hydrolyzing phospholipids. To reveal the mechanism of substrate head-group selectivity, we analyzed the effect of mutation of hGIIE on its activity and selectivity. hGIIE structural analysis showed that E54 might be related to its substrate head-group selectivity. According to the sequence alignment, E54 was mutated to alanine, phenylalanine, and lysine. Mutated genes were cloned and expressed in Pichia pastoris X33, and the enzymes with mutations were purified with 90% purity by ion exchange and molecular size exclusion chromatography. The enzymatic activities were determined by isothermal microthermal titration method. The Km of mutant E54K towards 1, 2-dihexyl phosphate glycerol decreased by 0.39-fold compared with that of wild type hGIIE (WT), and the Km of E54F towards 1, 2-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine increased by 1.93-fold than that of WT. The affinity of mutant proteins with phospholipid substrate was significantly changed, indicating that E54 plays an important role in the substrate head-group selectivity of hGIIE.
Keywords: secreted phospholipase A2GIIErecombinant expressionmutationsubstrate head-group selectivity
分泌型磷脂酶A2 (Secreted phospholipase A2，sPLA2) (EC3.1.1.4) 是一类分泌型的可以催化甘油磷脂sn-2位酯键水解的酶[1]。sPLA2可以通过水解甘油磷脂从细胞膜或脂蛋白中释放溶血磷脂和游离脂肪酸，这两种物质是很多生化反应的信号分子前体[2]。因而sPLA2可以通过发挥酶催化功能参与炎症、脂代谢等生理、病理过程[3-4]。
截至目前，在哺乳动物中总共发现了11个sPLA2的家族成员，包括10种具有催化活性的亚型GIB、GIIA、GIIC、GIID、GIIE、GIIF、GIII、GV、GX、GXIIA和一种无活性的亚型GXIIB[1]。不同亚型具有不同的水解特异性和组织细胞定位，因而具有不同的生理功能，在炎症反应和脂质代谢等过程中起着协同或相反的作用[5]。sPLA2成员具有如下特征：1) 较小的分子量14–19 kDa (GIII除外)；2) 高度保守的钙结合环，序列为XCGXGG；3) 保守的催化二联体His-Asp (GXIIB除外)；4) 6对以上二硫键，结构非常稳定。
早在2000年，GIIE被首次发现并进行了重组表达[6]。成熟的GIIE蛋白含有123个氨基酸，含有7对二硫键，分子量为14 kDa。GIIE在人体内的分布局限于脑、心、肺和胎盘中[7]。在大鼠中，GIIE在脑组织和原代神经元中也有表达，而且在大脑皮层和海马组织中含量较高[8]。
GIIE在炎症反应的发生中起着关键作用。用脂多糖刺激小鼠，会促进小鼠内GIIE的高表达，GIIE可以通过硫酸乙酰肝素糖蛋白(Heparan sulfate proteoglycan，HSPG) 通路促进花生四烯酸和前列腺素的释放，也可以促进白三烯的产生和肥大细胞的脱颗粒[7]。GIIE在过敏性皮炎的老鼠体内表达量升高[9]。
GIIE与脂代谢相关。GIIE在肥胖小鼠的脂肪细胞中大量表达，它可改变脂蛋白中的磷脂组成，调节磷脂酰丝氨酸(PS) 和磷脂酰乙醇胺(PE) 的比例，促进脂质在脂肪组织和肝脏中的积累[10]。在GIIE敲除小鼠的脂肪组织中，甘油三酯大量积累，同时胞外调节蛋白激酶(Extracellular signal regulated kinase，ERK) 和激素敏感型脂肪酶(Hormone-sensitive lipase，HSL) 的磷酸化水平都明显降低[11]。外源补给GIIE蛋白后，脂肪水解恢复正常[11]。GIIE可能通过ERK/HSL磷酸化信号通路，调节脂肪细胞中的脂质水解[11]。
为了揭示GIIE的催化和功能机制，笔者等解析了人源GIIE (Human GIIE，hGIIE) 的晶体结构[12]。结果显示，hGIIE的整体结构与GIB、GIIA和GX相类似，具有家族保守的催化二联体His-Asp和钙结合环。hGIIE具有两个钙结合位点，其中一个为典型的钙结合环，和其他同家族成员一样，此处的钙离子为催化反应所必需[13]，参与底物结合和催化过程，另一个钙结合位点比较灵活，钙结合不稳定。当hGIIE结合抑制剂之后，活性口袋部位为了容纳抑制剂，21位的氨基酸发生构象改变，带动邻位D22构象改变，破坏了第二个钙结合位点的钙结合。我们通过N21的突变实验证明N21通过影响钙的结合调节hGIIE的酶活性[14]。hGIIE对酸性磷脂的水解活性比较低，与GIIA相比，hGIIE底物结合界面的正电荷较少，这是hGIIE对酸性磷脂的水解活性较低的原因之一。底物与GIIE的复合物模型发现，位于54位的氨基酸，可能参与底物头基的结合[12]。因此，本研究通过突变实验旨在验证E54位氨基酸对hGIIE的底物头基的选择性，为分析hGIIE以及sPLA2家族其他成员的生理功能和进一步抑制剂药物设计提供理论基础。
1 材料与方法1.1 菌株和试剂1.1.1 菌株克隆菌株大肠杆菌Escherichia coli Top10，表达菌株毕赤酵母Pichia pastrois X33。
1.1.2 质粒pGAPZαA购自Invitrogen公司。
1.1.3 培养基低盐LB培养基：0.5%酵母提取物，0.5% NaCl，1%蛋白胨；低盐LB固体培养基是在低盐LB中添加1.5%琼脂。YPD培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；抗生素Zeocin购自Invitrogen公司。
1.1.4 酶限制性内切酶(EcoRⅠ、XbaⅠ和BlnⅠ)、SolutionⅠ、PrimeSTAR HS DNA Polymerase购自TaKaRa公司；普通Taq酶购自康润生物GenStar公司。
1.1.5 生化试剂MES、Tris、NaCl (纯化用)、CaCl2购自Sigma公司；培养基用NaCl购自西陇化工。
1.2 PCR引物的设计根据人源分泌性磷脂酶A2 GIIE的基因序列(GenBank/EMBL Accession No. NM_014589) 设计并合成E54对应的突变体引物以及上、下游引物(表 1)。上、下游引物对应的酶切位点分别为EcoRⅠ和XbaⅠ。
表 1 GIIE突变体的引物序列Table 1 Primer sequence used to amplify mutated hGIIE
| Primer name | Forward primer (5′–3′) | Reverse primer (5′–3′) |
| hGIIE | CCGGAATTCAATCTGGTTCAGTTTGGCG | CTAGTCTAGATCAGCACGGCGGCGTCGGA |
| E54A | TACGGCCGTCTGGCTAAACTGGGTT | CAACCCAGTTTAGCCAGACGGCCGT |
| E54F | ACGGCCGTCTGTTCAAACTGGGTTG | CAACCCAGTTTGAACAGACGGCCGT |
| E54K | ACGGCCGTCTGAAGAAACTGGGTTG | CAACCCAGTTTCTTCAGACGGCCGT |
| Restriction enzyme sites including EcoRⅠ and XbaⅠ are underlined. | ||
表选项
1.3 序列分析用Multialign软件进行多序列比对分析，结果用ESPript导出。
1.4 突变体目的基因的获得以实验室保存的重组质粒hGIIE-pGAPZαA为模板，采用两步PCR法，先分段扩增短的目的基因片段，再通过重叠延伸PCR法[15]将短的目的基因片段拼接成全长基因片段。反应条件为：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，53 ℃ 10 s，72 ℃ 40 s，循环5次；98 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 40 s，循环25次；72 ℃ 5 min。得到一个约400 bp的目的基因片段；琼脂糖凝胶电泳后，采用DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段。
1.5 重组表达载体的构建将扩增获得的突变体基因E54A、E54F和E54K片段以及质粒pGAPZαA分别用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切处理。将酶切后的目的基因和质粒加入SolutionⅠ连接体系，16 ℃连接90 min，连接产物转化E. coli Top10后，涂布于低盐LB (含25 μg/mL Zeocin) 平板上，37 ℃培养12–16 h。挑取LB平板上的单克隆，采用hGIIE上游引物和质粒通用下游引物3AOX，进行菌落PCR鉴定。PCR条件为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循环30次；72 ℃ 5 min。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。阴性对照为空质粒。挑选菌落PCR鉴定的阳性克隆，接种到10 mL低盐LB液体培养基中，过夜培养。取菌液送至生工生物工程(上海) 股份有限公司测序分析。
1.6 重组毕赤酵母表达菌株的构建将重组质粒E54A/E54F/E54K-pGAPZαA用BlnⅠ限制性内切酶单酶切线性化处理。制备毕赤酵母感受态细胞。将线性化的质粒电转进入毕赤酵母感受态细胞后，涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPD平板上，29 ℃避光培养72 h。采用酵母菌落PCR鉴定阳性重组菌株。用hGIIE上下游引物，进行菌落PCR。反应条件为：预变性95 ℃ 8 min；变性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 50 s，循环30次；终延伸72 ℃ 1 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，阴性对照采用不含质粒的X33作为模板的PCR产物。挑取阳性克隆菌落于10 mL YPD (含100 μg/mL Zeocin) 培养基中，29 ℃、220 r/min避光培养48 h。SDS-PAGE初步验证表达情况。
1.7 重组蛋白的表达和纯化将重组毕赤酵母X33-E54A/E54F/E54K- pGAPZαA分别接种到添加了Zeocin的YPD培养基中，避光培养55 h后，高速冷冻离心收集上清液。将发酵液进行过滤除菌、浓缩换盐处理。采用AKATA纯化系统，通过两步纯化法纯化蛋白。用阳离子交换柱(SP，High performance) 进行初步纯化(缓冲液A：50 mmol/L MES，pH 6.0；缓冲液B：50 mmol/L MES，1 mol/L NaCl，pH 6.0)，采用分子筛Superdex 200 Hiload 16/60进行精细纯化，缓冲液条件为20 mmol/L Tris，200 mmol/L NaCl，pH 8.8。
1.8 酶动力学参数的测定本实验采用等温微量热滴定仪Microcal ITC200测定了hGIIE对不同头基底物的选择性。底物包括1, 2-二己酰卵磷脂(1, 2-dihexanoyl-sn- glycero-3-phosphocholine，DHPC) 和1, 2-二己酰磷酸甘油(1, 2-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphorrac- 1-glycerol，DHPG)。反应缓冲液为100 mmol/L Tris，150 mmol/L KCl，10 mmol/L CaCl2，pH 7.5。首先清洗ITC样品池和滴定针，用水上样，使得样品池和滴定针中的样品均为水，通过水滴水实验检测ITC的清洁度；然后清洗ITC样品池和滴定针，更换参比池中的水；准备底物母液，配制200 mmol/L底物母液，其中DHPG用水溶解，DHPC用DMSO溶解；准备底物工作液并上样，用缓冲液稀释底物母液，DHPG、DHPC的浓度分别为20 mmol/L和50 mmol/L，取60 μL到小EP管中，按照系统程序上样到注射器；准备蛋白样品，蛋白母液的缓冲液为反应缓冲液，将蛋白稀释到终浓度为2 μmol/L，为保证蛋白和底物的缓冲液完全一致，需要在蛋白溶液中加入等量的水或者DMSO，准备300 μL样品加入到ITC样品池中，保证无气泡；设置反应参数并开始实验，本实验采用螺旋桨滴定针，搅拌速度设为750 r/min；采用多点连续滴定法，每滴3 μL，总共13滴，反应间隔120 s；填写对应注射器中底物浓度和样品池中蛋白浓度，确认无误后，开始实验；测定反应焓变?H：采用单点滴定法测定焓变，每滴6 μL，反应时长1 800 s，底物浓度和蛋白浓度与上面一致；采用Origin软件进行数据处理，求得Km和kcat值。
2 结果与分析2.1 hGIIE的E54突变位点分析hGIIE属于分泌性磷脂酶A2 (sPLA2) 的成员之一，催化活性中心具有保守的催化二联体His46和Asp90 (图 1A)。hGIIE为金属酶，具有两个钙结合位点(图 1A)。除了活性位点氨基酸H46和Ca1之外，活性口袋附近的氨基酸E54、K61也参与了底物的结合过程(图 1B)。
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| 图 1 hGIIE的晶体结构模型 Fig. 1 Crystal structure of human secreted phospholipase A2 group IIE (PDB: 5WZM[12]). (A) Structure of hGIIE shown in cartoon representation. The catalytic dyad H46 and D90 are shown as green sticks. Calcium ions are shown as green spheres. (B) Structure of hGIIE shown in surface representation. Residues E54 and K61 near the active pocket are labeled. |
| 图选项 |
将hGIIE与其他同家族的人源的sPLA2成员在催化口袋区域进行了序列比对分析，第54位的氨基酸相对保守，GIIE、GIIA、GV和GX在此位点均为谷氨酸(E)，GIID和GIB在54位为赖氨酸(K)，GIIF在54位为苯丙氨酸(F) (图 2)。为了验证E54对底物磷酸头基的选择性，我们将hGIIE的E54分别突变为K、F和A。
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| 图 2 hGIIE与同家族其他成员在活性口袋部位的氨基酸序列比对分析 Fig. 2 Multiple sequences alignments of hGIIE with other human sPLA2s in the active pocket. Residues are shown in white on the red background in case of strict identity. Secondary structure elements of hGIIE are shown at the top. Residue in position 54 and 61 are marked in red triangle. Multialignment is performed using the program Multialign[16] and ESPript 3.0[17]. |
| 图选项 |
2.2 突变体基因的克隆和重组菌株的构建为实现hGIIE突变体E54A、E54F和E54K在毕赤酵母中的重组表达，我们以野生型质粒hGIIE_pGAPZαA为模板，采用重叠延伸PCR法获得了突变体目的基因(图 3)，并通过EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切连接到载体pGAPZαA中。测序结果表明hGIIE基因和载体连接正确。将获得的重组质粒经过BlnⅠ线性化处理后，电转进入毕赤酵母X33，利用YPD平板(含100 μg/mL抗生素Zeocin) 筛选阳性重组子。
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| 图 3 hGIIE突变体基因的两步PCR法扩增 Fig. 3 Scheme of hGIIE mutagenesis by overlap extension PCR. Arrows indicate the primers used in PCR. |
| 图选项 |
2.3 突变体蛋白在酵母菌株中的表达及纯化将hGIIE突变体E54A、E54F和E54K对应的阳性重组子用含有100 μg/mL抗生素Zeocin的液体YPD培养基进行扩大培养55 h，实现hGIIE突变体在毕赤酵母中的分泌性组成型表达；高速冷冻离心之后，保留上清液；对上清液进行过滤、浓缩预处理；上清液通过阳离子SP柱进行初步纯化，然后再通过分子筛Superdex 200进行精细纯化。结果显示，样品经过阳离子柱初步纯化，SDS-PAGE结果显示的峰尖蛋白纯度已经达到90%以上(图 4A–C)，因为多数酵母内源蛋白为酸性蛋白，在酸性条件下带负电，不能够吸附到阳离子交换柱上，而hGIIE预测的等电点为pH 8.3，在酸性条件下带正电，可以牢牢地吸附在阳离子柱SP上，因而可以通过低盐洗脱去除掉杂蛋白，来分离目的蛋白。我们通过分子排阻Superdex 200对蛋白进行状态分析，发现hGIIE突变体蛋白E54A、E54F和E54K分子筛的出峰位置在19.5 mL左右，而且峰形单一对称。蛋白纯度高达90%以上，状态均一，可用于后续酶活性测定。
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| 图 4 hGIIE突变蛋白的纯化结果 Fig. 4 Purification of mutants E54A, E54F and E54K by ion exchange SP column and size exclusion chromatography. (A–C) Ion exchange SP column results of mutants E54A, E54F and E54K. (D) Superdex 200 chromatography result of mutants E54A, E54F and E54K. SDS-PAGE analysis of the peak samples is inserted. |
| 图选项 |
2.4 突变体蛋白的酶动力学参数的测定采用等温微量热滴定仪测定了纯化后的hGIIE突变体蛋白对底物DHPC和DHPG的底物选择性(图 5)。结果显示，相比于hGIIE野生型蛋白，突变体蛋白与DHPG和DHPC的亲和力均发生了改变，其中突变体E54K与DHPG的Km值为WT的0.39倍，亲和力明显增强。而突变体E54F与DHPC的Km值增大，为WT的1.93倍，亲和力明显减弱(表 2)。突变体蛋白的转换数kcat降低，为WT的0.13–0.39倍。说明E54在GIIE的磷脂底物选择性水解过程中起着重要作用。
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| 图 5 等温微量热滴定仪测定hGIIE突变体蛋白的底物选择性 Fig. 5 Phospholipid head group selectivity of hGIIE determined by isothermal titration calorimetry method. (A–C) 1, 2-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphor-rac-1-glycerol (DHPG). (D–F) 1, 2-dihexanoyl-sn-glycero-3phosphocholine (DHPC). Heat flows are converted to specific enzyme activities. Data is fitted to the standard Michaelis-Menten equation, trend line is shown in red. |
| 图选项 |
表 2 hGIIE野生型和突变体对底物DHPG和DHPC的动力学常数Table 2 Kinetic parameters of wild type and mutant hGIIE
| DHPG (6:0) | DHPC (6:0) | ||||||
| Km (mmol/L) | kcat (1/s) | kcat/Km | Km (mmol/L) | kcat (1/s) | kcat/Km | ||
| WT | 1.62±0.06 | 1.76±0.03 | 1.09 | 5.52±1.00 | 3.22±0.30 | 0.58 | |
| E54A | 1.09±0.05 | 0.69±0.01 | 0.63 | 3.25±0.47 | 0.62±0.04 | 0.19 | |
| E54F | 1.49±0.06 | 0.48±0.01 | 0.32 | 10.70±1.60 | 0.97±0.07 | 0.09 | |
| E54K | 0.63±0.04 | 0.25±0.01 | 0.40 | 3.89±0.56 | 0.44±0.03 | 0.11 | |
表选项
3 讨论sPLA2与哮喘、风湿性关节炎等炎症疾病以及动脉粥样硬化、高血脂等代谢性疾病密切相关。sPLA2可以通过发挥酶催化功能参与机体的生理和病理过程。
hGIIE具有不同于其他sPLA2的底物偏好性。多数sPLA2的最适底物为酸性磷脂PG，其中hGIIA对PG的水解活性最高。hGIIE虽然与hGIIA具有较高的序列相似性，但是对PG无水解偏好性。因为hGIIE在N端和C端区域具有较多的不带电氨基酸，对酸性底物PG的识别结合作用较弱[12]。相反，hGIIA在N端和C端区域具有较多的碱性氨基酸，而且将N端的碱性氨基酸R7和K10突变为酸性氨基酸后，它对PG的亲和力减弱45倍[18]。
GIIE敲除小鼠实验显示，GIIE通过选择性释放溶血磷脂酰乙醇胺(Lysophosphatidylethanolamine，LPE) 来调节小鼠皮肤稳态[9]。在脂蛋白颗粒中，磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC) 为其中的主要成分，然而GIIE却对脂蛋白颗粒中含量极少的磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)和磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS) 具有水解偏好性[19]。这些底物与hGIIE的对接模型显示，底物PC、PE、PS和PG头基上的磷酸基团均可以与K61形成盐键，61位的氨基酸决定了hGIIE具有催化磷脂水解的特性。除底物PC外，PE、PS和PG均可以与hGIIE的E54形成氢键相互作用，E54与PE形成一个氢键相互作用，与DHPG形成两个氢键相互作用，但与DHPC未形成氢键相互作用。说明E54可能在hGIIE选择性水解磷脂发挥生理功能的过程中起着重要作用[12]。
本研究对E54进行了突变，通过大量表达纯化，获取目的蛋白，并验证E54对hGIIE底物选择性的影响。由于缺乏商品化的hGIIE特异性抗体，且目的蛋白两端没有连接可供检测的标签，所以文中未对目的蛋白进行Western定性分析。hGIIE等电点预测值为pH 8.3，分子量为14 kDa，且具有催化磷脂水解的活性。本研究通过阳离子交换收集碱性蛋白，并通过SDS-PAGE确定目的蛋白分子量为14 kDa，通过ITC测定纯化后的蛋白具有催化磷脂水解的活性，由此得出所获得的蛋白为hGIIE蛋白。E54突变为碱性氨基酸K后，与酸性磷脂PG的亲和力明显提高。PG的甘油羟基均可与谷氨酸E和赖氨酸K的侧链形成氢键相互作用。推测E54K突变体通过创造局部碱性环境，促进了酸性磷脂底物PG的结合。hGIB对酸性磷脂PG的水解活性为hGIIE的2 000倍[20]，可能的原因之一为hGIB在54位的碱性氨基酸K对酸性磷脂的选择性。而将E54突变为较大的疏水氨基酸F后，由于空间位阻，hGIIE突变体蛋白与中性磷脂PC的亲和力显著减弱。GIIF的54位的疏水氨基酸F对磷脂底物PC的空间位阻可能导致其PC的水解活性最低[20]。hGIIE突变体E54F和E54K与不同磷脂底物亲和力的显著变化证明E54在hGIIE的选择性水解磷脂底物过程中发挥重要作用。E54突变为疏水氨基酸A和F、碱性氨基酸K之后，hGIIE突变体蛋白对底物PG和PC的转换数kcat均减小。可能是由于E54位于hGIIE蛋白的典型钙结合环对面，典型钙结合环周边的酸性环境有利于催化必需基团——钙离子的结合。将E54突变为碱性或电中性氨基酸之后，可能会影响hGIIE的钙结合，进而影响了酶催化效率。
4 结论本研究采用重叠延伸PCR法对hGIIE蛋白在E54位点进行了定点突变，分别突变为丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F) 和赖氨酸(K)；并采用毕赤酵母组成型分泌表达系统对这3个突变体进行了表达；采用阳离子交换和分子排阻两步纯化法对蛋白进行了纯化；最后采用等温微量热滴定仪对纯化后的蛋白进行了活性测定。相比野生型hGIIE蛋白，E54突变体对底物PG和PC的亲和力发生了明显变化，说明E54是决定hGIIE底物头基选择性的关键氨基酸。
参考文献
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| [3] | Murakami M, Taketomi Y, Miki Y, et al. Recent progress in phospholipase A2 research: from cells to animals to humans. Progr Lipid Res, 2011, 50(2): 152-192. DOI:10.1016/j.plipres.2010.12.001 |
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