孙雪^1,2, 董永华³, 王娜², 崔文会^2,4, 廖鲜艳¹, 刘莉²
1. 上海大学 生命科学学院，上海 200444;
2. 中国科学院上海高等研究院，上海 201210;
3. 上海市农产品质量安全中心，上海 200335;
4. 上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海 200093
收稿日期：2019-11-20；接收日期：2020-02-13；网络出版时间：2020-03-02
基金项目：上海市科委项目(No. 18295810400)，上海市科技兴农项目(No. 2019-02-08-00-16-F01140)，上海市崇明区农业科创项目(No. 2019CNKC-05)资助

摘要：盐分是影响作物生长最重要的因素，使用能促进植物生长的耐盐碱促生菌减轻盐胁迫引起的损害是一种农业上的有效方法。文中从盐碱地筛选得到7株耐盐细菌，并考察筛选菌株的产胞外聚合物(EPS)能力、降碱能力和产吲哚-3-乙酸(IAA)能力。经综合评价选出1株优势菌株DB01，菌株DB01产EPS能力为0.21 g/g，降碱能力为8.7%，产IAA的能力为8.97 mg/L。菌株经16S rRNA鉴定为海水盐单胞菌Halomonas aquamarina，并且有抑制香蕉枯萎病、番茄早疫病、大豆疫霉病、小麦纹枯病病原菌的能力，同时能够在盐胁迫下促进小麦幼苗的发芽率和根长。海水盐单胞菌Halomonas aquamarina DB01可为土壤微生物资源开发利用和盐碱地改良提供理论依据。
关键词：耐盐降碱胞外聚合物促生特性促生效应
Screening and evaluation of saline-alkali-tolerant and growth-promoting bacteria
Xue Sun^1,2, Yonghua Dong³, Na Wang², Wenhui Cui^2,4, Xianyan Liao¹, Li Liu²
1. School of Life Sciences, Shanghai University, Shanghai 200444, China;
2. Shanghai Advanced Research Institute, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201210, China;
3. Shanghai Quality Safety Center of Agricultural Products, Shanghai 200335, China;
4. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China
Received: November 20, 2019; Accepted: February 13, 2020; Published: March 2, 2020
Supported by: Shanghai Science and Technology Commission Project (No. 18295810400), Shanghai Agriculture Applied Technology Development Program (No. 2019-02-08-00-16-F01140), Shanghai Chongming District Agricultural Science and Technology Innovation Project (No. 2019CNKC-05)
Corresponding author: Li Liu. Tel/Fax: +86-21-20325161; E-mail: liul@sari.ac.cn.

Abstract: Salinity is the most important factor for the growth of crops. It is an effective method to alleviate the toxic effect caused by salt stress using saline-alkali-tolerant and growth-promoting bacteria in agriculture. Seven salt-tolerant bacteria were screened from saline-alkali soil, and the abilities of EPS production, alkalinity reduction and IAA production of the selected strains were investigated. A dominant strain DB01 was evaluated. The abilities of EPS production, alkalinity reduction and IAA production of strain DB01 were 0.21 g/g, 8.7% and 8.97 mg/L, respectively. The isolate was identified as Halomonas aquamarina by partial sequencing analysis of its 16S rRNA genes, and had the ability to inhibit the growth of Fusarium oxysporum f. sp., Alternaria solani, Phytophthora sojae and Rhizoctonia cerealis. It also could promote root length and germination rate of wheat seedlings under salt stress. Halomonas aquamarina can provide theoretical basis for the development of soil microbial resources and the application in saline-alkali soil improvement.
Keywords: salt-tolerantalkalinity reductionextracellular polymergrowth-promoting propertiesgrowth-promoting effect
土地盐碱化是一个影响全世界的土壤退化问题，盐碱化不仅降低了耕地的作物产量，而且严重限制耕地利用的可持续性，阻碍了农业的发展^[1]。我国盐碱地面积位列全球第三，面积约有1×10⁸ hm²，广泛分布于我国西北、东北、华北以及滨海地区^[2-3]。除自然形成的盐碱地外，人们对化肥和农药的滥用以及不当的耕作方式，也会造成盐分在耕作层的累积从而导致土地次生盐渍化的形成^[4]。根据目前耕地面积快速减少的趋势，增加耕地面积、修复耕地生态已经成为重中之重，盐碱地的改良已成为增加和改善耕地的突破口。根据《关于开展全国耕地后备资源调查评价工作的通知》(国土资厅发〔2014〕13号)^[5]，轻度和中度盐碱地已然成为我国耕地后备资源，这为盐碱地的改良和利用提供更加坚实的理论支持。
目前国内外对盐碱地的修复研究主要集中在物理和化学法修复，但是这两种修复方法的费用较为昂贵，生物修复因具有成本低且无二次污染等优点成为盐碱地修复的新兴方法^[6]。盐碱地易形成土壤板结，造成土壤的透气性差，而耐盐碱促生微生物分泌的胞外聚合物(EPS)能通过范德华力和静电引力与土壤颗粒形成土壤团聚体，增加土壤的透气性，同时减少盐离子对作物的毒害作用^[7]。此外它们还能够分泌吲哚-3-乙酸(IAA)等植物生长激素来调控盐胁迫下植物的系统反应。利用耐盐碱促生菌促进植物根系的生长，减缓盐胁迫对植物的不利，进而达到改善盐碱地的目的。由于耐盐碱微生物是生物修复的重要组成，因此，筛选一株能够改善土壤质地、促进植株生长的菌株，是盐碱土壤可持续发展的关键^[8]。本实验研究从江苏如东盐碱土分离得到耐盐菌株，并对其产EPS能力、降碱能力、产IAA能力、病原菌拮抗等多重生理指标以及在盐胁迫下对作物的促生效应进行初步探讨，为研制改良盐碱地微生物菌剂提供理论支持。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 盐碱土壤样品供试土壤于2018年11月采集于江苏省南通市如东县沿海盐碱土(32°50'N，121°14'E)。该盐碱土的可溶性总盐含量为0.7%，pH为8.99，电导率为3.62 mS/cm。
1.1.2 种子和实验病原菌实验种子采用小麦Triticum aestivum种子。
指示病原菌：香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp.、番茄早疫病菌Alternaria solani来自海南大学热带农林学院农药实验室；大豆疫霉病菌Phytophthora sojae、小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis来自中国农业微生物菌种保藏管理中心。
1.1.3 培养基10%氯化钠的LB培养基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 100 g，加蒸馏水配制至1 000 mL。固体培养基中琼脂的添加量为1.5%。
5%氯化钠的LB培养基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 50 g，加蒸馏水配制至1 000 mL。
LB培养基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加蒸馏水配制至1 000 mL。固体培养基中琼脂的添加量为1.5%。
pH=10的LB培养基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加蒸馏水配制至1 000 mL。用碳酸钠调节培养基的pH值，碳酸钠溶液采用过滤灭菌，当培养基冷却至50 ℃时加入碳酸钠溶液调节培养基的pH值到10^[9]。
产EPS菌株发酵培养基：蔗糖20 g，K₂HPO₄ 0.2 g，KH₂PO₄ 0.5 g，NaCl 100 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，酵母膏3 g，加蒸馏水配制至1 000 mL^[10]。
所有培养基均于121 ℃灭菌20 min。
1.1.4 主要试剂和仪器AxyPrep基因提取试剂盒、Taq酶、DNA Ladder Mix、dNTP均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；其余试剂均为分析纯试剂，购自上海国药集团化学试剂有限公司。Salkowski试剂：浓H₂SO₄ 10.8 mol/L，FeCl₃ 4.5 mol/L。
S1000-PCR扩增仪：美国BIO-RAD；HQ40d便携式pH计：美国哈希公司；ZWY-2102C恒温振荡摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；DR2800台式可见光分光光度计：美国哈希公司；L550医用离心机：湖南湘仪实验室仪器有限公司。
1.2 方法1.2.1 耐盐微生物的筛选菌株的分离：取5 g供试土壤加入装有100 mL无菌水的锥形瓶中，180 r/min振荡30 min，使供试土壤中的微生物充分分散于无菌水中，得到土壤混合液。将土壤混合液按梯度进行稀释，选择浓度梯度为10^–2、10^–3、10^–4、10^–5、10^–6的土壤混合液进行涂布，吸取100 μL菌悬液涂布于10%氯化钠的LB固体培养基中用于分离耐盐微生物。将平板倒置放入30 ℃恒温培养箱中培养48–96 h^[10]。
菌株的纯化：根据菌落形态、颜色以及大小的区别，挑取单个微生物菌落，之后进行多次纯化直至获得单克隆菌株，纯化获得的菌株用30%的甘油储存于?80 ℃冰箱。
1.2.2 菌株产EPS能力的测定将初筛得到的耐盐菌株接入产EPS菌株发酵培养基中，接种量为5%，培养温度为30 ℃，培养时间为3 d。3 d后取10 mL发酵液4 000 r/min离心15 min，去除菌体，菌体105 ℃烘干称重。上清液加入3倍体积95%乙醇进行醇沉，4 ℃过夜，混合液4 000 r/min离心30 min，倒去上清液，沉淀105 ℃下烘干称重。通过EPS重量和菌株干重的比值得出单位重量菌株的EPS的产量^[11]。
1.2.3 菌株降碱能力的测定降碱能力的平板验证：将筛选得到的菌株在pH=10的LB固体培养基上进行划线，将平板倒置放入30 ℃恒温培养箱中培养48–96 h。观察是否有菌株生长，生长的菌株进行后续的摇瓶验证。
降碱能力的摇瓶测定：将平板生长情况较好的菌株接入到pH 10的LB液体培养基中，每隔12 h观察菌株生长情况和pH值的变化情况。菌株以5%的接种量接入pH 10的LB液体培养基中。菌株的降碱率按照下式进行计算：

(1)

式中：η为降碱能力，%；pH_前为发酵前培养基的pH值；pH_后为发酵后培养基的pH值^[12]。
1.2.4 菌株产IAA能力的测定吲哚-3-乙酸(IAA)是一种植物生长激素，它能够促进植株的生长。盐分会抑制植物体内IAA的合成，可以通过菌株分泌的外源IAA刺激植物体内IAA的合成。菌株产IAA的能力采用Salkowski比色法测定，本研究采用5%氯化钠的LB培养基作为发酵培养基，观察高盐情况下，菌株IAA的产生情况。菌株以5%的接种量接入5%氯化钠的LB液体培养基中。30 ℃、180 r/min振荡2 d，之后将菌液10 000 r/min离心10 min，取2 mL上清液加入相同体积的Salkowski试剂混合均匀，于黑暗处反应30 min后测定溶液在530 nm处的吸光值，通过制作好的标准曲线计算出发酵液中IAA的含量^[13]。
1.2.5 菌株的鉴定用16S rRNA基因序列分析的方法对筛选所得菌株进行鉴定，本实验使用AxyPrep细菌基因组DNA小量制备试剂盒，提取基因组，采用细菌常用通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3′)进行PCR^[14]。
PCR采用20 μL反应体系：Taq酶10 μL，模板0.5 μL，引物各0.6 μL，添加ddH₂O至体系总体积为20 μL。
PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环30次；72 ℃补延伸10 min，16 ℃降温5 min结束。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行条带检测，送往上海杰李生物技术有限公司进行纯化测序。根据测序所得16S rRNA序列在GenBank中BLAST搜索同源序列^[15]。
1.2.6 菌株拮抗病原微生物能力的测定测定筛选所得优势菌株对香蕉枯萎病菌、番茄早疫病菌、大豆疫病霉菌以及小麦纹枯病菌的抑制能力。将4种致病菌分别接入到LB固体培养基中培养7–9 d。之后再分别在真菌菌丝生长最旺盛的地方用灭过菌的打孔器进行打孔，将这些带有菌丝的培养基接入到新的LB培养基的正中间，同时在距平板中心2.5 cm的位置接入筛选获得的菌株，30 ℃下培养，每天观察菌株和真菌的生长状况以及菌株对真菌的拮抗效果^[16-17]。
1.2.7 菌株促生能力的测定种子液的制备：菌株以5%的接种量接入LB液体培养基中，30 ℃培养48 h。之后菌液以8 000 r/min离心10 min去除上清液，用无菌水将菌体悬浮成OD=0.2的菌株悬浮液。
种子处理：挑选大小一致、饱满的小麦种子，用75%的乙醇消毒3 min，之后用无菌水清洗3次，去除残留的乙醇。将处理过后的种子于室温下浸泡在制备好的菌株悬浮液中3 h^[13]。
发芽床的制备：选择无菌培养皿进行实验，使用吸水性和保水性较好的滤纸作为纸床。每组30粒小麦种子作为一个平行，重复3次。采用不同NaCl浓度(0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L)的水溶液浸湿滤纸来营造不同盐胁迫的环境，纸床在吸足水后，去除多余水分。种子在25 ℃下暗培养4 d后，测定种子发芽率(GR)、根长、茎长和简化活力指数(SVI)。SVI的计算公式如下^[18]：

(2)

1.3 数据处理数据的差异显著性分析通过SPSS软件获得。
2 结果与分析2.1 耐盐菌株的筛选从初筛培养基的平板中，根据菌落形态特征分离纯化得到7株耐10%氯化钠的耐盐菌株，菌落形态以及生长情况见表 1。
表 1 菌落形态Table 1 Colony morphology

Strain	Colony morphology	Growth situation
YJY01	Round, white, opaque, convex colonies, neat edge, moist, smooth and shiny surface.	++
YJY04	Flat, yellow, round, opaque colonies, neat edge, smooth and shiny surface.	++
YJJ01	Round, milky white, opaque, convex colonies, fluffy edge, smooth and shiny surface.	++
YJJ02	Round, white, opaque, convex colonies, dry and dull surface, irregular and flocculent edge.	+
YJJ03	Luminous yellow, round, opaque, swell colonies, neat edge, smooth and shiny surface.	+
YJJ04	Light pink, round, opaque, flat colonies, neat edge, smooth and shiny surface.	+
DB01	Yellow, round, opaque, flat colonies, neat edge, moist surface.	+++
“+” represents colony diameter < 0.5 mm, “++” represents 0.5 mm < colony diameter < 2 mm, “+++” represents colony diameter > 2 mm.

表选项


2.2 菌株生理活性EPS因含有羟基、羧基等官能团，故其能够吸附环境中的金属离子。同时EPS还能通过范德华力与土壤胶体相结合形成土壤团聚体，从而抵抗盐离子对植物的毒害作用。通过考察筛选所得菌株的产EPS能力和耐碱能力，得到的7株菌株都有分泌EPS的能力，其中菌株YJY01产EPS的能力最高，产量为0.42 g/g，但是其无法在耐碱培养基上生长。除YJY01之外，其余菌株都可在耐碱培养基上生长，且有一定的降碱能力，菌株YJJ02的降碱能力最强，能够达到12%，同时所有菌株在生长周期的前12 h有较高的降碱能力，后期随着菌株的消亡，细胞内容物溢出，使得发酵液pH值呈现逐步上升的趋势。
IAA是较为常见的植物促生长激素，当环境中盐浓度增加时，植物体内的内源IAA的含量将会减少，此时可以通过外加菌株分泌的IAA来刺激植物产生内源IAA而促进植物的生长。观测高盐情况下菌株IAA的产生量，结果如表 2所示，筛选所得菌株在高盐情况下皆有产生IAA的能力并且皆大于1 mg/L，其中菌株DB01分泌IAA的能力最强为8.97 mg/L，根据上述3种能力，挑选优势菌株DB01进行16S rRNA基因鉴定和革兰氏染色，并进行致病菌拮抗实验和小麦发芽率实验。
表 2 菌株生理活性Table 2 Physiological activity of strains

Strain	EPS production (g/g)1	Alkaline plate2	Alkalinity reduction (%)3	IAA production (mg/L)
YJY01	0.42±0.01a	–	–	2.65±0.06d
YJY04	0.13±0.00c	+	3.6±0.16e	1.09±0.07e
YJJ01	0.15±0.03c	++	6.0±0.04c	3.97±0.08c
YJJ02	0.29±0.08b	++	12.1±0.04a	1.27±0.03e
YJJ03	0.24±0.01b	++	5.3±0.08d	2.70±0.06d
YJJ04	0.27±0.03b	++	5.8±0.57c	5.14±0.07b
DB01	0.23±0.04b	++	8.7±0.08b	8.97±0.24a
1: EPS yield is the ratio of net EPS secreted by the strain after subtracting EPS from the medium to the dry weight of the strain, 2: “+” represents colony diameter < 0.5 mm, “++” represents 0.5 mm < colony diameter < 2 mm, “–” represents no growth, 3: Alkalinity reduction is the value after subtracting the blank. a, b, c, d, e: there were significant differences between the values at P < 0.05.

表选项


2.3 菌株的鉴定将筛选得到的优势菌株DB01的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的核酸序列数据进行BLAST对比分析，选取其中同源性最高的菌株作为代表菌株。使用MEGA 7.0进行菌株系统发育树的构建，具体菌株同源性信息见图 1，由图 1可知DB01与Halomonas aquamarina (GenBank登录号：EF143431.1)聚为一支，表明DB01的16S rRNA的基因序列与其有着最高的同源性，相似性为100%，因此可以判定菌株DB01为海水盐单胞菌Halomonas aquamarina。菌株的具体形态见图 2，由图 2可知菌株DB01为革兰氏阴性、呈现杆状。目前从盐碱地中筛选得到耐盐碱促生菌大多为芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞杆菌属(Pseudomonas)、盐杆菌属(Halobacillus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)等。仅有个别文章提到期望盐单胞菌可作为提高植物耐盐性的根际促生菌(PGPR)，但是还并未有文章提及Halomonas aquamarina可作为耐盐促生菌^[19-22]。与其他耐盐促生菌相比，Halomonas aquamarina不仅能够耐受高盐环境也可在高碱环境下生存，能够在高盐环境下分泌IAA，通过刺激内源IAA和抗氧化酶的产生增加植物对高盐环境的耐受能力，具有铁载体和蛋白酶的产生能力，表明其有望成为生防耐盐促生菌的潜力。Halomonas aquamarina可以定殖在植物根系，通过产生的EPS结合钠离子来减少钠离子在作物体内的累积，还可以增加根系周边的营养来促进作物的生长。

图 1 菌株DB01的系统进化树 Fig. 1 Phylogenetic tree of strain DB01

图选项

图 2 菌株DB01的镜检图 Fig. 2 Microscopic examination of strain DB01

图选项

2.4 菌株抑菌能力将菌株DB01与香蕉枯萎病、番茄早疫病、大豆疫霉病、小麦纹枯病的致病菌接入同一平板中观察菌株对致病菌的抑制效果。实验发现DB01对以上4种致病菌皆有抑制能力，由图可知，菌株对番茄早疫病菌和小麦纹枯病菌的抑制能力较强，赵新贝等、王平等提到菌株可以通过分泌HCN等抑菌物质来抑制病原菌生长，同时也可以通过分泌胞外酶(几丁质酶、葡聚糖)来分解致病菌的细胞壁从而导致致病菌死亡，还可以通过分泌铁载体和病原菌争夺土壤中的铁元素抑制致病菌的生长^[23-25]。菌株DB01的生防机理尚未见报道，有待后续研究。

图 3 DB01对致病菌的抑制情况 Fig. 3 The inhibition of pathogenic bacteria by DB01

图选项

2.5 菌株对小麦的促生效果不同盐胁迫下菌株DB01对小麦发芽率、根长、茎长以及简化活力指数的影响如表 3所示。随着盐浓度增加，对照组和实验组的发芽率同时呈现降低的趋势，但菌株DB01处理过的小麦种子的发芽率均高于对照组，菌株DB01仅在没有盐胁迫下能够显著促进茎长，但是从0 mmol/L开始，处理组的根长显著高于对照组的根长，分别增加50%、30%、43%、39%和38%，小麦简化活力指数和根长呈现同一趋势，和对照相比增加49%、21%、32%、42%和34%，这说明在盐胁迫下菌株DB01对小麦生长有着一定程度的促进作用。
表 3 菌株DB01对小麦幼苗的促生作用Table 3 The promoting effect of strain DB01 on wheat seedlings

NaCl concentration (mmol/L)	Treatment	Germination rate (%)	Shoot length (cm)	Root length (cm)	SVI
0	CK	75.00±6.80a	2.30±0.18a	3.42±0.56b	431.98±85.91b
	DB01	80.00±8.16a	2.87±0.08b	5.12±0.13a	640.29±77.37a
50	CK	73.33±13.61ab	1.76±0.13c	2.61±0.03dcd	320.40±57.8cd
	DB01	73.33±9.81ab	1.77±0.41c	3.39±0.58b	387.04±119.88bc
100	CK	65.56±8.31b	1.26±0.1d	1.98±0.14e	212.40±16.78de
	DB01	70.00±2.72ab	1.16±0.08d	2.84±0.13bc	280.39±22.4cd
150	CK	53.33±0.00cd	0.69±0.06e	1.82±0.32e	133.88±19.72ef
	DB01	58.33±1.36c	0.72±0.11e	2.53±0.22cd	189.80±11.03f
200	CK	47.78±3.14d	0.55±0.06e	1.35±0.24e	91.50±18.62e
	DB01	51.11±4.16cd	0.52±0.04e	1.86±0.08e	122.27±11.96e
a, b, c, d, e, f: there were significant differences between the values at P < 0.05.

表选项


3 结论从江苏省如东县盐碱土中筛选得到7株耐盐菌株，综合评价菌株的产EPS能力、降碱能力以及产IAA能力，获得一株耐盐碱促生菌DB01。该菌株产EPS能力为0.21g/g，降碱能力为8.7%，产IAA能力为8.97 mg/L。
将菌株DB01的16S rRNA基因序列进行对比分析，鉴定该菌株为海水盐单胞菌Halomonas aquamarina。
海水盐单胞菌Halomonas aquamarina DB01能够抑制香蕉枯萎病菌、番茄早疫病菌、大豆疫霉病菌、小麦纹枯病菌的生长，并能够增加小麦种子的发芽率和简化活力指数，有望成为一种广谱性的生防促生菌。将其应用于盐碱地改良，提高作物对盐碱的抗性可作为今后的研究方向。
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