浙江农林大学 农业与食品科学学院 浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室，浙江 杭州 311300
收稿日期：2019-06-20；接收日期：2019-09-02；网络出版时间：2019-10-10
基金项目：浙江省自然科学基金(Nos. LY18C150004，LY18C150003，LY15C150006)资助
摘要：黄瓜Cucumis sativus是世界性的重要蔬菜作物。农杆菌介导的转基因技术是研究植物基因功能及品种改良的重要手段。为进一步加快黄瓜的转基因研究和育种进程，文中针对农杆菌介导的黄瓜遗传转化方法，从黄瓜再生能力的影响因素、遗传转化条件和过程中各类添加物质等方面，阐述了根癌农杆菌介导的黄瓜转基因研究进展及存在的问题，并对提高黄瓜遗传转化效率和安全筛选标记的应用等前景进行了展望，以期为黄瓜抗逆育种和果实品质改良等研究提供参考。
关键词：黄瓜转基因再生能力遗传转化效率
Advances in Agrobacterium tumefaciens-mediated transgenic cucumber
Li'ang Chai, Huaifu Fan, Chen Liu, Changxia Du
Zhejiang Provincial Key Laboratory of Agricultural Product Quality Improvement Technology, College of Agriculture and Food Science, Zhejiang A & F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China
Received: June 20, 2019; Accepted: September 2, 2019; Published: October 10, 2019
Supported by: Natural Science Foundation of Zhejiang Province, China (Nos. LY18C150004, LY18C150003, LY15C150006)
Corresponding author: Changxia Du. Tel: +86-571-63741277; E-mail: changxiadu@zafu.edu.cn.
Abstract: Cucumber (Cucumis sativus) is an important vegetable crop in the world. Agrobacterium-mediated transgenic technology is an important way to study plant gene functions and improve varieties. In order to further accelerate the transgenic research and breeding process of cucumber, we described the progress and problems of Agrobacterium tumefaciens-mediated transgenic cucumber, from the influencing factors of cucumber regeneration ability, genetic transformation conditions and various additives in the process. We prospected for improving the genetic transformation efficiency and safety selection markers of cucumber, and hoped to provide reference for the research of cucumber resistance breeding and quality improvement.
Keywords: cucumbertransgenicregenerative capacitygenetic transformation efficiency
黄瓜Cucumis sativus作为世界上重要的蔬菜作物之一，其基因功能研究和遗传育种工作受到了广泛关注。农杆菌介导遗传转化技术是一种天然的植物转基因体系，借助农杆菌侵染受伤植物体，将经过改造的T-DNA区插入到植物的基因组，再通过组织培养技术获得转基因植株，具有稳定性好、成本低、技术简单、设备要求不高等优点，逐渐成为黄瓜基因研究与品种改良的重要手段[1]。
根癌农杆菌介导的黄瓜转基因技术是目前应用最成熟、最广泛的遗传转化方法。依靠黄瓜的离体再生体系，辅以适当的添加物质，创建适宜黄瓜的遗传转化条件是此项技术的关键，一般包括无菌外植体的获取、预培养、农杆菌侵染转化、农杆菌与外植体共培养、抗性芽诱导筛选、抗性芽伸长及生根、炼苗移栽等阶段。黄瓜的组织培养和遗传转化技术自问世以来[2-3]，通过后续研究者们不断改良优化，在抗生物胁迫[4-5]、抗非生物胁迫[6-7]、果实品质改良[8-9]、生长发育[10-11]等基因的遗传转化工作中取得了丰硕的成果。但是，黄瓜因基因型、外植体类型等因素不同，导致再生能力差异仍较大，关于遗传转化的条件研究仍不够全面，在黄瓜遗传转化过程中各种添加物质的原理及作用研究仍不够彻底，以至褐化、污染、玻璃苗、老小苗、遗传转化效率低、基因表达和遗传不稳定等问题目前仍困扰着研究者们。文中从黄瓜离体再生的能力、遗传转化条件及过程中的各类添加物质出发，分析和总结当前已有的进展与成果，为根癌农杆菌介导黄瓜转基因技术的深入研究及未来发展提供参考。
1 影响黄瓜再生能力的因素高再生能力是成功遗传转化的基础，黄瓜的离体再生主要有直接通过培养外植体获得不定芽和通过先诱导愈伤组织再诱导出不定芽两种方式。两种方式在培养步骤上基本相同，差别在于直接诱导不定芽的方式具有再生周期短、再生率高等特点，而通过诱导愈伤组织再诱导不定芽的方式更利于后续遗传转化的阳性筛选[4]。影响黄瓜再生能力的主要因素有以下几方面。
1.1 品种基因型不同品种的黄瓜再生能力差异较大。Todd等[3]对85个黄瓜品种进行了离体再生实验，但仅有28个品种可以从子叶再生成芽，证明了不同黄瓜基因型再生能力差异较大。不仅如此，即使是容易再生的不同基因型黄瓜品种，其再生能力也存在显著差异[12]，如有研究发现，黄瓜品种‘吉林旱瓜’再生频率可达97%，而黄瓜品种‘9910 Gt’仅有67%[13]，同时指出无论是外植体平均再生芽数，还是出苗和生长分化速度，在相同的培养条件下，‘吉林旱瓜’都明显快于其他5个品种，目前许多研究都得出了类似规律[14-16]。Wang等[17]通过QTL定位和SNP分子标记技术，发现基因Csa1G642540 (DnaJ，参与响应脱落酸调节、分生组织再生和质膜H+-ATP酶活性调节等)在黄瓜离体再生过程中发挥着重要作用，首次在遗传机制中证实了不同品种黄瓜再生能力的差异性。合适的基因型再生能力强，生长分化迅速、一致，对逆境的适应性强，可有效减少再生植株在组培微环境中的污染影响和有害物质的积累。
1.2 外植体选择黄瓜再生芽需通过切取的外植体分化而来，研究中主要针对苗龄、苗态和选择不同的外植体类型来优化黄瓜离体再生体系。
研究中多以1–4 d为黄瓜最佳苗龄[18-20]，也有选择5–7 d作为最佳苗龄[21]，在苗态上多选择子叶抱合未完全展开[6, 22]、子叶直立完全展开[21]和未经过光照培养的短苗龄子叶[10, 18]。苗龄既是影响原生质体的产量、活力、分裂率、植物体激素水平、营养物质含量等的主要因素，又决定着黄瓜组培苗的苗态，研究中可能因种子活力或浸种方式的差异，导致黄瓜种子萌发速率不同，进而影响黄瓜组培苗达到最佳再生状态的苗龄不同[23]，因此，以苗态作为最佳再生效率的主要参考因素更为合理。
外植体类型主要有子叶、子叶节、下胚轴、上胚轴等，其中使用最多的为子叶[6, 24]和子叶节[25-27]，再生频率分别能达到96.7%[9]和100%[28]，而胚轴再生频率仅有21%[26]，明显低于子叶及子叶节，造成这种差异的原因可能主要受基因型影响，另外外植体的处理方法、培养环境等其他因素也对不同外植体的再生能力有一定影响。以子叶、子叶节和胚轴为外植体，均有成功获得转基因植株的报道，但有研究证实，子叶和子叶节的转基因效率高于胚轴[29]。综合来看，最适宜黄瓜离体再生的外植体类型为子叶节或子叶[30-31]。
2 农杆菌介导黄瓜转基因的转化条件2.1 预培养条件普遍认为，通过预培养可以调整外植体内源激素水平、植物体细胞生理状态，减轻逆境对幼嫩外植体的胁迫，促进细胞分裂和外源基因的整合[32]，且预培养一般以暗培养的方式进行，对于调节过氧化物酶活性增速等有显著影响[33]。根据不同预培养天数后的抗性芽出芽率[21]和GUS瞬时性表达率[34]发现，不同的预培养时间对遗传转化效率影响显著[32]，1–2 d是多数研究中选用的预培养天数[10, 35]，分析指出，外植体在过短的预培养时间内无法达到最佳的生理状态，过长的预培养时间会使外植体伤口愈合，农杆菌侵染的效果会大大降低，进而影响遗传转化效率。
2.2 侵染条件利用预制的侵染液侵染受伤的外植体是黄瓜遗传转化过程中的重要步骤[36]。农杆菌GV3101[8]、LBA4404[37]、EHA105[38]等菌株在黄瓜遗传转化的研究中都有报道使用，且都成功获得转基因植株，将含有目标质粒的农杆菌培养至菌液OD600值为0.6–0.8后，再将其重悬稀释至OD600值为0.2–0.3，研究认为，培养液OD600值在0.6至0.8间，农杆菌处于对数生长期，此时农杆菌活力最高，稀释后OD600值在0.2至0.3间，可避免过高浓度的农杆菌使外植体腐化死亡[6-8]。外植体的侵染方式主要为浸泡侵染[4, 10]，也有利用真空负压等其他设备提高侵染深度的方法被报道[39-40]，杨丽[39]在研究中使用绿色荧光蛋白监测了不同侵染条件下的遗传转化过程，发现再生位点与侵染位点并不一致，侵染比率只有30%，在改为真空负压侵染后，侵染比率提高到了90%。侵染时间虽受限于侵染方式，但大多介于10–30 min[14, 41]之间，侵染时间低于10 min[32]或超过30 min[42]的报道并不多见。
2.3 共培养条件共培养阶段设置在外植体被侵染之后，是目标基因整合进入植物染色体的重要阶段，共培养时间的长短需根据外植体耐受力、侵染液浓度和共培养操作方式的差异进行选优，许多研究以抗性芽出愈率或GUS阳性表达量，选择最佳共培养时间在2–4 d内[34, 39]。针对共培养温度的研究发现，不能仅考虑黄瓜外植体分化、农杆菌生长或是T-DNA转移的最佳温度，还需考虑共培养温度与共培养时间之间的互作关系，在共培养2 d时，26 ℃更利于遗传转化[42]。关于共培养基pH对遗传转化效率的影响研究发现，共培养基pH在5.0–5.2间更有利于抗性芽率的提高[38]，有认为是因为添加剂乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)在偏酸性环境下作用效果更好，也有认为较低的pH利于农杆菌Vir基因的活化、转移和表达。随着共培养时间、温度、培养基pH等条件的研究日趋完善，对于提高根癌农杆菌介导黄瓜遗传转化效率具有重要意义。
本课题组在研究中首先使用1/2MS液体培养基洗脱共培养结束的外植体3次，再将外植体吹干转至筛选培养基，发现可大大减少筛选培养阶段农杆菌的生长量和抑菌抗生素的使用量，与未处理组相比，抗性芽率提高至67%，这种洗脱农杆菌的方法对外植体正常生长有明显促进作用，下一步将对洗脱时间、抗生素添加量及对遗传转化效率的影响等因素作进一步研究。
3 添加剂在黄瓜转基因中的应用3.1 植物激素研究发现，被切下的外植体的内源激素含量在不同再生时期剧烈变化，且在愈伤诱导阶段脱落酸(Abscisic acid，ABA)的含量显著增加，ABA/吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)和ABA/赤霉素(Gibberellin，GA)含量也与愈伤诱导时期存在关联[43]，说明外植体在离体再生的各个过程中，各种植物激素的含量发挥着重要的调控作用，因此研究者们采用在黄瓜离体再生的不同阶段添加不同浓度不同植物激素组合的方式来筛选最适激素组合[40]，其中被广泛应用的两种植物激素是6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)和ABA (表 1)，也有使用GA、IAA、吲哚丁酸、萘乙酸等的报道。6-BA的浓度范围多在0.5–2.0 mg/L，ABA的浓度范围在0–2.0 mg/L。根据黄瓜基因型、外植体类型和离体再生阶段的不同，已有研究完善了津优系列[11, 18]、津研系列[7, 24]、‘新泰密刺’[4, 37]、‘9930’[17, 19]等黄瓜品系的离体再生最佳激素组合，并获得了最高100%的再生频率(表 1)[19]。本课题组在诱导‘新泰密刺’外植体直接分化出芽的过程中，发现0.5 mg/L 6-BA与1.0 mg/L ABA搭配使用效果最佳。
表 1 植物激素及AgNO3在不同黄瓜品种外植体芽诱导阶段的应用Table 1 Application of plant hormone and AgNO3 in the explant bud induction stage of different varieties of cucumber
| Variety | Explant type | Medium formula | Regeneration frequency (%) |
| Xintai mici[4] | Cotyledonary nodes | MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L ABA | 82.7 |
| Jinyan No. 4[7] | Cotyledonary nodes | MS+3.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L ABA+1.5 mg/L AgNO3 | 90.0 |
| 9930[9] | Cotyledon | MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L ABA | 96.7 |
| Jinyou No. 1[11] | Cotyledon | MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L AgNO3 | 86.1 |
| Jinyou No. 1[18] | Cotyledonary nodes | MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L AgNO3 | 90.7 |
| 9930[19] | Cotyledonary nodes | MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L ABA+2.0 mg/L AgNO3 | 90.2 |
| S06[20] | Cotyledon | MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA+2.0 mg/L AgNO3 | 91.2 |
| Changchun mici[22] | Cotyledonary nodes | MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA+2.0 mg/L AgNO3 | 90.0 |
| S52[23] | Cotyledonary nodes | MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA+2.0 mg/L AgNO3 | 100.0 |
| Gl[34] | Cotyledonary nodes | MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L ABA+2.0 mg/L AgNO3 | 100.0 |
表选项
不定芽诱导完成后，外植体内源激素逐渐趋于稳定，研究中多采用下调所添加的植物激素浓度、改变或减少所使用激素的种类，以促进再生芽的伸长[20, 22]，此步骤周期在7–15 d左右。当再生苗伸长至2 cm左右时即可开始诱导生根，有研究中添加少量的植物激素促进再生芽生根[10, 15]，但一般认为不需要添加植物激素即可诱导生根[16, 18]，这可能与黄瓜再生芽比较容易诱导生根有关[4]。
3.2 AgNO3在黄瓜离体再生过程中AgNO3被广泛用作添加剂，研究认为Ag+在促进外植体分化、生长和防止褐化等方面有显著作用，这与Ag+抑制乙烯合成量呈正相关，而乙烯合成抑制外植体再生有关[44]，一般认为添加0.5–2.0 mg/L AgNO3即可达到最佳效果，过高的使用量反而会起到反作用[13, 31]，但也有研究中不使用AgNO3仍可获得较高的再生频率(表 1)，并保持再生芽良好的生长状态[5]，这可能是因为基因型、外植体有所差异，导致外植体抗逆性不同。在研究中，AgNO3的最佳添加浓度还需要进一步筛选。
3.3 AS及抗氧化剂许多研究在遗传转化的预培养[23]、侵染、共培养阶段中添加一定浓度的AS[18-19]，发现AS对提高抗性芽分化率有显著效果，这是因为AS等酚类物质具有活化农杆菌Vir区、促进外源基因导入植物基因组、进而提高遗传转化效率的作用[4, 35]。共培养基中AS浓度最低为20 μmol/L[19]，最高为150 μmol/L[32]，侵染液中AS浓度多使用100 μmol/L[18, 42]，尽管在添加阶段和使用浓度上存在差异，但都表明酚类物质对黄瓜遗传转化具有促进作用。也有研究通过抑制酚类物质的氧化即添加抗氧化剂的方法来提高遗传转化效率，如α-辛硫酸[16]、L-Cystine、二硫苏糖醇、Na2S2O3[35]等，抗氧化剂在其他植物组织培养中的应用较为多见且效果良好[16]，但在黄瓜的遗传转化中应用并不广泛。无论是直接添加AS，还是添加抗氧化剂，都是以提高酚类物质含量来提高遗传转化效率，但该类物质常以有毒有机溶剂溶解，或本身在高浓度下会有一定的毒害作用，并与侵染液种类[41]、共培养基pH[38]、共培养温度[42]等因素易形成交互作用，具体的添加阶段和添加浓度还需要进一步探讨。
3.4 抗生素在黄瓜遗传转化体系的筛选培养阶段，常以筛选抗生素和抑菌抗生素配合使用。卡那霉素(Kanamycin，Kan)[16, 40]、潮霉素[10, 32]、草甘膦[25]等是使用最多的筛选标记，普遍认为，黄瓜外植体的筛选抗生素耐受压力与基因型[19, 28]和培养阶段[20, 26]关系密切，如黄瓜‘川绿2号’在140 mg/L的Kan浓度下仍不能完全抑制出芽，而‘白丝条’和‘二旱子’在40 mg/L和60 mg/L的浓度下便能完全抑制出芽[42]，黄瓜‘S06’在芽诱导阶段临界Kan浓度为140 mg/L，而在生根阶段100 mg/L的Kan即可完全抑制生根[20]。筛选抗生素浓度既不能太高，又不能太低，过高的浓度易使幼嫩的植物体或未转化的细胞死亡，过低的浓度会导致假阳性率过高，大大增加后期阳性鉴定的工作量。近些年研究者们偏向设定梯度浓度来进行阳性筛选[26]，即在诱导出芽时使用低浓度的筛选抗生素，在壮芽及生根阶段使用较高的筛选浓度，这种根据基因型和培养阶段的改变而进行的动态筛选能有效解决过低或过高的筛选浓度引起的问题。
不同于筛选抗生素对于外植体分化抑制效果明显，抑菌抗生素常选用对植物体伤害较小而具有一定抑制农杆菌作用的抗生素，常用的抑菌抗生素有羧苄青霉素(Carbenicillin，Carb)、头孢噻肟钠(Cefotaxime sodium，Cef)、特美汀(Timentin, TM)、氨苄西林等[32, 36]，虽然这些抗生素都可以有效抑制农杆菌的生长，但往往使用的浓度较高，通常在300–500 mg/L，对于外植体的分化、生长也有一定的影响。在一些报道中发现Cef相较于Carb更利于愈伤诱导和出芽[26, 32]，TM是一种新型抑制农杆菌的抗生素，最大的特点是抑菌持续性强，在70 d内都可有效抑菌[45]，但使用成本要比Cef等高出许多。因此在黄瓜遗传转化过程中可根据不同培养阶段和周期，选择最适宜的抑菌抗生素，如在分化诱导阶段选择对外植体和愈伤诱导影响较小的种类，在壮芽或生根等生长周期较长的阶段选择抑菌效果显著且持久的种类，并且在使用浓度上，可根据污染情况适当调高或降低，使遗传转化过程中外植体受到农杆菌和抗生素的影响降到最低。
基于前人的研究成果[46]，本课题组在试验中将活性炭作为外源添加物质应用在黄瓜遗传转化过程中，发现添加活性炭的培养基可保持较长时间无色透明状，而未添加活性炭的培养基在一周左右会逐渐变黄，并且发现活性炭在0.5%的质量浓度作用下，对抑制褐化和促进生根方面作用显著，但具体的添加阶段和对培养基原有物质的吸附作用还有待进一步研究。
4 讨论及展望黄瓜是目前公认较难进行转基因的物种，已有报道中经PCR、Southern blotting、qPCR等方法检测后，遗传转化效率最高可达29%[47]，而最低仅有0.1%[48]，大多在1%–10%之间，并且无法稳定遗传给下一代，常出现基因丢失或沉默现象[5]。农杆菌侵染位点与外植体再生位点不一致是造成黄瓜遗传转化效率低的重要原因[48]，各阶段培养时间、温度、培养基pH值、侵染方式、菌株及载体类别等是影响侵染位点深度的主要因素，但在已有研究中这些参数都有所差异，且缺乏足够的细节，在基础培养基、固化剂[16]、组织培养光环境和气体环境、再生植株驯化等方面的研究较少，农杆菌污染严重和转基因植株在驯化阶段死亡也是导致黄瓜遗传转化效率低的另一重要原因。目前各类抗生素仍是黄瓜转基因体系中的主要筛选标记，虽有如甘露糖[49]等的安全筛选标记被报道用于黄瓜转基因过程中，但发展较为缓慢[50]，与传统的抗生素筛选标记相比仍有很大的研究空间。
随着分子生物技术的不断发展，黄瓜转基因技术的不断优化，研究者们对根癌农杆菌介导的黄瓜转基因技术进行了积极的探索。超声波、真空泵等工具的应用越来越广泛[41]，活体转染[50]、新型纳米颗粒介导[51]等方法也逐渐进入研究者们的视线，可以预见，黄瓜的离体再生和遗传转化体系会越来越完善，CRISPR/Cas9技术[48]及安全筛选标记会越来越多地应用于无抗生素的黄瓜遗传转化研究上，一些目前难以突破的问题会随着研究的深入得以解决。
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