, 李润植2 1. 山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801;
2. 山西农业大学 分子农业与生物能源研究所，山西 太谷 030801
收稿日期：2019-12-11；接收日期：2020-02-02；网络出版时间：2020-03-10
基金项目：国家自然科学基金(Nos. 31401430，31201266，30971806)，国家农业部“948”项目(No. 2014-Z39)，山西省煤基重点科技攻关项目(No.FT-2014-01)，山西省重点科技项目(No. 201603D312005)，山西省重点研发计划(No. 201703D221002-3)，山西省留学归国人员科研基金(No. 2015-064)资助
摘要：硬脂酰-ACP Δ9脱氢酶(Stearoyl-acyl carrier protein Δ9 desaturase，SAD)在质体中催化单不饱和油酸或棕榈油酸的合成，是控制植物细胞饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比例的关键酶。为解析大豆油酸合成积累调控机制，文中对大豆Glycine max GmSAD家族成员进行全基因组鉴定和保守功能域及理化性质等分析。应用qRT-PCR检测GmSAD各成员的时空表达谱，构建表达载体并通过农杆菌介导烟草Nicotiana tabacum瞬时表达和油酸缺陷型酵母Saccharomyces cerevisiae突变株BY4389遗传转化测试GmSAD酶活性和生物学功能。结果表明，大豆基因组含有5个GmSADs家族成员，其编码酶蛋白均具有二铁中心和SAD酶特有的2个保守组氨酸富集基序(EENRHG和DEKRHE)，预测其活性酶蛋白为同源二聚体。系统进化分析显示5个GmSAD分成2个亚组，分别与拟南芥AtSSI2和AtSAD6亲缘关系较近。GmSAD各成员在大豆根、茎、叶、花和不同发育时期种子等组织中表达谱差异明显，其中GmSAD5在发育种子中、晚期高量表达，与油脂富集时期相吻合。烟草叶片瞬时表达GmSAD5可使叶片组织中油酸和总油脂含量分别提高5.56%和2.73%，而硬脂酸含量相应降低2.46%。缺陷型酵母遗传转化测试显示，过表达GmSAD5能恢复缺陷酵母合成单不饱和油酸的能力和促进油脂积累。总之，大豆GmSAD5对硬脂酸底物选择性较强，能高效催化单不饱和油酸的生物合成，为大豆种子油酸和总油脂积累机制的研究奠定了基础，也可作为油脂品质遗传改良的优异靶标。
关键词：大豆Glycine max硬脂酰-ACP Δ9脱氢酶(SAD)功能分析油酸油脂品质
Identification and functional analysis of soybean stearoyl-ACP Δ9 desaturase (GmSAD) gene family
Mimi Deng1,2, Baoling Liu2, Zhilong Wang2, Jin'ai Xue2, Hongmei Zhang1
, Runzhi Li2 1. College of Life Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China;
2. Institute of Molecular Agriculture and Bioenergy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China
Received: December 11, 2019; Accepted: February 2, 2020; Published: March 10, 2020
Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31401430, 31201266, 30971806), National Department of Agriculture "948" Program (No. 2014-Z39), Coal-based Key Sci-Tech Project of Shanxi Province, China (No. FT-2014-01), Key Project of the Key Research and Development Program of Shanxi Province, China (No. 201603D312005), Key Research and Development Project of Shanxi Province (No. 201703D221002-3), Research Project Supported by Shanxi Scholarship Council of China (No. 2015-064)
Corresponding author: Hongmei Zhang. Tel: +86-354-6286908; E-mail: tgzhhm@163.com;
Runzhi Li. Tel: +86-354-6288344; E-mail: rli2001@126.com.
Abstract: Stearoyl-ACP Δ9 desaturase (SAD) catalyzes the synthesis of monounsaturated oleic acid or palmitoleic acid in plastids. SAD is the key enzyme to control the ratio of saturated fatty acids to unsaturated fatty acids in plant cells. In order to analyze the regulation mechanism of soybean oleic acid synthesis, soybean (Glycine max) GmSAD family members were genome-wide identified, and their conserved functional domains and physicochemical properties were also analyzed by bioinformatics tools. The spatiotemporal expression profile of each member of GmSADs was detected by qRT-PCR. The expression vectors of GmSAD5 were constructed. The enzyme activity and biological function of GmSAD5 were examined by Agrobacterium-mediated transient expression in Nicotiana tabacum leaves and genetic transformation of oleic acid-deficient yeast (Saccharomyces cerevisiae) mutant BY4389. Results show that the soybean genome contains five GmSAD family members, all encoding an enzyme protein with diiron center and two conservative histidine enrichment motifs (EENRHG and DEKRHE) specific to SAD enzymes. The active enzyme protein was predicted as a homodimer. Phylogenetic analysis indicated that five GmSADs were divided into two subgroups, which were closely related to AtSSI2 and AtSAD6, respectively. The expression profiles of GmSAD members were significantly different in soybean roots, stems, leaves, flowers, and seeds at different developmental stages. Among them, GmSAD5 expressed highly in the middle and late stages of developmental seeds, which coincided with the oil accumulation period. Transient expression of GmSAD5 in tobacco leaves increased the oleic acid and total oil content in leaf tissue by 5.56% and 2.73%, respectively, while stearic acid content was reduced by 2.46%. Functional complementation assay in defective yeast strain BY4389 demonstrated that overexpression of GmSAD5 was able to restore the synthesis of monounsaturated oleic acid, resulting in high oil accumulation. Taken together, soybean GmSAD5 has strong selectivity to stearic acid substrates and can efficiently catalyze the biosynthesis of monounsaturated oleic acid. It lays the foundation for the study of soybean seed oleic acid and total oil accumulation mechanism, providing an excellent target for genetic improvement of oil quality in soybean.
Keywords: soybean (Glycine max)stearoyl-acyl carrier protein Δ9 desaturase (SAD)functional analysisoil qualityoleic acid
大豆Glycine max L. Merr是我国及世界重要的粮油作物之一，其高蛋白和高油脂等为人体提供了丰富的氨基酸和脂肪酸营养，是重要的优质食品资源，亦可用作畜禽及水产饲料和其他工业原料。大豆油是全球食用植物油的主要来源之一，占总食用植物油的28%，而且市场需求量逐年增长[1]。大豆油主要由5种脂肪酸组成：棕榈酸(C16︰0，约11.38%)、硬脂酸(C18︰0，约4.29%)、油酸(C18︰1Δ9，约15.66%)、亚油酸(C18︰2Δ9, 12，约47.33%)和亚麻酸(C18︰3Δ9, 12, 15，约15.40%)[2-3]。尽管亚油酸能降低血液胆固醇，预防动脉粥样硬化，但大豆种子油高达60%–70%的多不饱和脂肪酸(亚油酸和亚麻酸)使其容易氧化酸败，不宜长期贮存，也易引起基于大豆油的食品变质。常规食用油精炼过程中，需要经过高温脱臭和添加抗氧化剂来提高大豆油抗氧化性，而这又会产生大量对人体健康有害的反式脂肪酸和其他有害物质。单不饱和油酸兼具饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的优良特性，特别是抗氧化性显著高于亚油酸等多不饱和脂肪酸[4]。食用油酸能降低人体血液中的不良低密度脂蛋白胆固醇含量，避免高血脂症的发生，保护心血管健康。因此，诸多研究致力于提高大豆油的油酸比例以增加大豆油氧化稳定性和提高大豆油营养价值[5-7]。通过甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate，EMS)诱变，已筛选获得油酸含量显著增高的大豆优良突变体。应用RNAi沉默大豆GmFAD2 (Δ12 fatty acid desaturase 2，催化油酸18︰1Δ9生成亚油酸18︰2Δ9, 12)获得油酸含量达80%，亚油酸含量减低至1%的转基因大豆[8]。我们实验室通过对转录因子锌指蛋白进行分析设计，使它能特异地结合大豆FAD2-1酶基因靶序列，关闭该基因表达，获得了大豆种子高油酸(> 80%)积累的转基因植株[9-10]。最近，应用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得GmFAD2纯合突变体，大豆种子油酸含量 > 80%、亚油酸减至1.3%–1.7%[11]。这些研究大多是通过阻断油酸生成亚油酸的酶促反应来提高油酸积累，然而，催化硬脂酸生成油酸的酶分子是硬脂酰-Δ9脱氢酶(Stearoyl-Δ9 desaturase，SAD)。鲜有关于大豆SAD家族成员和功能以及遗传修饰提高油酸富集的详尽报道。
高等植物细胞含有两类硬脂酰-Δ9脱氢酶，其一为质体型SAD，在质体内催化硬脂酰-ACP (18︰0-ACP)生成油酰-ACP (18︰1Δ9-ACP)，在硬脂酰链Δ9位置引入第一个碳碳双键[12-14]，该酶促反应需要NADPH、NADPH-铁氧还蛋白还原酶、铁氧还蛋白等提供能量[15-16]。其二为细胞型SAD，在细胞内质网上催化硬脂酰-CoA (18︰0-CoA)生成油酰-CoA (18︰1Δ9-CoA)。一些研究显示，植物细胞绝大多数油酸(18︰1Δ9)是在质体内合成，仅有少部分油酸在内质网上合成[17]。质体型SAD是控制植物细胞饱和脂肪酸转化为不饱和脂肪酸途径的重要限速酶，其活性强弱决定着饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例大小[18-19]。近年来，人们已经从拟南芥Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.[14]、棉花Gossypium spp.[20]、马铃薯Solanum tuberosum L.[15]、花生Arachis hypogaea Linn.[21]、甘蓝型油菜Brassica napus L.[22]、可可Theobroma cacao L.[23]等许多植物中分离得到了SAD基因，并验证了SAD的硬脂酰-ACP脱氢酶活性。例如，干扰表达棉花GhSAD基因可使油酸含量从13%显著降低到4%，同时硬脂酸含量从2%–3%增加到约40%[24]。同样，在6个大豆突变体中，SACPD-C的突变导致大豆种子硬脂酸含量升高，比野生型高1.5–3倍[25]。在ssi2拟南芥突变体中过表达S-ACP-DES1基因能够使突变体恢复催化硬脂酸生成油酸(18︰1Δ9)[14]。过量表达黄羽扇豆Lupinus luteus L. SAD基因可显著提高烟草叶片中的油酸含量[26]。在烟草中过表达马铃薯SAD基因，叶片和种子的脂肪酸组分发生了变化，不饱和脂肪酸含量增加[27]。已有研究显示，植物SAD基因家族不同成员的表达模式具有时空特异性。例如，棉花GhSAD2和GhSAD4在发育种子中具有较高的表达量，在其他组织中表达较低[20]。可可TcSAD1在各组织中均有表达，TcSAD3和TcSAD4在花中表达较高[23]。凤丹牡丹Paeonia ostii PoSAD基因在根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达，且在花瓣中表达最高，在根中表达最低[28]。进一步深入研究这些差异表达SAD家族成员的具体生物学功能和催化底物选择性等特性，有助于全面解析植物油脂生物合成代谢的调控机制及遗传改良。
为解析大豆SAD的硬脂酰-ACP脱氢酶(GmSAD)家族各成员的功能和建立基于GmSAD遗传修饰改良大豆优质品质的技术策略，本文应用生物信息学工具全基因组鉴定大豆质体型SAD家族成员、基因结构和酶蛋白理化性质等特征。采用实时荧光定量PCR技术分析GmSADs基因家族各成员的时空表达模式。通过农杆菌介导烟草叶片瞬时表达和在不饱和脂肪酸缺陷型酵母BY4389超表达目标基因鉴定大豆GmSAD的生物学功能。共检测到5个GmSADs，其中在大豆种子油脂积累过程中高表达的GmSAD5能高效催化油酸合成，是遗传工程培育富集油酸或硬脂酸以及提高油脂积累的一个优异分子靶标。
1 材料与方法1.1 材料本试验所用的大豆品种Jack，种植于山西农业大学试验田。试验取材为：两周龄的幼苗根、茎、幼叶、盛花期的花以及开花后(Days Post-Anthesis，DPA) 25 d (种子Ⅰ)、35 d (种子Ⅱ)、45 d (种子Ⅲ)的大豆种子。所有样品经液氮速冻后储存于?80 ℃用于下一步试验。
本试验所用的本氏烟草Nicotiana tabacum L.种植于营养土中，设置光照培养箱的生长条件为：温度26 ℃、相对湿度60%、光照︰黑暗=16 h︰8 h[29]。本研究中使用的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae H.突变菌株为BY4389缺陷型酵母(MATa ole1Δ::LEU2 ura3-52 his4)，购自日本Osaka University，该BY4389酵母菌株含有OLE1突变，无法合成不饱和脂肪酸[30]。
1.2 方法1.2.1 大豆RNA提取、cDNA链的合成及基因克隆根据北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司的Trizol法提取上述组织的总RNA。利用ABM公司(爱必梦生物科技有限公司)的5× All-In-One RT MasterMix反转录试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，使用基因特异引物及2×GPV8 HF Polymerase Master (通用生物有限公司)高保真酶扩增目的基因的ORF，目的片段经凝胶回收和纯化后连入pMD18-T载体并转入大肠杆菌中，选取阳性菌，并在通用生物公司(安徽)测序验证。
1.2.2 大豆GmSAD基因家族的鉴定及结构分析选用模式生物拟南芥SAD (AtSADs)基因家族的蛋白序列作为检索序列blastp大豆基因组数据库soybase (https://soybase.org/)，获得大豆全基因组SAD的基因组序列、CDS序列、氨基酸序列及染色体的位置信息。将检索到的GmSADs氨基酸序列提交到SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)和CDD数据库进行验证，分析鉴定GmSADs蛋白序列的保守结构域(FA_desaturase_2)。
利用网站GSDS2.0(http://gsds. cbi.pku.edu.cn/)对GmSADs家族进行基因结构分析。
1.2.3 大豆GmSAD家族蛋白的理化性质及结构分析用ExPASy数据库(https://www.expasy.org/)中的ProtParam预测大豆GmSAD家族蛋白的分子量、等电点等理化性质[31]。通过在线工具TMHMM Server v.2.0 (wzhttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测大豆GmSADs家族成员的跨膜结构区域；然后通过ChloroP 1.1 Server[32]和TargetP 1.1 Server[33]预测GmSAD编码蛋白的亚细胞定位。
利用SOPMA网站(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma. htmL)预测GmSADs家族成员的二级结构。用在线网站SWISS-MODEL对GmSADs家族成员进行三级结构预测分析并建模。
1.2.4 大豆GmSADs蛋白保守域鉴定及系统进化分析从NCBI中调取蓖麻(Ricinus communis L.) RcSAD1、拟南芥AtSSI2的SAD蛋白序列，用软件GeneDoc对大豆、蓖麻和拟南芥的SAD蛋白序列进行多序列比对。各物种SAD序列信息见表 1。运用MEGA7.0软件对拟南芥AtSADs、蓖麻RcSAD1、甘蓝型油菜BnSAD、马铃薯StSAD、可可TcSAD1和大豆GmSADs的氨基酸序列进行比对，并采用邻接法(NJ)构建无根系统发育树，自举检验值设置为1 000个循环[34]。
表 1 各物种SAD信息Table 1 Information of SAD in different species
| Species | Protein | Accession No. |
| Arabidopsis thaliana | AtSSI2 | At2g43710 |
| AtSAD1 | At5g16240 | |
| AtSAD2 | At3g02610 | |
| AtSAD3 | At5g16230 | |
| AtSAD4 | At3g02620 | |
| AtSAD5 | At3g02630 | |
| AtSAD6 | At1g43800 | |
| Ricinus communis | RcSAD1 | XP_002531889 |
| Theobroma cacao | TcSAD1 | KP704662 |
| Brassica napus | BnSAD | AAT65205 |
| Solanum tuberosum | StSAD | AAA33839 |
表选项
1.2.5 大豆GmSADs家族基因的表达分析以上述大豆各组织的cDNA为模板，利用各GmSADs基因的特异性引物进行qRT-PCR分析。选用大豆Actin作为内参基因，并设置6个生物学重复。用NCBI中的Primer-BLAST对GmSADs基因编码序列设计特异性引物(表 2)。依照TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus) (TaKaRa公司)说明提供的方法，进行qRT-PCR分析。反应体系为：cDNA模板1 μL，TB Green Premix Ex TaqⅡ5 μL，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ(50×) 0.2 μL，ddH2O 3 μL。反应程序为：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 15 s，退火1 min；40个循环。反应在Bio-Rad CFX96TM荧光定量PCR仪上进行。用公式2-ΔΔCq计算各基因表达量，利用IBM SPSS Statistics 19进行差异显著性分析。
表 2 qRT-PCR检测GmSADs基因表达所用特异引物Table 2 Gene-specific primers of GmSADs genes used for qRT-PCR analysis
| Primer name | Primer sequence (5′–3′) | Size (bp) |
| GmActin-F | AAGCTGTTCTCTCCTTGTACGCC | 23 |
| GmActin-R | GCACAGTGTGAGACACACCATCA | 23 |
| GmSAD1-F | GAACCGAGAACAGCCCCTAC | 20 |
| GmSAD1-R | GTCGGCAAACGCCATAACTG | 20 |
| GmSAD2-F | TTGCTATGCCAGCACACCTT | 20 |
| GmSAD2-R | GCAGCCCACAAACGTATTCC | 20 |
| GmSAD3-F | GTTCATCGAAGCGGTGAGGT | 20 |
| GmSAD3-R | TCTGAGCAAATCCCCGTGTC | 20 |
| GmSAD4-F | TATGCGACACGAGAACGCAA | 20 |
| GmSAD4-R | CTCCACCGTCCAACCAGAAA | 20 |
| GmSAD5-F | ATTCGAGCACTACTCCGCTG | 20 |
| GmSAD5-R | CAACCTCCTAATCCTCGGCG | 20 |
表选项
1.2.6 大豆GmSAD5基因表达载体的构建本试验所用的植物表达载体pCAMBIA1303由CaMV35S启动子驱动，含有卡那霉素抗性。将上述克隆载体pMD18-T-GmSAD5和pCAMBIA 1303分别用XbaⅠ和KpnⅠ进行双酶切反应，酶切产物经回收纯化后，用T4 DNA连接酶连接，得到重组表达载体(pCAMBIA1303-GmSAD5)。然后，将其转入大肠杆菌，经PCR和双酶切试验鉴定阳性克隆。靶基因特异全长引物为GmSAD5-F：5′-ATGCCTCCAGAAAAGAAAGAAATTT-3′，GmSAD5-R：5′-TCACAAAAGCAATTCTTTATTG AAAATC-3′。
本试验所用的酵母表达载体为pYES2.0，含URA3位点和氨苄青霉素抗性。经过密码子优化的GmSAD5基因序列通过KpnⅠ和NotⅠ双酶切反应，连入pYES2.0中形成重组酵母表达载体pYES2.0-GmSAD5，转到大肠杆菌DH5α并验证成功。
1.2.7 大豆GmSAD5基因的烟草叶片瞬时表达和突变体酵母功能互补检测将上述构建成功的植物表达载体pCAMBIA 1303-GmSAD5通过冻融法转入根癌农杆菌菌株GV3101。取六周龄烟草，按照Ji等方法将农杆菌沿烟草叶片主脉一侧渗透注射，形成直径约1 cm的斑块，另一侧以含空载体的菌株作为对照[35-36]。取侵染第3天的叶片提取RNA并检测目的基因表达。取注射第6天的烟草叶片冷冻干燥后，用于提取总油脂和脂肪酸成分分析等。
缺陷型酿酒酵母菌株BY4389在含有0.01%油酸钠的YPD培养基中于28 ℃、220 r/min振荡培养，当OD600为0.5左右时，离心收集细胞，用无菌水洗涤。根据醋酸锂(LiAc)转化法，将上述构建成功的酵母表达载体pYES2.0-GmSAD5转入BY4389缺陷酵母中，经过缺尿嘧啶(SC-URA)培养基筛选和PCR鉴定出阳性转基因酵母。为了在酿酒酵母突变株中功能性表达，首先在SC-URA (含2%葡萄糖和0.01%油酸钠)的培养基上培养上述阳性转基因酵母。接着用不含油酸钠且添加2%半乳糖的培养基诱导酵母细胞转基因表达，28 ℃振荡培养72 h，5 000 r/min离心5 min收集酵母细胞，冷冻干燥后提取油脂和分析脂肪酸成分。
1.2.8 脂肪酸甲酯提取与气相色谱(GC)分析本试验采用内标法对上述烟草叶片和酵母提取脂肪酸甲酯。称取50 mg样品研磨至粉末，加入50 μL的C17︰0作为内标(浓度为10 mg/mL)。用500 μL的2.5%的浓硫酸-甲醇混合液进行甲酯化，80 ℃水浴2 h。用氮吹仪吹干后，加入500 μL的正己烷溶解混匀。将样品溶解液转移到GC瓶中，用气相色谱仪对样品的脂肪酸成分及含量进行分析，试验设置3个重复。脂肪酸含量通过安捷伦气相色谱仪进行定性定量检测，用毛细管柱(HP-88 100 m×0.25 mm×0.2 μm)分离，火焰离子化检测器测定。自动进样，进样次数为3，进样量为1 μL；氮气用作载气，流速为2.64 mL/min；进样温度和前检测器温度均为250 ℃；采取程序升温的方式：140 ℃的初始温度保持5 min，然后以15 ℃/min的速度升至250 ℃。以样品峰的保留时间与脂肪酸甲酯标准品的保留时间定性，按内标法计算各脂肪酸的含量。用下列公式计算各脂肪酸组分占样品的百分含量(ki)：
| ${k_{\rm{i}}} = \frac{{{A_{\rm{i}}} \times {m_{\rm{s}}}}}{{{A_{\rm{s}}} \times m}} \times 100\% $ |
1.2.9 总油脂提取与测定采用氯仿-甲醇法提取烟草叶片的总油脂。称取100 mg粉末置于离心管中(设置3个重复)，加入7.5 mL的氯仿-甲醇(1︰2)，混匀后于37 ℃抽提24 h。4 000 r/min离心10 min，收集上层有机相。向沉淀再次加入氯仿-甲醇重复抽提两次，每次12 h。收集合并3次的有机相，加5 mL氯仿和9 mL 1%的氯化钠溶液，充分混匀后8 000 r/min离心10 min，回收下层有机相转移至已知质量m0(mg)的玻璃管中，待管中液体蒸干后，称取总重量m1(mg)。
根据玻璃管质量m0(mg)和总重量m1(mg)计算烟草叶片中总脂的百分含量，即总脂的百分含量=(m1?m0)/样品质量×100%。
2 结果与分析2.1 大豆GmSADs基因家族的鉴定及基因结构和蛋白理化性质分析利用拟南芥AtSADs蛋白序列(AtSSI2和AtSAD1–6)搜索大豆数据库，将获得的候选序列通过SMART和CDD结构鉴定分析，最终共鉴定得到5个含有Acyl_ACP_Desat保守结构域的GmSADs家族成员，且均属于具有Fe-O-Fe中心的Ferritin-like铁蛋白超家族，其行使催化反应需要借助铁氧还蛋白NADP+氧化还原酶的电子传递系统。根据染色体定位信息，大豆GmSADs基因被依次命名为GmSAD1–GmSAD5。利用在线GSDS2.0网站对GmSADs基因进行内含子、外显子分析。结果如图 1所示，GmSAD4的序列最长，且无5′和3′非翻译区，所含外显子(5个)和内含子(4个)数目最多。而GmSAD1和GmSAD2的基因不仅序列长度相近、均含有3个外显子和2个内含子，且位置分布也相似。GmSAD3和GmSAD5的基因均含2个外显子和1个内含子。
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| 图 1 大豆GmSADs的基因结构 Fig. 1 Gene structure of soybean GmSADs |
| 图选项 |
用ExPASy数据库中的工具ProtParam对GmSADs家族成员的理化性质进行分析。结果如表 3所示，这5个大豆SAD编码蛋白长度范围为337 aa (GmSAD5)–402 aa (GmSAD2)；相对分子质量在38.63 kDa (GmSAD5)–46.09 kDa (GmSAD2)之间。除GmSAD3蛋白理论等电点为7.68外，其余成员的平均理论等电点为5.88。这5个GmSAD与拟南芥AtSSI2的理化性质相近。
表 3 大豆GmSADs家族成员基本信息Table 3 Basic information of soybean GmSAD family members
| Gene name | Transcript name | Number of amino acids (aa) | Molecular weight (kDa) | Theoretical pI | cTP-length (aa) | Predicted localization | Location |
| GmSAD1 | Glyma.02G138100 | 391 | 44.89 | 5.94 | 50 | C | Chr02:14302427-14306293 |
| GmSAD2 | Glyma.07G207200 | 402 | 46.09 | 6.05 | 61 | C | Chr07:37640045-37643952 |
| GmSAD3 | Glyma.13G038600 | 378 | 43.03 | 7.68 | 25 | C | Chr13:11956631-11959361 |
| GmSAD4 | Glyma.13G038700 | 375 | 43.75 | 5.87 | 10 | – | Chr13:12002911-12008557 |
| GmSAD5 | Glyma.14G121400 | 337 | 38.63 | 5.66 | 10 | – | Chr14:17499717-17502413 |
| AtSSI2 | AT2G43710 | 401 | 45.69 | 6.05 | 35 | C | Chr2:18119962-18122889 |
| C: chloroplast; –: any other location. | |||||||
表选项
2.2 大豆GmSADs的蛋白结构分析通过TMHMM Server v. 2.0、ChloroP 1.1和TargetP 1.1分别预测GmSADs家族成员的跨膜结构域和N-末端转运肽(TP)，其中拟南芥AtSSI2作为对照。结果表明，GmSAD家族成员均不存在跨膜结构域。GmSAD1、GmSAD2和GmSAD3分别含有50、61和25个氨基酸的叶绿体转运肽，类似于拟南芥AtSSI2。表明这3种蛋白可能在叶绿体中发挥作用，这与前人报道的SAD一般在细胞质体内进行脂肪酸催化反应相一致[37]。此外，这种叶绿体转运肽也存在于其他植物的酰基- ACPΔ9去饱和酶中[32]。
根据SOPMA网站的预测结果，GmSAD成员的二级结构共有4种(图 2A)，其中α-螺旋与无规则卷曲的比例较高，β-转角和扩展链比例较少。GmSADs各家族成员的二级结构α-螺旋的含量最高，其中GmSAD4和GmSAD5的α-螺旋比例分别为60.80%和61.72%，其余成员的比例平均约为52.38%；GmSADs成员的无规则卷曲比例范围为25.22%–33.50%，β-转角和扩展链结构的占比均小于10%。
用在线网站SWISS-MODEL对GmSADs家族成员进行三级结构预测分析并建模，结果如图 2B，预测到大豆GmSAD1蛋白活性形式为二聚体，每个单体的二级结构主要由11个α-螺旋、2个β-折叠和其他无规则卷曲组成，还含有1个由4个α螺旋束包围的二铁离子，Fe离子的配基是四螺旋束的氨基酸侧链，两个单体的二铁离子位于SAD二聚体底物结合凹槽的内部，共同组成了脱氢酶催化活性中心。
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| 图 2 大豆GmSADs蛋白的高级结构预测 Fig. 2 Prediction of the advanced structure of soybean GmSADs proteins. (A) Secondary protein structures of soybean GmSADs. Blue: alpha helix; pink: random coil; red: extended strand; green: beta turn. (B) Tertiary protein structure of soybean GmSAD1. The box is the two diiron centers of the two dimers, and the ligand of the Fe atom is the amino acid side chain or group of the four-helix bundle. |
| 图选项 |
2.3 大豆GmSADs蛋白保守域及系统进化分析利用GeneDoc软件对大豆GmSADs蛋白家族进行多序列比对分析，选用对18:0-ACP具有底物选择性的蓖麻RcSAD1 (NP_001310659.1)和拟南芥AtSSI2作为对照。由图 3可知，大豆GmSADs家族序列与蓖麻RcSAD1、拟南芥AtSSI2蛋白的氨基酸序列相似性较高，而且其保守结构域类似于RcSAD1、AtSSI2，也分布在11个α螺旋和2个β片层之内[38-39]。前人研究表明，SAD脱氢酶的8个关键氨基酸种类影响着SAD对不同链长脂肪酰-ACP的选择特异性。例如，蓖麻RcSAD1的关键氨基酸残基(M114、L115、T117、L118、P179、T181、G188和F189) (图 3)和拟南芥AtSSI2 (M152、L153、T155、L156、P217、T219、G226和F227)均能使二者特异性选择并催化18︰0-ACP生成18︰1-ACP[40]。另外，将蓖麻RcSAD1的T117、L118、F189和T206突变为其他氨基酸，则RcSAD1的催化底物由Δ9-18︰0-ACP改变为Δ6-16︰0-ACP或烯丙醇反式异构体(E)-10-18︰1-9-OH[37, 41]。多序列比对结果显示，大豆GmSAD1和GmSAD2的关键氨基酸与RcSAD1和AtSSI2的完全相同，GmSAD5含有2个变异氨基酸(L86Ⅰ，T88N)，GmSAD3和GmSAD4含有的变异氨基酸数目最多，分别为4 (M127Ⅰ、L128M、T130G和T194F)和5 (M142T、L143M、T145N、P207Ⅴ和T209M)。推测这些GmSADs的催化功能可能在底物选择方面存在差异。此外，GmSADs家族除了GmSAD4之外，还存在两个具有典型SAD特征的保守的组氨酸富集区，即EENRHG和DEKRHE，其中天冬氨酸(D)和组氨酸(H)为GmSAD催化活性中心的二铁离子提供了必需的结合位点，保证脱氢酶具备一定的催化活性。
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| 图 3 大豆GmSADs的多序列比对 Fig. 3 Multiple sequence alignment of soybean GmSADs with SADs from castor bean (RcSAD1) and Arabidopsis (AtSSI2). Residues in black represent 100% conservation of all sequences; residues in dark gray represent > 75% identity of all sequences; Residues in light gray > 50% identity of all sequences. The underline indicates the transit peptides. The boxes represent two conserved histidine-rich motifs EENRHG and DEKRHE. Functional determinative amino acids were marked in rectangles and numbered according to the start codon of RcSAD1. |
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利用MEGA7.0软件对大豆GmSAD家族和其他植物SADs蛋白进行多序列系统进化分析。结果如图 4所示，GmSAD家族5个成员大致分为两类：GmSAD1和GmSAD2与拟南芥AtSSI2、蓖麻RcSAD1、油菜BnSAD1等亲缘关系较近，聚为一类；而GmSAD3、GmSAD4和GmSAD5则与拟南芥AtSAD6亲缘关系较近。
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| 图 4 大豆GmSADs蛋白与其他植物SAD(AtSSI2、AtSAD1–6、RcSAD1、BnSAD、StSAD和TcSAD1)的系统发育分析 Fig. 4 Phylogenetic analysis of soybean GmSADs and other plant SADs (AtSSI2, AtSAD1–6, RcSAD1, BnSAD, StSAD and TcSAD1) |
| 图选项 |
2.4 大豆GmSADs家族成员的表达模式为鉴定这些大豆GmSADs家族成员是否行使功能，我们应用qRT-PCR分析这些基因的表达模式。结果如图 5所示，GmSAD1、GmSAD2和GmSAD5在所有组织中均高水平表达，其中GmSAD1和GmSAD2在根、茎、叶、花、果荚中表达量较高(图 5A和5B)，表明GmSAD1和GmSAD2可能在这些营养组织中发挥重要脱氢功能。GmSAD3和GmSAD4在各组织的表达量均极低(图 5C和5D)。重要的是，GmSAD5在发育种子中的表达量显著高于在其他组织中的表达(图 5E)，显示其主要在种子中行使功能。对不同发育时期大豆种子检测表明，随着种子发育，GmSAD5表达快速升高，在大豆种子发育晚期的表达量达到峰值(图 5F)，而其他4个GmSAD表达量极低。大豆种子发育中、晚期正是油脂积累高峰期，推测GmSAD5可能在大豆种子发育过程中参与油脂合成和储存等重要过程。
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| 图 5 大豆GmSADs基因在不同组织(A–E)和种子不同发育阶段(F)的表达模式 Fig. 5 Expression pattern of soybean GmSADs gene in different tissues (A–E) and developing seeds (F). Error bars indicate the standard deviation of 6 biological replicates; Letters a, b, c, represent the significant differences between the different groups (P < 0.05). |
| 图选项 |
2.5 大豆GmSAD5基因的克隆和表达载体构建为解析GmSAD5编码的酶蛋白是否具有SAD酶活性以及在大豆油脂生物合成中的功能，我们克隆了GmSAD5基因，并分别构建植物表达载体和酵母表达载体。以发育中晚期的大豆种子cDNA为模板，通过高保真PCR扩增出GmSAD5基因片段，经回收纯化和测序验证，成功克隆出GmSAD5。
利用XbaⅠ和KpnⅠ分别双酶切上述基因片段和植物表达载体pCAMBIA1303，然后利用T4 DNA连接酶将二者进行连接，双酶切验证获得重组植物表达载体pCAMBIA1303-GmSAD5。采用类似方法，构建了GmSAD5的酵母表达载体(pYES2.0-GmSAD5)。
2.6 大豆GmSAD5基因在烟草叶片的异源表达及对总油脂含量和脂肪酸成分的影响利用农杆菌介导本氏烟草叶片瞬时表达GmSAD5基因，检测GmSAD5过表达是否引起叶组织脂肪酸成分和油脂积累的改变。取注射2 d的叶片检测GmSAD5的表达，结果如图 6A所示，转基因烟草叶片能扩增出约1 014 bp的目的条带，而转空载的烟草叶片则无目的条带，表明短时间内，GmSAD5基因在烟草叶片中得以有效表达。取注射6 d的叶片进行总脂检测(图 6B)显示，转基因烟草叶片的总脂含量明显比野生型和转空载的烟叶高2.73%和2.80%。脂肪酸成分分析(图 6C)表明，与野生型和转pCAMBIA1303空载的烟草叶片相比，转GmSAD5烟草叶片的不饱和油酸(C18︰1)和亚油酸(C18︰2)分别增加了5.56%和8.14%，而C16︰0、C18︰0、C18︰3和C20︰0的含量均降低，尤其是硬脂酸(C18︰0)，下降了约2.46%。另外，亚麻酸(C18︰3)的含量也明显下降了约10.29%。总之，GmSAD5能够提高烟草叶片中总脂的含量，其中饱和脂肪酸(尤其是硬脂酸)含量显著降低，不饱和油酸(C18︰1)含量显著增加。这表明GmSAD5在烟叶组织中能行使SAD功能，催化18︰0-ACP生成18︰1-ACP，且促进总油脂的积累。
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| 图 6 转GmSAD5基因烟草叶片中的目的基因表达分析(A)、总脂质含量(B)和脂肪酸谱(C) Fig. 6 Expression analysis of GmSAD5 gene (A), total lipid content (B) and fatty acid profiles (C) in the transgenic tobacco leaves. (A) M: 2 000 bp marker; 1–3: transgenic tobacco leaves; 4–6: transgenic tobacco leaves with GmSAD5. (B–C) Error bars indicate the standard deviation of 6 biological replicates; Letters a, b, c, represent the significant differences between the different groups (P < 0.05). |
| 图选项 |
2.7 大豆GmSAD5基因在SAD缺陷酵母中的异源表达及对脂肪酸成分的影响在不饱和脂肪酸合成缺陷的酿酒酵母(BY4389)中异源表达GmSAD5基因，转化酵母经缺尿嘧啶培养基筛选和PCR检测分析(图 7A)显示，转基因酵母均扩增出大小为1014bp的条带，且能够在不含油酸的培养基中正常生长扩繁。然而，SAD缺陷型和转空载的酵母则无法正常生长。这表明转基因酵母能够合成不饱和脂肪酸并满足自身生长需求，证明GmSAD5具有SAD酶活性。经气相色谱进一步检测酵母细胞脂肪酸成分，发现转基因酵母经半乳糖诱导表达后合成的棕榈酸(C16︰0)和硬脂酸(C18︰0)含量均明显下降了约4.19%和7.46% (图 7B)，但是产生了大量的单不饱和油酸(C18︰1，约10.72%)和少量棕榈油酸(C16︰1)。而缺陷型和转空载酵母均不含上述不饱和脂肪酸(图 7B)。这表明GmSAD5确实能使缺陷型酵母生成不饱和脂肪酸，且主要选择硬脂酰-ACP (18︰0-ACP)为底物并催化其脱氢形成油酰-ACP (18︰1-ACP)。
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| 图 7 GmSAD5基因在缺陷酵母BY4389中的异源表达及对脂肪酸成分的影响 Fig. 7 Heterologous expression of GmSAD5 gene in SAD-defective yeast BY4389 and its impact on fatty acid profiles. (A) PCR verification of GmSAD5 expression in the transgenic BY4389; M: 2 000 bp marker; 1–3: transgenic BY4389 yeast with empty vector; 4–6: transgenic BY4389 yeast with GmSAD5 gene. (B) Fatty acid content in the transgenic BY4389 yeast. WT: the SAD-defective BY4389 yeast; Empty: BY4389 yeast transformed with empty vector; GmSAD5: BY4389 yeast transformed with GmSAD5 gene. Error bars indicate the standard deviation of 6 biological replicates; Letters a, b, c, represent the significant differences between the different groups (P < 0.05). |
| 图选项 |
3 讨论大豆作为我国农业的主要经济作物之一，除了为人们提供豆类蛋白之外，还是人们日常生活食用植物油的主要来源之一[42]。尽管大豆油含量较高，在食品加工业应用广泛，但高含量的多不饱和脂肪酸增加容易使大豆油氧化酸败，从而限制了大豆油食用价值和利用率。而高油酸大豆油兼具饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸特性，氧化稳定性强，长期食用能够减少人体有害胆固醇并使人体内的有益胆固醇得到很好地保持，从而可减少心脑血管等疾病的发生。因此，探究大豆硬脂酰-ACP Δ9脱氢酶的催化活性以解析油酸分子合成机制并为后续通过转基因工程培育高油酸大豆具有重要的指导意义。
本研究从大豆基因组鉴定获得5个GmSAD家族成员，预测到这些酶均以同型二聚体形式存在，每个单体含有一个二铁中心，且含一个属于类铁蛋白家族和属于酰基-ACP脱氢酶家族的保守结构域，此外，由2个铁原子组成的二铁中心包裹于4螺旋束中。硬脂酰-ACPΔ9脱氢酶(SAD)是一种脱氢酶，在将油中的饱和脂肪酸转化为不饱和脂肪酸中起关键作用，大豆GmSADs家族中这5个大豆GmSADs基因的内含子数目差异较大，如GmSAD4有4个内含子，GmSAD3和GmSAD5基因仅有1个内含子。GmSADs成员在编码蛋白长度、相对分子量、理论等电点等理化性质也随着基因编码序列的长短和碱基比例不同而表现出不同的差异，如GmSAD5编码蛋白长度为337 aa，相对分子量为38.63 kDa，二级结构的α螺旋含量最高，分布较为均匀；而GmSAD2编码蛋白序列最长(402 aa)，相对分子质量也较大(46.09 kDa)，二级结构的α螺旋含量相对较少，在序列中间分布密集。
时空表达分析揭示，这些GmSADs基因在大豆根、茎、叶、花、果荚和不同发育时期的豆子中都具有不同的表达模式。GmSAD1和GmSAD2在大豆各组织中均有表达，而只有GmSAD5在整个发育阶段的大豆种子，特别是在中晚期具有极高的表达量，且与种子油脂积累时期相吻合。这表明GmSAD5主要在发育种子中行使功能，在种子油脂积累中起重要作用。与之相似的是，Zhang等报道，可可TcSAD1在发育胚中的表达量较高，TcSAD1能提高拟南芥ssi2突变体种子的油酸(18︰1Δ9)含量，其功能类似于拟南芥AtSSI2[23]。
已有研究表明，SAD酶蛋白催化中心的8个关键氨基酸可能决定着SAD的底物特异性。这8个关键氨基酸残基种类发生改变时常导致该脱氢酶对底物选择活性的改变。例如，拟南芥AtSSI2这8种关键氨基酸依次为M152、L153、T155、L156、P217、T219、G226和F227，AtSSI2则对18︰0-ACP选择活性远远高于16︰0-ACP；当T219突变为F219时，其对16︰0-ACP的选择活性远远高于18︰0-ACP。然而，AtSSI2蛋白P217突变为S217，则不影响AtSSI2对18︰0-ACP的选择活性[40, 43]。同样，猫爪草MucACP-Δ9脱氢酶对16︰0-ACP有特异的选择活性，其仅在和AtSSI2脱氢酶L156的对应位置处含有一个变异氨基酸，即L152W[40]。序列分析表明，GmSAD5在与AtSSI2的L153和T155对应位置处也含有两个变异的关键氨基酸(L86Ⅰ和T88N)。通过GmSAD5基因烟草叶片瞬时表达和缺陷型酵母遗传转化测试显示，GmSAD5仍表现出对18︰0-ACP的特异选择性。这表明，并非所有SAD的底物选择性都由SAD酶蛋白催化中心这8个关键氨基酸决定，这8个关键氨基酸及其相邻氨基酸的空间排列构型也可能控制着催化底物的选择性。值得注意的是，农杆菌介导的烟草瞬时表达是一种常用的鉴别目标基因功能方法，具有简单、快速、周期短、生物安全性高等优点。但有时不能反映所测目的基因功能的全貌，所测表型的变化准确性也受到接种量的多少、叶片的生理状况及环境条件等因素影响。进一步论证GmSAD5基因功能，还需要进行种子特异过表达该基因，或沉默及敲除该基因及该基因家族其他成员的遗传转化试验。本研究鉴定获得5个GmSAD特别是GmSAD5分子克隆可作为大豆油脂品质改良及油脂合成途径基因修饰的优异靶标。
4 结论本研究鉴定获得5个大豆GmSAD家族成员，预测分析表明，均具有Fe-O-Fe中心和SAD酶特有的两个保守组氨酸富集基序(EENRHG和DEKRHE)，为同源二聚体活性酶蛋白。五个GmSAD基因在大豆各组织中表达模式不同，其中GmSAD5在发育种子中晚期高量表达，与大豆油脂快速积累时期相吻合。烟草叶片瞬时表达和酵母突变体功能互补测试表明GmSAD5能高效催化硬脂酸生成油酸，促进细胞总油脂合成积累。本研究为解析大豆种子油脂生物合成调控机制和大豆油脂品质改良提供了新知识和优异分子靶标。
参考文献
| [1] | Qi WD, Shang MR. Research on China's soybean industry development. Chin Agric Sci Bull, 2014, 30(17): 88-96 (in Chinese). 祁旺定, 尚明瑞. 中国大豆产业发展问题研究. 中国农学通报, 2014, 30(17): 88-96. |
| [2] | Fan SX, Li B, Sun JM, et al. A quantitative gas chromatographic method for determination of soybean seed fatty acid components. Chin J Oil Crop Sci, 2015, 37(4): 548-553 (in Chinese). 范胜栩, 李斌, 孙君明, 等. 气相色谱方法定量检测大豆5种脂肪酸. 中国油料作物学报, 2015, 37(4): 548-553. |
| [3] | 顾和平, 凌以禄, 韩锋, 等. 栽培和野生大豆脂肪酸的组成、相关及其差异的研究. 江苏农业科学, 1989(10): 13-15. |
| [4] | Rodríguez MFR, Sánchez-García A, Salas JJ, et al. Characterization of soluble acyl-ACP desaturases from Camelina sativa, Macadamia tetraphylla and Dolichandra unguis-cati. J Plant Physiol, 2015, 178: 35-42. |
| [5] | Zhang F, Gao XQ, Zhang JJ, et al. Seed-specific expression of heterologous gene DGAT1 increase soybean seed oil content and nutritional quality. Chin J Biotech, 2018, 34(9): 1478-1490 (in Chinese). 张飞, 高秀清, 张靖洁, 等. 种子特异表达异源DGAT1基因提高大豆种子含油量和营养品质. 生物工程学报, 2018, 34(9): 1478-1490. |
| [6] | Fehr WR. Breeding for modified fatty acid composition in soybean. Crop Sci, 2007, 47(S3): S-72-S-87. |
| [7] | Al Amin N, Ahmad N, Wu N, et al. CRISPR-Cas9 mediated targeted disruption of FAD2-2 microsomal omega-6 desaturase in soybean (Glycine max. L). BMC Biotechnol, 2019, 19(9). |
| [8] | Kinney AJ. Improving soybean seed quality. Nat Biotechnol, 1996, 14: 946. |
| [9] | Wu YM, Mao X, Wang SJ, et al. Improving the nutritional value of plant foods through transgenic approaches. Chin J Biotech, 2004, 20(4): 471-476 (in Chinese). 吴永美, 毛雪, 王书建, 等. 转基因改良植物的营养价值. 生物工程学报, 2004, 20(4): 471-476. |
| [10] | Yue AQ, Sun XP, Li RZ. Metabolic engineering of edible plant oils. J Plant Physiol Mol Biol, 2007, 33(6): 489-498 (in Chinese). 岳爱琴, 孙希平, 李润植. 食用植物油脂的代谢工程. 植物生理与分子生物学学报, 2007, 33(6): 489-498. |
| [11] | Do PT, Nguyen CX, Bui HT, et al. Demonstration of highly efficient dual gRNA CRISPR/Cas9 editing of the homeologous GmFAD2-1A and GmFAD2-1B genes to yield a high oleic, low linoleic and α-linolenic acid phenotype in soybean. BMC Plant Biol, 2019, 19: 311. |
| [12] | Fox BG, Shanklin J, Somerville C, et al. Stearoyl-acyl carrier protein delta 9 desaturase from Ricinus communis is a diiron-oxo protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90(6): 2486-2490. |
| [13] | Ramesh AM, Kesari V, Rangan L. Characterization of a stearoyl-acyl carrier protein desaturase gene from potential biofuel plant, Pongamia pinnata L. Gene, 2014, 542(2): 113-121. |
| [14] | Kachroo A, Shanklin J, Whittle E, et al. The Arabidopsis stearoyl-acyl carrier protein-desaturase family and the contribution of leaf isoforms to oleic acid synthesis. Plant Mol Biol, 2007, 63(2): 257-271. |
| [15] | Li F, Bian CS, Xu JF, et al. Cloning and functional characterization of SAD genes in potato. PLoS One, 2015, 10(3): e0122036. |
| [16] | Shanklin J, Cahoon EB. Desaturation and related modifications of fatty acids. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1998, 49: 611-641. |
| [17] | Xue JA, Mao X, Wu YM, et al. Expression of yeast acyl-△9 desaturase for fatty acid biosynthesis in tobacco. Chin J Biotech, 2013, 29(5): 630-645 (in Chinese). 薛金爱, 毛雪, 吴永美, 等. 酿酒酵母脂酰-?9脱氢酶亚细胞定位表达及其对烟草脂肪酸合成的影响. 生物工程学报, 2013, 29(5): 630-645. |
| [18] | Han YJ, Xu G, Du HW, et al. Natural variations in stearoyl-acp desaturase genes affect the conversion of stearic to oleic acid in maize kernel. Theor Appl Genet, 2017, 130(1): 151-161. |
| [19] | Lindqvist Y, Huang W, Schneider G, et al. Crystal structure of delta9 stearoyl-acyl carrier protein desaturase from castor seed and its relationship to other di-iron proteins. EMBO J, 1996, 15(16): 4081-4092. |
| [20] | Shang XG, Cheng CZ, Ding J, et al. Identification of candidate genes from the SAD gene family in cotton for determination of cottonseed oil composition. Mol Genet Genomics, 2017, 292(1): 173-186. |
| [21] | Dong JY, Wan YS, Liu FZ. Sequence analysis of Δ9-Stearoyl-ACP desaturase gene (SAD) in peanut. Acta Agronom Sin, 2012, 38(7): 1167-1177 (in Chinese). 东金玉, 万勇善, 刘风珍. 花生Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因(SAD)的序列分析. 作物学报, 2012, 38(7): 1167-1177. |
| [22] | Jia YL, Wu L, Lu CM. Stearoyl-acyl carrier protein desaturase (SAD) gene cloning and expression in Brassica napus. Chin J Oil Crop Sci, 2014, 36(2): 135-141 (in Chinese). 贾艳丽, 吴磊, 卢长明. 甘蓝型油菜Δ9硬脂酰ACP脱氢酶(SAD)基因的克隆与表达分析. 中国油料作物学报, 2014, 36(2): 135-141. |
| [23] | Zhang YF, Maximova SN, Guiltinan MJ. Characterization of a stearoyl-acyl carrier protein desaturase gene family from chocolate tree, Theobroma cacao L. Front Plant Sci, 2015, 6: 239. |
| [24] | Liu Q, Singh SP, Green AG. High-stearic and High-oleic cottonseed oils produced by hairpin RNA-mediated post-transcriptional gene silencing. Plant Physiol, 2002, 129(4): 1732-1743. |
| [25] | Carrero-Colón M, Abshire N, Sweeney D, et al. Mutations in SACPD-C result in a range of elevated stearic acid concentration in soybean seed. PLoS One, 2014, 9(5): e97891. |
| [26] | Zaborowska Z, Starzycki M, Femiak I, et al. Yellow lupine gene encoding stearoyl-ACP desaturase— Organization, expression and potential application. Acta Biochim Pol, 2002, 49(1): 29-42. |
| [27] | Craig W, Lenzi P, Scotti N, et al. Transplastomic tobacco plants expressing a fatty acid desaturase gene exhibit altered fatty acid profiles and improved cold tolerance. Transgenic Res, 2008, 17(5): 769-782. |
| [28] | Liao BN, Lu JX, Huang XL, et al. Cloning and expression analysis of stearoyl-ACP desaturase gene PoSAD from Paeonia ostii. Acta Bot Boreal Occident Sin, 2018, 38(1): 35-40 (in Chinese). 廖冰楠, 陆俊杏, 黄兴琳, 等. 牡丹PoSAD基因克隆与表达分析. 西北植物学报, 2018, 38(1): 35-40. |
| [29] | Iskandarov U, Silva JE, Kim HJ, et al. A specialized diacylglycerol acyltransferase contributes to the extreme medium-chain fatty acid content of Cuphea seed oil. Plant Physiol, 2017, 174(1): 97-109. |
| [30] | Xue WB, Liu F, Sun Z, et al. A Δ-9 fatty acid desaturase gene in the microalga Myrmecia incisa Reisigl: cloning and functional analysis. Int J Mol Sci, 2016, 17(7): 1143. |
| [31] | Wilkins MR, Gasteiger E, Bairoch A, et al. Protein identification and analysis tools in the ExPASy server. Methods Mol Biol, 1999, 112: 531-552. |
| [32] | Emanuelsson O, Nielsen H, Von Heijne G. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Sci, 1999, 8(5): 978-984. |
| [33] | Emanuelsson O, Nielsen H, Brunak S, et al. Predicting subcellular localization of proteins based on their n-terminal amino acid sequence. J Mol Biol, 2000, 300(4): 1005-1016. |
| [34] | Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol, 2007, 24(8): 1596-1599. |
| [35] | Wu YJ, Jang B, Zhang Y, et al. Transient expression in tobacco by agrobacterium-mediated transformation. J Northeast For Univ, 2010, 38(9): 110-112 (in Chinese). 吴英杰, 姜波, 张岩, 等. 农杆菌介导的烟草瞬时表达试验条件优化. 东北林业大学学报, 2010, 38(9): 110-112. |
| [36] | Ji XJ, Mao X, Hao QT, et al. Splice variants of the castor WRI1 gene upregulate fatty acid and oil biosynthesis when expressed in tobacco leaves. Int J Mol Sci, 2018, 19: 146. |
| [37] | Cahoon EB, Lindqvist Y, Schneider G, et al. Redesign of soluble fatty acid desaturases from plants for altered substrate specificity and double bond position. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(10): 4872-4877. |
| [38] | Chi XY, Yang QL, Pan LJ, et al. Isolation and characterization of fatty acid desaturase genes from peanut (Arachis hypogaea L). Plant Cell Rep, 2011, 30(8): 1393-1404. |
| [39] | Hwangbo K, Ahn JW, Lim JM, et al. Overexpression of stearoyl-ACP desaturase enhances accumulations of oleic acid in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Plant Biotechnol Rep, 2014, 8(2): 135-142. |
| [40] | Liu BL, Sun Y, Xue JA, et al. Stearoyl-ACP Δ9 Desaturase 6 and 8 (GhA-SAD6 and GhD-SAD8) are responsible for biosynthesis of palmitoleic acid specifically in developing endosperm of upland cotton seeds. Front Plant Sci, 2019, 10: 703. |
| [41] | Whittle EJ, Tremblay AE, Buist PH, et al. Revealing the catalytic potential of an acyl-ACP desaturase: Tandem selective oxidation of saturated fatty acids. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(38): 14738-14743. |
| [42] | Li RZ, Hatanaka T, Yu KS, et al. Soybean oil biosynthesis: role of diacylglycerol acyltransferases. Funct Integr Genomics, 2013, 13(1): 99-113. |
| [43] | Troncoso-Ponce MA, Barthole G, Tremblais G, et al. Transcriptional activation of two Delta-9 Palmitoyl-ACP desaturase genes by MYB115 and MYB118 is critical for biosynthesis of Omega-7 monounsaturated fatty acids in the endosperm of arabidopsis seeds. Plant Cell, 2016, 28(10): 2666-2682. |
