1. 南阳师范学院 生命科学与技术学院，河南 南阳 473061;
2. 广东省生物资源应用研究所 广东省动物保护与资源利用重点实验室 广东省野生动物保护与利用公共实验室，广东 广州 510260;
3. 河南省菌类食品工程技术研究中心，河南 南阳 473061;
4. 南阳师范学院校医院，河南 南阳 473061
收稿日期：2019-05-25；接收日期：2019-08-16；网络出版时间：2019-09-10
基金项目：国家重点研发计划(No. 2017YFF0210204)，河南省科技厅科技攻关项目(No. 182102311044)，河南省菌类食品工程技术研究中心开放课题(No. 2019HM0010)，广东省科学院科技发展专项(Nos. 2019GDASYL-0302007, 2019GDASYL-0501006, 2017GDASCX-0107, 2018GDASCX-0107)，广东省科技计划项目(Nos. 2017B020202005, 2015B090906011, 2016B090923009, 2016B090923005)资助
通讯作者：Runqian Mao. Tel: +86-20-34454321; E-mail: maorun@giabr.gd.cn.
摘要：旨在获得具有氯化功能的过水解酶，拓展过水解酶资源，为其工业应用奠定基础。以唐河某造纸厂污泥为材料构建宏基因组文库，通过活性筛选获得一个细菌过水解酶Per822。使用大肠杆菌异源表达Per822，研究纯化后的重组蛋白酶学性质并检测了生成过乙酸的能力。测序结果显示per822编码一个含273个氨基酸的蛋白。Per822是典型的多功能酶代表，分别具有过氧化物酶、卤代酶和酯酶的活性。Per822过水解氯化单氯二甲酮的最适反应pH为4.5，在pH 3.5–8.0范围内酶活性稳定。最适反应温度是55 ℃，在70 ℃以下酶活性稳定且氯化活性能够被Fe2+激活。以乙酸乙酯为共底物Per822显示出较强的产过乙酸能力。重组Per822的高可溶性表达、催化多功能性、较强的产过乙酸能力使得Per822在有机合成、废水处理、杀菌、生物质预处理等方面有着潜在的应用价值。
关键词：过水解酶过乙酸催化多功能性Fe2+激活
Molecular cloning and characterization of a novel metagenome-derived bacterial perhydrolase
Bingxue Dong1,2,3, Yuke Ya1, Wei Zhang4, Yingjun Zhang3, Caicai Li1, Anle Xu1, Huiting Li1, Runqian Mao2
1. School of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, Henan, China;
2. Guangdong Key Laboratory of Animal Conservation and Resource Utilization, Guangdong Public Laboratory of Wild Animal Conservation and Utilization, Guangdong Institute of Applied Biological Resources, Guangzhou 510260, Guangdong, China;
3. Henan Engineering Technology Research Center for Mushroom-based Foods, Nanyang 473061, Henan, China;
4. School Infirmary, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, Henan, China
Received: May 25, 2019; Accepted: August 16, 2019; Published: September 10, 2019
Supported by: National Key Research and Development Program of China (No. 2017YFF0210204), Key Grant of Science and Technology Department of Henan Province (No. 182102311044), the Open Project Program of Henan Engineering Technology Research Center for Mushroom-based Foods (No. 2019HM0010), GDAS Special Project of Science and Technology Development (Nos. 2019GDASYL-0302007, 2019GDASYL-0501006, 2017GDASCX-0107, 2018GDASCX-0107), Science and Technology Planning Project of Guangdong Province (Nos. 2017B020202005, 2015B090906011, 2016B090923009, 2016B090923005)
Abstract: The aim of this study is to obtain bacterial perhydrolases with chlorination activity, expands the resources of perhydrolases, and lays a foundation for it's industrial applications. We constructed a metagenomic library using environmental DNA isolated from sludge samples of a paper mill of Tanghe county, and identified a per822 gene encoding a bacteria perhydrolase via activity-based functional screening. Then, we overexpressed Per822 heterologously in Escherichia coli, and characterized the recombinant enzyme after purification. Finally, we further investigated the ability of Per822 to produce peracetic acid (PAA). Sequence analysis revealed that per822 encoded a protein of 273 amino acids. The recombinant Per822 had the activity of peroxidase, esterase and halogenase respectively, and thus was regarded as a typical representative of multifunctional enzymes. The purified Per822 exhibited maximal chlorination activity (hyperhydrolysis) at 55 ℃ and pH 4.5 with monochlorodimedone as substrate, and the enzyme was stable in the pH range of 3.5–8.0 and below 70 ℃. Also, the chlorination activity of this enzyme could be activated by Fe2+. In addition, the enzyme displayed high ability to generate PAA using ethyl acetate as cosubstrate. The highly soluble expression, catalytic versatility and good PAA production capacity of Per822 make it a potential candidate in organic synthesis, wastewater treatment, disinfection and biomass pretreatment, etc.
Keywords: perhydrolaseperacetic acidcatalytic versatilityFe2+ activation
过水解酶(Perhydrolase)，先前称作细菌无辅基卤过氧化物酶或者非血红素卤过氧化物酶[1]，是一类能够可逆地催化羧酸(羧酸酯)和过氧化氢生成过羧酸的酶[2-4]。该类酶属于α/β水解酶超家族，活性中心具有Ser-His-Asp催化三体，在进化上和酯酶(脂肪酶)具有相同起源[5-6]。和血红素氯过氧化物酶类似，过水解酶具有催化多功能性，在体外能够进行卤代反应、酯水解反应[7]、C-C键水解反应[5]和特殊的氧化反应如硫化物氧化[8]、转化芳香胺为硝基[9]、环氧化(Prileshajev反应)和Baeyer-Villiger反应[10]等，是一类具有广阔应用前景的生物催化剂。
过水解酶能够过水解羧酸(羧酸酯)生成过羧酸。过羧酸，比如过乙酸(Peracetic acid, PAA)，是应用广泛的强氧化剂[11]，主要用于纺织业漂白[12]、染料脱色[13-14]、废水处理[15]、纸浆漂白、生物质预处理[16]、生产环氧衍生物[17]和ε-己内酯[3]等，另外，还可以用于农业、食品业、医疗器械等消毒杀菌[18]。传统的过乙酸生产工艺以硫酸为催化剂，反应条件严苛[19]、成本高、效率低且造成环境污染。同时，PAA是快速氧化剂，浓度大于70%容易发生爆炸，使得它储存困难、运输成本高[2]。而羧酸的过水解可逆并且热动力可控制，最适合连续生产低浓度稳态的过羧酸。
随着人们环保意识的提高，绿色安全生产意识的增强，对过水解酶的需求量大增。遗憾的是到目前为止仅分离出了几种过水解酶并进行了酶学性质的研究[1, 8, 20-24]。这些酶具有高的特殊活性、耐热、耐有机溶剂和pH变化等特点，美中不足的是这些酶大多只能发生溴代，无过氧化氢酶活性，只在溴离子或碘离子存在时才具有过氧化物酶活性[20, 24]，限制了其在生产中的应用。宏基因组技术为我们寻找新酶基因提供了有力的技术手段，目前已经成功地使用该技术从不同生境中分离出新的酯酶、固氮酶、苯酚降解酶系、纤维素酶、淀粉酶、漆酶等基因[25-30]，而用宏基因组方法分离过水解酶尚未见报道。本文以富含氯的唐河造纸厂污泥为样品构建宏基因组文库以期分离出新型具有氯化活性的过水解酶基因，拓展过水解酶资源，为工业应用奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株和质粒大肠杆菌DH5α、BL21 (DE3) pLysS为本实验室保存；表达载体pET-32a由本实验室保存，克隆载体pUC118 BamHⅠ/BAP购自TaKaRa公司。
1.1.2 主要试剂限制性内切酶、连接酶和PCR用高保真酶(PrimeSTAR Max Premix)购自TaKaRa公司；蛋白提取试剂购自Novagen公司；土壤基因组快速提取试剂盒购自MP Biomedicals公司；质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自Omega公司；蛋白纯化试剂盒购自QIAGEN公司；2, 2′-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸) [2, 2?-azino-bis (3-ethylbenz thiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]、对硝基苯酯系列(碳链长度2–16，C2–C16)、单氯二甲酮(Monochlorodi-medone，MCD)、丙二醇二乙酸酯(Propylene glycol diacetate，PGD)、乙酸乙酯(Ethyl acetate，EA)购自Sigma公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 土壤样品DNA提取取唐河某造纸厂多处污泥样品，参照商家提供的说明书进行基因组DNA提取。
1.3 宏基因组文库的构建及过水解酶基因筛选宏基因组文库构建参考前期工作[30]：使用BamHⅠ部分酶切基因组DNA，回收长度为2.0–8.5 kb的DNA片段，连至pUC118 BamHⅠ/BAP载体，电击转化大肠杆菌DH5α，构建造纸厂污泥宏基因组文库。接种文库到含有100 μg/mL氨苄青霉素(Amp)、1.0 mmol/L IPTG和1%三丁酸甘油酯的LB平板上37 ℃培养过夜，同时复制文库到每孔含500 μL LB培养基(添加50 μg/mL Amp、0.25 mmol/L IPTG)的深孔96孔板37 ℃培养过夜。参照说明书裂解细胞提取蛋白。加入0.1 mol/L NaAC (pH 4.5)缓冲液100 μL、以0.5 mmol/L的ABTS和1 μL 30%双氧水为底物筛选。挑取三丁酸甘油酯平板上产生透明圈并且ABTS反应变蓝绿色的克隆检测并送Invitrogen公司测序。
1.4 过水解酶序列分析及系统发育树构建过水解酶ORF的确定、序列分析及系统树构建参考前期工作[30]。根据ORF的大小将该基因命名为per822，所编码蛋白命名为Per822，所在质粒命名为pUC118-per822。
1.5 过水解酶基因的克隆及原核表达条件优化以pUC118-per822为模板，设计如下引物进行PCR扩增：per822F (5′-CCGGAA TTCATGAAG ACGTTGACAGTT-3′)和per822R (5′-CCCAAGC TTTTAGGAGTTGATGAATTTGAGGATG-3′)。反应体系(15 μL)：模板1 ng，2×PrimeSTAR Max Premix 7.5 μL，上、下游引物各10 pmol，无菌超纯水补至总体积15 μL。扩增条件：95 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，30个循环；72 ℃ 5 min。将PCR产物用EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切并回收连接至pET-32a，电击转化大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS。挑阳性克隆命名为per822/BL21。蛋白表达条件优化参考前期工作[30]：接种per822/BL21到LB液体培养基培养至OD600为0.6，添加终浓度为0.1?4.0 mmol/L的IPTG分别在20、25、30、37 ℃下200 r/min诱导8 h。
1.6 重组过水解酶纯化、分子量估算及浓度测定在4 ℃、8 000 r/min离心10 min取细胞超声波破碎，使用蛋白纯化试剂盒对重组蛋白进行纯化。
SDS-PAGE检测酶的纯度并估算分子量。酶浓度使用NanoDrop 2000微量紫外分光光度计测定[ε=4.1370×104 L/(mol·cm)]。
1.7 酶活性的测定1.7.1 过水解活性检测过水解活性检测使用MCD法[31]，略作修改：以0.1 mol/L pH 4.5的NaAC为缓冲液，200 μL反应体系含MCD 44 mmol/L，KCL 80 mmol/L，双氧水7.2 mmol/L，55 ℃预热数分钟，加入适量的酶起始反应，以失活的酶为对照，290 nm下测量吸光值的下降，酶活定义为1 min内氯化1 μmol MCD的酶量为一个单位[ε=1.99×104 L/(mol·cm)]。
1.7.2 酯酶活性检测酯酶活性测定使用对硝基苯酯方法[25]：以pH 8.5的Britton-Robinson缓冲液为缓冲体系，100 μL反应体系含对硝基苯酯(碳链长度从2到16，C2–C16) 0.5 mmol/ L，40 ℃保温数分钟，加入适量的酶起始反应，5 min后加入50 μL 20% SDS终止反应，全波段酶标仪405 nm下测吸光值的增加，用不含酶的体系作为对照，以1 min内水解1 μmol对硝基苯酯所需要的酶量定义为一个单位[ε=1.6×104 L/(mol·cm)]。
1.7.3 过氧化物酶活性检测过氧化物酶活性测定使用ABTS法[32]：45 ℃预热含0.5 mmol/L ABTS的缓冲液(pH 4.5的1.0 mol/L NaAC)，加入适量的酶和双氧水启动反应。420 nm下测光吸收值变化，以1 min内生成1 μmol ABTS阳离子所需要的酶量定义为一个单位(U) [ε=3.6×104 L/(mol·cm)]。
1.8 酶学特性研究1.8.1 pH对过水解酶反应的影响最适反应pH测定采用0.1 mol/L NaAC缓冲液(pH 3.5–6.0)和Britton-Robinson缓冲液(pH 6.5–8.0)，200 μL反应体系含260 ng纯化的Per822，其他条件同1.7.1。pH稳定性测定则是将纯化后的Per822加入上述缓冲液内4 ℃保温2 h，再调pH至最适，55 ℃测定剩余酶活，每个反应至少3个重复。
1.8.2 温度对酶反应的影响最适反应温度测定时每5 ℃为一个梯度，范围从30 ℃至80 ℃。以0.1 mol/L醋酸钠(pH 4.5)作为缓冲液，其他条件同最适pH测定。温度稳定性测定时将纯化后的Per822在上述温度下保温2 h，冷却后按最适条件测定剩余酶活，每个反应至少3个重复。
1.8.3 动力学参数的测定以不同浓度的MCD为底物，以pH 4.5的0.1 mol/L NaAC为缓冲液，加入10 mmol/L H2O2和80 mmol/L KCl，反应温度设为55 ℃；全波段酶标仪290 nm下测量吸光值的下降，计算不同浓度下的酶活，每个实验3个重复。采用Graphpad prism 6软件中的米氏方程对动力学参数(Km和kcat)进行计算、拟合。
1.8.4 金属离子对酶反应的影响将适量的酶和不同浓度的各金属离子加入pH 4.5的NaAc缓冲液中冰上预处理15 min，加入44 mmol/L MCD，80 mmol /L KCl，7.2 mmol/L双氧水起始反应，在最适条件下测酶活，以未加金属离子的反应作为对照，每个反应至少3个重复。
1.9 过乙酸生成能力检测1.9.1 共底物对过乙酸产生的影响过乙酸的浓度检测使用ABTS法[14, 16]，以pH 4.5的柠檬酸-磷酸(50 mmol/L pH 7.1的磷酸钾)为缓冲液，标准反应体系(1 mL)：含100 mmol/L H2O2，100 mmol/L PGD(100 mmol/L NaAC或者500 mmol/L的EA)和终浓度2.0 μg/mL的Per822。混合物在45 ℃下200 r/min振荡20 min。PAA浓度检测：用去离子水将反应液25 μL稀释100倍，接下来，将25 μL的稀释液加75 μL去离子水、0.9 mL检测试剂(检测试剂配制：向5 mL柠檬酸钾缓冲液(125 mmol/L，pH 5.0)中加入100 mmol/L的ABTS水溶液50 μL、25 mmol/L KI水溶液10 μL)混匀，混合物在室温孵育3 min，420 nm下测吸光值。
PAA浓度计算：[PAA] (mmol/L)=A420×0.242×400 (400为稀释倍数)。
1.9.2 高浓度底物和酶量对过乙酸产生的影响以柠檬酸-磷酸(pH 4.5)为缓冲液，反应体系(5 mL)含1 mol/L H2O2、1 mol/L (0.5 mol/L)的EA和终浓度2.0 μg/mL (10 μg/mL)的Per822，45 ℃下200 r/min振荡孵育，分别在反应的10 min、20 min、40 min、60 min和80 min取样，PAA生成量的计算参考1.9.1，评价高浓度底物和酶量对PAA生成的影响。
1.9.3 Per822对过乙酸的耐受性以pH 4.5的柠檬酸-磷酸为缓冲液，1 mL标准体系中含500 mmol/L EA和2.0 μg/mL的Per822。在反应体系中分别加入1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、25 mmol/L和50 mmol/L PAA，冰上放置不同时间(0.5 h、1 h、1.5 h和2 h)，加入0.1 mol/L H2O2，45 ℃下反应40 min，以未加酶的体系作对照，测经过不同浓度PAA处理后Per822生产PAA的能力。以未经处理的Per822在40 min生产PAA量为100%，计算Per822对过乙酸的耐受能力。
1.10 核酸序列登录号所报道序列已经提交至GenBank (登录号MK614259)。
2 结果与分析2.1 宏基因组文库的构建和过水解酶基因的筛选构建的唐河造纸厂宏基因组文库约含10 200个克隆。随机选取20个克隆进行检测，酶切结果显示片段插入率为100%、大小范围2.5–7.0 kb、平均大小为5.2 kb，插入片段高度多样化；包含约53 Mb的污泥微生物DNA信息。经过初筛和复筛从文库中得到1个具有过水解酶活性的克隆。
2.2 Per822序列分析序列分析显示6.2 kb的外源片段中存在1个822 bp的完整过水解酶ORF，所编码的蛋白属于含α/β水解酶家族，命名为per822。NCBI数据库序列比对显示该蛋白与来自玉米古字状菌Runella zeae和土地杆菌Pedobacter tournemirensis的α/β水解酶(氯过氧化物酶)同源性最高(88%)；与土生嗜冷菌Algoriphagus terrigena和Confluentibacter lentus的α/β水解酶次之(87%)；与来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和来自蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)的无辅基氯过氧化物酶有60%同源性。系统发育树构建结果显示，Per822不与其他来源的过水解酶聚于一个分支(图 1)。
 |
| 图 1 Per822(uncultured bacterium MK614259)和近似相关蛋白系统发育分析 Fig. 1 Phylogenetic analysis of Per822 (uncultured bacterium MK614259) and closely related proteins. The bootstrap values (%) presented at the branches were calculated from 1 000 replications; numbers in parentheses are GenBank accession numbers; the scale bar represents sequence divergence. |
| 图选项 |
2.3 重组Per822的表达、纯化和活性检测经优化Per822最佳表达条件为：IPTG浓度0.2 mmol/L，诱导温度为25 ℃，此条件下重组蛋白以可溶性表达为主。SDS-PAGE结果显示纯化后得到了电泳纯单一条带，分子量约为45 kDa (图 2)，大小和软件推测值加上6×His标签之和相符。重组蛋白具有催化多功能性：Per822具有过氧化物酶活性，以ABTS为底物测得酶活为124.74 U/mg，且该反应不依赖Br?和I?的存在；具有酯酶活性，可以水解碳链长度从2到16的对硝基苯酯系列底物，最适底物为对硝基苯乙酯(C2)，碳链长度大于16基本测不到酶活性(图 3)；具有卤代功能，氯化MCD活性为3.72 U/mg。本实验首次发现过水解酶可以氯化MCD且具有不依赖Br?和I?的过氧化物酶活性。这些结果说明Per822是一个具有新酶学性质的过水解酶。
 |
| 图 2 纯化后重组Per822的SDS-PAGE分析 Fig. 2 SDS-PAGE analysis of purified recombinant Per822. M: standard protein molecular mass markers (sizes in kilodaltons are indicated on the left); 1: recombinant Per822 from supernatant of E. coli BL21(DE3) pLysS cell lysates; 2: recombinant Per822 purified by Ni-NTA Spin column. |
| 图选项 |
 |
| 图 3 Per822对不同链长对硝基苯酯底物特异性 Fig. 3 Substrate specificity of Per822 towards ρ-nitrophenol esters with different chain lengths. ρ-NP-acetate (C2), ρ-NP-butyrate (C4), ρ-NP-hexanoate (C6), ρ-NP-caprylate (C8), ρ-NP-decanoate (C10), ρ-NP-laurate (C12), ρ-NP-myristate (C14), ρ-NP-palmitate (C16). |
| 图选项 |
2.4 重组过水解酶的酶学特性研究2.4.1 pH对重组过水解酶的催化活性和稳定性的影响重组Per822氯化MCD的最适pH为4.5，偏离该pH，活性迅速下降，在pH 6.5及以上活性几乎归零。此外，酶在pH 3.5–8.0范围内活性稳定，处理2 h后残余酶活仍在68%以上(图 4)。可以看出Per822催化MCD氯化时是一种酸性酶，对各pH都稳定，耐pH变化。
 |
| 图 4 pH对Per822活性和稳定性的影响 Fig. 4 Effect of pH on activity and stability of Per822 using MCD as substrate. |
| 图选项 |
2.4.2 温度对重组过水解酶的催化活性和稳定性的影响以MCD为底物，重组Per822的最适氯化反应温度为55 ℃，45–55 ℃之间保持较高活性(80%以上)。在70 ℃以下处理2 h余70%以上活性，80 ℃处理2 h仍剩余酶活58% (图 5)。可见该酶是一个耐热的过水解酶。
 |
| 图 5 温度对Per822活性和稳定性的影响 Fig. 5 Effect of temperature on activity and stability of Per822 using MCD as substrate. |
| 图选项 |
2.4.3 过水解酶的动力学参数以MCD为底物，Per822进行氯化反应的Km和kcat值分别为6.088 mmol/L和2.646 s?1，催化效率(kcat/Km)为0.432 L/(s·mmol)。
2.4.4 金属离子对酶活的影响使用不同金属离子处理过水解酶，以MCD为底物低浓度(1 mmol/L)的Cu2+、Mn2+、Fe2+、K+和NH4+对氯化有激活作用；10 mmol/L时仅有Ca2+和Fe2+对MCD的氯化起激活作用，其他离子起抑制作用；Fe2+在100 mmol/L时仍能促进酶的活性(图 6)。虽然Per822氯化MCD的活性不依赖于Fe2+的存在，但Fe2+可以提高酶活到原来的8.3倍，可见Per822是一个Fe2+激活的新过水解酶。
 |
| 图 6 金属离子对Per822过水解活性影响 Fig. 6 Effect of metal ions on perhydrolysis of Per822 using MCD as substrate. |
| 图选项 |
2.5 过乙酸生产能力检测2.5.1 共底物的影响分别使用PGD、EA和NaAC为共底物检测Per822产PAA的能力，结果显示EA为最适的底物，产PAA最适pH为4.5；NaAC产PAA能力相对较弱，在pH 7.1的磷酸钾缓冲液中酶活性低到难以检测(表 1)。
表 1 共底物和缓冲液对生产过乙酸的影响Table 1 Effect of co-substrates and buffer on PAA generation
| Substrate | Total PAA generated (mmol/L) | |
| pH 7.1 | pH 4.5 | |
| PGD | 16.456±0.349 | 12.326±0.202 |
| EA | 59.209±1.299 | 70.696±0.915 |
| NaAC | 1.247±0.352 | 15.215±1.058 |
| PGD: propylene glycol diacetate; EA: ethyl acetate; NaAC, sodium acetate. | ||
表选项
2.5.2 高浓度底物和酶量对PAA生产的影响最适PAA生产条件是以1 mol/L的EA和1 mol/L的H2O2为底物，加入2.0 μg/mL的Per822，反应60 min，此时能产生98.83 mmol/L的PAA。在酶量相同的情况下，1 mol/L的EA产PAA量略高于0.5 mol/L的EA，底物浓度相同时高酶量(10 μg/mL)并不能产生更高浓度的PAA。1 mol/L的EA和1 mol/L的H2O2为底物，加入10 μg/mL的Per822反应速度最快，40 min即可达到反应平衡，产生96.80 mmol/L的PAA，而其他几个反应需要1 h才达到最大PAA生产量，此后PAA浓度会降低(图 7)，可能是被Per822水解所致。
 |
| 图 7 底物浓度和酶量对生成过乙酸的影响 Fig. 7 Effect of substrate and enzyme on PAA production. |
| 图选项 |
2.5.3 Per822对PAA的耐受性Per822对PAA具有较高的耐受性，体系内含初始浓度不超过25 mmol/L PAA冰上处理不同时间后，反应主要往正方向进行，以生成PAA为主。加入25 mmol/L PAA时冰上放置1.5 h，反应40 min新生成PAA能力达未处理酶的88.15%，处理2 h反应后新生成PAA仍达未处理酶的79.33%。Per822经PAA初始浓度50 mmol/L处理后在反应的前20 min基本测不到新PAA生成，40 min以后有微量的PAA开始生成(图 8)。高浓度的PAA会使反应往逆方向进行，主要发生PAA的水解反应，水解过乙酸生成乙酸和H2O2。
 |
| 图 8 Per822对PAA的耐受性 Fig. 8 The tolerance of Per822 to PAA. |
| 图选项 |
3 讨论一种酶能够催化多种不同类型反应的现象称为酶催化的多功能性(Catalytic promiscuity)，这种性能拓宽了酶的应用范围[33]。过水解酶是具有催化多功能性的一个典型例子，在生物催化和工业上有着极其重要的用途[6, 10]。在过水解酶催化的众多反应中卤代反应是一类非常重要的反应，它在生成C-C键、改变功能基团时用于制备中间体。氯化反应是合成化学中的重要工具，在有机合成、无机合成和采矿业都有着重要用途，但氯化反应难控制、毒副产物多、有爆炸危险[34]，酶法进行氯化反应是一种环境友好的替代方案。目前分离出的过水解酶以MCD为底物时大都只有溴代功能，氯化能力差。本实验以富含氯的造纸厂污泥为材料构建宏基因组文库，筛选出了一个能够氯化MCD的过水解酶Per822。Bongs和van Pée报道来源于吡咯菌素假单胞菌Pseudomonas pyrrocinia和金色链霉菌Streptomyces aureofaciens的无辅基氯过氧化物酶(过水解酶)以MCD为底物溴化活性分别是氯化活性的1 500倍和2 000倍[35]，而Per822溴化活性是氯化活性的2倍，和来源于海洋真菌Caldariomyces fumago的氯过氧化物酶溴化氯化能力比相当[36]。Per822溴化MCD活性为7.45 U/mg，和已报道的文献相比仅低于来自恶臭假单胞菌Pseudomonas putida IF-3的溴过氧化物酶-酯酶(11.7 U/mg)[22]，说明Per822是一种高酶活且氯化能力大大增强的过水解酶。包括来自链霉菌Streptomyces grisetcs Tit6和吡咯菌素假单胞菌P. pyrrocinia在内的多种过水解酶都不具有过氧化物酶和过氧化氢酶活性[20, 24, 37-38]。Per822却具有过氧化物酶活性，且该活性不依赖溴离子和碘离子的存在，Per822相比其他的过水解酶具有较强的氧化性，有在合成化学中应用的前景。
Per822同酯酶(脂肪酶)也有较高同源性，推测其可能具有酯酶(脂肪酶)活性。从实验结果看重组Per822能够水解碳链长度为2–16的对硝基苯酯(C2–C16)系列底物，而来源于S. aureofaciens的BPO-A2对短链脂肪酸比如硝基苯乙酯(C2)有着非选择性的酯酶活性[39]，来自红平红球菌Rhodococcus erythropolis的过水解酶ThcF除特异性水解乙酰基硫醇异丁酸甲酯外只对C4以下的对硝基苯酯有活性[23]。虽然过水解和酯水解活性中心都是Ser-Asp-His催化三体，但反应的最适pH并不同，Per822过水解反应(氯代)的最适pH为4.5，pH > 6.5活性几乎归零；酯水解反应在pH > 7.0时才能检测到，最适的反应pH为8.5。de Mot等报道ThcF也存在过水解和酯类水解反应pH差别较大的现象[23]。Bugg推测出现这种差异的原因是过水解酶活性中心的His在pH 5.5左右发生了质子化，不能作为碱参与酯水解反应[40]。
生产过乙酸的能力是评价过水解酶工业应用潜力的重要依据。2.0 μg/mL重组Per822在20 min内能产生70.696 mmol/L的过乙酸，酶量不变，提高EA和双氧水浓度并延长反应时间能够生成更高浓度的PAA。Dinu报道过水解酶S54V (AcT)结合到纳米膜载量0.01 wt%时20 min内可产生11 mmol/L的PAA[41]；Grover等报道过水解酶AcT以PGD为共底物时能产生30 mmol/L的PAA[18]；Yin等报道荧光假单胞菌酯酶(Pseudomonas fluorescens esterase, PFE)突变体Phe162Leu PFE浓度0.5 mg/mL时在10 min内可以产生115 mmol/L PAA[16]；相比其他过水解酶，Per822有着更强的产生过乙酸能力，且对PAA有较高的耐受性。共底物检测发现Per822生产PAA的最适底物为EA，而Grover等报道的AcT的最适底物为PGD，以EA为底物产量低到难以检测[18]。在生产过乙酸时，目前报道的PAA生产都是以pH 7.1的磷酸钾为缓冲液，本实验却发现以EA和NaAC为底物时Per822生产过乙酸的最适pH为4.5，以PGD为底物时在pH 7.1的磷酸钾活性缓冲液中反应活性略高于柠檬酸-磷酸缓冲液(pH 4.5)，说明Per822和AcT、Phe162Leu PFE明显属于不同的过水解酶。过水解酶不含有金属离子，其活性不依赖于金属离子的存在。目前仅有Kawanami等报道了一个由Co2+激活的多功能溴过氧化物酶-酯酶(过水解酶)[22]，其他金属离子激活过水解酶尚未见报道。Per822的过水解活性能被Fe2+激活，可见Per822是一个新的过水解酶。
重组Per822在大肠杆菌中的过量可溶性表达、氯化能力增强、强的氧化能力、不依赖Br?和I?的过氧化物酶活性、广谱的酯酶活性使得Per822在氯化、洗涤、废水处理、杀菌、生物质预处理、生产环氧衍生物等方面有着广阔的应用前景。
参考文献
| [1] | Song JK, Ahn HJ, Kim HS, et al. Molecular cloning and expression of perhydrolase genes from Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia in Escherichia coli. Biotechnol Lett, 2006, 28(12): 849-856. DOI:10.1007/s10529-006-9016-8 |
| [2] | Yin DL, Kazlauskas RJ. Revised molecular basis of the promiscuous carboxylic acid perhydrolase activity in serine hydrolases. Chem Eur J, 2012, 18(26): 8130-8139. DOI:10.1002/chem.201200052 |
| [3] | Chávez G, Rasmussen JA, Janssen M, et al. Baeyer-Villiger oxidation of cyclohexanone in aqueous medium with in situ generation of peracid catalyzed by perhydrolase CLEA. Top Catal, 2014, 57(5): 349-355. DOI:10.1007/s11244-013-0190-3 |
| [4] | China H, Okada Y, Ogino H. Production mechanism of active species on the oxidative bromination following perhydrolase activity. J Phys Org Chem, 2016, 29(2): 84-91. DOI:10.1002/poc.3490 |
| [5] | Li C, Hassler M, Bugg TDH. Catalytic promiscuity in the α/β-hydrolase superfamily:hydroxamic acid formation, C-C bond formation, ester and thioester hydrolysis in the C-C hydrolase family. ChemBioChem, 2008, 9(1): 71-76. DOI:10.1002/cbic.200700428 |
| [6] | Lee W, Vojcic L, Despotovic D, et al. Rationalizing perhydrolase activity of aryl-esterase and subtilisin Carlsberg mutants by molecular dynamics simulations of the second tetrahedral intermediate state. Theor Chem Acc, 2010, 125(3/6): 375-386. |
| [7] | Honda K, Kataoka M, Sakuradani E, et al. Role of Acinetobacter calcoaceticus 3, 4-dihydrocoumarin hydrolase in oxidative stress defence against peroxoacids. Eur J Biochem, 2003, 270(3): 486-494. DOI:10.1046/j.1432-1033.2003.03407.x |
| [8] | Picard M, Gross J, Lübbert E, et al. Metal-free bacterial haloperoxidases as unusual hydrolases:activation of H2O2 by the formation of peracetic acid. Angew Chem Int Ed Engl, 1997, 36(11): 1196-1199. DOI:10.1002/anie.199711961 |
| [9] | Preobrazhenskaya YV, Voskoboev AI, Burd VN. Phosphatase activity of non-heme chloroperoxidase from the bacterium Serratia marcescens. FEBS Lett, 2003, 536(1/3): 41-44. |
| [10] | Carboni-Oerlemans C, De María PD, Tuin B, et al. Hydrolase-catalysed synthesis of peroxycarboxylic acids:Biocatalytic promiscuity for practical applications. J Biotechnol, 2006, 126(2): 140-151. DOI:10.1016/j.jbiotec.2006.04.008 |
| [11] | Despotovic D, Vojcic L, Prodanovic R, et al. Fluorescent assay for directed evolution of perhydrolases. J Biomol Screen, 2012, 17(6): 796-805. DOI:10.1177/1087057112438464 |
| [12] | Hickman WS. Peracetic acid and its use in fibre bleaching. Rev Prog Color, 2002, 32(1): 13-27. DOI:10.1111/j.1478-4408.2002.tb00247.x |
| [13] | Wu HL, Shu ZY, Lin H, et al. Decolorization of remazol brilliant blue KN-R by the in-situ enzymatically generated peracetic acid. Acta Sci Circumst, 2015, 35(8): 2400-2406 (in Chinese). 武海龙, 舒正玉, 林红, 等. 酶法原位制备过氧乙酸对活性艳蓝KN-R氧化脱色的工艺. 环境科学学报, 2015, 35(8): 2400-2406. |
| [14] | Shu ZY, Wu HL, Lin H, et al. Decolorization of remazol brilliant blue R using a novel acyltransferase-ISCO (in situ chemical oxidation) coupled system. Biochem Eng J, 2016, 115: 56-63. DOI:10.1016/j.bej.2016.08.008 |
| [15] | Kitis M. Disinfection of wastewater with peracetic acid:a review. Environ Int, 2004, 30(1): 47-55. DOI:10.1016/S0160-4120(03)00147-8 |
| [16] | Yin DL, Jing Q, AlDajani WW, et al. Improved pretreatment of lignocellulosic biomass using enzymatically-generated peracetic acid. Bioresour Technol, 2011, 102(8): 5183-5192. DOI:10.1016/j.biortech.2011.01.079 |
| [17] | Zhao XB, Wu RC, Liu DH. Production of Pulp, Ethanol and lignin from sugarcane bagasse by alkali-peracetic acid delignification. Biomass Bioenergy, 2011, 35(7): 2874-2882. DOI:10.1016/j.biombioe.2011.03.033 |
| [18] | Grover N, Douaisi MP, Borkar IV, et al. Perhydrolase-nanotube paint composites with sporicidal and antiviral activity. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(19): 8813-8821. DOI:10.1007/s00253-012-4573-3 |
| [19] | Wu XM, Li M. Production and application research progress on peracetic acid. Fine Specialty Chem, 2017, 25(4): 25-28 (in Chinese). 伍小明, 李明. 过氧乙酸的生产和应用研究进展. 精细与专用化学品, 2017, 25(4): 25-28. |
| [20] | Weng M, Pfeifer O, Krauss S, et al. Purification, characterization and comparison of two non-haem bromoperoxidases from Streptomyces aureofaciens ATCC 10762. J Gen Microbiol, 1991, 137(11): 2539-2546. DOI:10.1099/00221287-137-11-2539 |
| [21] | Cheeseman JD, Tocilj A, Park S, et al. Structure of an aryl esterase from Pseudomonas fluorescens.Acta Crystallogr Sect. D Biol Crystallogr, 2004, 60(7): 1237-1243. DOI:10.1107/S0907444904010522 |
| [22] | Kawanami T, Miyakoshi M, Dairi T, et al. Reaction mechanism of the Co2+-activated multifunctional bromoperoxidase-esterase from Pseudomonas putida IF-3. Arch Biochem Biophys, 2002, 398(1): 94-100. DOI:10.1006/abbi.2001.2702 |
| [23] | de Mot R, de Schrijver A, Schoofs G, et al. The thiocarbamate-inducible Rhodococcus enzyme ThcF as a member of the family of α/β hydrolases with haloperoxidative side activity. FEMS Microbiol Lett, 2003, 224(2): 197-203. DOI:10.1016/S0378-1097(03)00452-X |
| [24] | Burd VN, Bantleon R, van Pée KH. Oxidation of indole and indole derivatives catalyzed by nonheme chloroperoxidases. Appl Biochem Micro, 2001, 37(3): 248-250. DOI:10.1023/A:1010220916145 |
| [25] | Jia ML, Zhong XL, Lin ZW, et al. Expression and characterization of an esterase belonging to a new family via isolation from a metagenomic library of paper mill sludge. Int J Biol Macromol, 2019, 126: 1192-1200. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2019.01.025 |
| [26] | Dai ZM, Guo X, Yin HQ, et al. Identification of nitrogen-fixing genes and gene clusters from metagenomic library of acid mine drainage. PLoS ONE, 2014, 9(2): e87976. DOI:10.1371/journal.pone.0087976 |
| [27] | Silva CC, Hayden H, Sawbridge T, et al. Identification of genes and pathways related to phenol degradation in metagenomic libraries from petroleum refinery wastewater. PLoS ONE, 2013, 8(4): e61811. DOI:10.1371/journal.pone.0061811 |
| [28] | Song YH, Lee KT, Baek JY, et al. Isolation and characterization of a novel endo-β-1, 4-glucanase from a metagenomic library of the black-goat rumen. Braz J Microbiol, 2017, 48(4): 801-808. DOI:10.1016/j.bjm.2017.03.006 |
| [29] | Vester JK, Glaring MA, Stougaard P. An exceptionally cold-adapted alpha-amylase from a metagenomic library of a cold and alkaline environment. Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 99(2): 717-727. DOI:10.1007/s00253-014-5931-0 |
| [30] | Dong BX, Xia M, Cai XQ, et al. Molecular cloning and enzyme characterization of a metagenome derived bacterial laccase with Mn2+ tolerance and thermostability. Microbiol China, 2018, 45(6): 1190-1199 (in Chinese). 董冰雪, 夏敏, 蔡心清, 等. 宏基因组来源耐Mn2+、热稳定细菌漆酶的分子克隆及酶学特性. 微生物学通报, 2018, 45(6): 1190-1199. |
| [31] | Lee CW, Kwon S, Park SH, et al. Crystal structure and functional characterization of an esterase (EaEST) from Exiguobacterium antarcticum. PLoS ONE, 2017, 12(1): e0169540. DOI:10.1371/journal.pone.0169540 |
| [32] | Rai GP, Zong Q, Hager LP. Isolation of directed evolution mutants of chloroperoxidase resistant to suicide inactivation by primary olefins. Isr J Chem, 2000, 40(1): 63-70. DOI:10.1560/264G-UH9K-MEYU-9YHY |
| [33] | Bornscheuer UT, Kazlauskas RJ. Catalytic promiscuity in biocatalysis:using old enzymes to form new bonds and follow new pathways. Angew Chem Int Ed, 2004, 43(45): 6032-6040. DOI:10.1002/anie.200460416 |
| [34] | He HB, Yao RS, Deng SS. Organic chlorination reaction and its control. Fine Chem Termed, 2006, 36(2): 11-13 (in Chinese). 何洪波, 姚日生, 邓胜松. 有机氯化反应及其控制. 精细化工中间体, 2006, 36(2): 11-13. DOI:10.3969/j.issn.1009-9212.2006.02.004 |
| [35] | Bongs G, van Pée KH. Enzymatic chlorination using bacterial nonheme haloperoxidases. Enzyme Microb Technol, 1994, 16(1): 53-60. DOI:10.1016/0141-0229(94)90109-0 |
| [36] | Hager LP, Morris DR, Brown FS, et al. Chloroperoxidase.Ⅱ.Utilization of halogen anions. J Biol Chem, 1966, 241(8): 1769-1777. |
| [37] | Zeiner R, van Pée KH, Lingens F. Purification and partial characterization of multiple bromoperoxidases from Streptomyces griseus. J Gen Microbiol, 1988, 134(12): 3141-3149. DOI:10.1099/00221287-134-12-3141 |
| [38] | Wiesner W, van Pée KH, Lingens F. Purification and characterization of a novel bacterial Non-heme chloroperoxidase from Pseudomonas pyrrocini. J Biol Chem, 1988, 263(27): 13725-13732. DOI:10.1016/0378-1119(90)90414-M |
| [39] | Chen B, Cai Z, Wu W, et al. Morphing activity between structurally similar enzymes:from heme-free bromoperoxidase to lipase. Biochemistry, 2009, 48(48): 11496-11504. DOI:10.1021/bi9014727 |
| [40] | Bugg TDH. Diverse catalytic activities in the αβ-hydrolase family of enzymes:activation of H2O, HCN, H2O2, and O2. Bioorg Chem, 2004, 32(5): 367-375. DOI:10.1016/j.bioorg.2004.05.005 |
| [41] | Dinu CZ, Zhu GY, Bale SS, et al. Enzyme-based nanoscale composites for use as active decontamination surfaces. Adv Funct Mater, 2010, 20(3): 392-398. DOI:10.1002/adfm.200901388 |
