1. 青岛农业大学 园艺学院, 山东 青岛 266109;
2. 黑龙江护理高等专科学校, 黑龙江 哈尔滨 150086;
3. 德州市农业科学研究院, 山东 德州 253015;
4. 东北林业大学 生命科学学院, 黑龙江 哈尔滨 150040
收稿日期：2020-07-11；接收日期：2020-10-08；网络出版时间：2020-10-14
基金项目：山东省现代农业(蔬菜)产业技术体系项目(No. SDAIT-04-03)，山东省良种工程项目(No. 662-2316109)，中央高校基本科研业务费专项资金(Nos. 2572014EA03，2572020DY15)，黑龙江省自然科学基金(No. C2018002)资助
摘要：E类MADS-box基因SEPALLATA (SEP)-like在被子植物生殖生长特别是花器官发育方面具有重要作用。为分析羽衣甘蓝E功能MADS-box基因SEP-like基因的序列特征及其在花发育过程中的时空表达模式，以羽衣甘蓝品系‘14 line’为试材，利用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术克隆了SEP直系同源基因BroaSEP1/2/3 (GenBank登录号：KC967957、KC967958、KC967960)。序列和系统进化树分析表明，这3个基因分别与野甘蓝(Brassica oleracea var. oleracea)、芜菁Brassica rapa、萝卜Raphanus sativus、甘蓝型油菜Brassica napus的SEP1、SEP2、SEP3基因具有很高的同源性。推导的氨基酸序列显示，这些基因编码的蛋白质都包含高度保守的MADS结构域、I结构域和K结构域，每一基因都有其亚家族特异的C-末端功能域SEPⅠ和SEPⅡ基序。BroaSEP1、BroaSEP2、BroaSEP3基因的开放阅读框长度分别为801 bp、759 bp、753 bp，分别编码266、252、250个氨基酸残基。半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR研究结果表明，BroaSEP1、BroaSEP2、BroaSEP3在发育的花芽中特异性表达，但是表达水平在不同发育时期以及野生型、多瓣型和少瓣型花芽中存在明显差异。
关键词：羽衣甘蓝花发育E类MADS-box基因BroaSEP1/2/3基因
Phylogenetic and expression analysis of SEPALLATA-like gene in Brassica oleracea L. var. acephala
Yuanping Xiang1, Yuntong Huang2, Hongjun He3, Qijiang Xu3,4
1. College of Horticulture, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong, China;
2. Heilongjiang Nursing College, Harbin 150086, Heilongjiang, China;
3. Dezhou Academy of Agricultural Sciences, Dezhou 253015, Shandong, China;
4. The College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, Heilongjiang, China
Received: July 11, 2020; Accepted: October 8, 2020; Published: October 14, 2020
Supported by: Modern Agricultural Industrial Technology System Funding of Shandong Province, China (No. SDAIT-04-03), Agricultural Variety Improvement Project of Shandong Province, China (No. 662-2316109), The Fundamental Research Funds for the Central Universities (Nos. 2572014EA03, 2572020DY15), Natural Science Foundation of Heilongjiang Province, China (No. C2018002)
Corresponding author: Qijiang Xu. Tel: +86-451-82191783; E-mail: qijiangxu@nefu.edu.cn.
Abstract: The E class MADS-box genes SEPALLATA (SEP)-like play critical roles in angiosperm reproductive growth, especially in floral organ differentiation. To analyze the sequence characteristics and spatio-temporal expression patterns of E-function MADS-box SEP-like genes during kale (Brassica oleracea L. var. acephala) flower development, BroaSEP1/2/3 (GenBank No. KC967957, KC967958, KC967960) homologues, three kale SEP MADS-box gene, were isolated from the kale variety 'Fourteen Line' using Rapid amplification of cDNA ends (RACE). Sequence and phylogenetic analysis indicated that these three SEP genes had a high degree of identity with SEP1, SEP2, SEP3 from Brassica oleracea var. oleracea, Brassica rapa, Raphanus sativus and Brassica napus, respectively. Alignment of the predicted amino acid sequences from these genes, along with previously published subfamily members, demonstrated that these genes comprise four regions of the typical MIKC-type MADS-box proteins: the MADS domain, intervening (I) domain and keratin-like (K) domain, and the C-terminal domain SEPⅠ and SEPⅡ motif. The longest open reading frame deduced from the cDNA sequences of BroaSEP1, BroaSEP2, and BroaSEP3 appeared to be 801 bp, 759 bp, 753 bp in length, respectively, which encoded proteins of 266, 252, and 250 amino acids respectively. Expression analyses using semi-quantitative RT-PCR and quantitative real-time PCR indicate that BroaSEP1/2/3 are specifically expressed in floral buds of kale during flower development process. The expression levels of the three genes are very different at different developmental stages, also in wild type, mutant flower with increased petals, and mutant flower with decreased petals. These different patterns of gene expression maybe cause the flowers to increase or decrease the petal number.
Keywords: kale (Brassica oleracea var. acephala)flower developmentE-class MADS-box genesBroaSEP1/2/3 gene
关键调控基因的复增及其功能趋异是生物形态多样性产生和进化的重要途径[1-2]。作为被子植物特有的创新性状和重要的生殖器官，决定花器官发育的MADS-box基因其数目与功能的改变是花形态多样性的基础[3-6]。例如拟南芥A类基因APETALA1 (AP1)和APETALA2 (AP2)[7-8]、B类基因APETALA3 (AP3)和PISTILLATA (PI)[9-11]、C类基因AGAMOUS (AG)[12]、D类基因SEEDSTICK (STK)[13-15]、E类基因SEPALLATA1/2/3/4 (SEP1/2/3/4)[16-18]。这些编码调控花发育关键转录因子的MADS-box基因经历了大量基因复增事件，通过编码序列和(或)表达区域的改变而发生亚功能化和新功能化，进而导致被子植物花形态结构的多样性[1-2, 19]。花器官发育的ABCE理论模型阐释了4类花器官同源异型基因(A、B、C和E)决定各花器官特征属性的分子机制[20-27]。A+E功能基因控制萼片发育；A+B+E功能基因控制花瓣发育；B+C+E功能基因控制雄蕊发育；C+E功能基因控制雌蕊发育。除A类基因AP2属于APETALA2/EREBP基因家族外，所有的A、B、C、E基因均属于MADS-box转录因子基因家族，以高度有序的MADS蛋白质复合体形式[28]结合在CArG序列[一致性序列：5′-CC(A/T)6GG-3′]上而激活靶基因的表达，如FD[15]、UNUSUAL FLORAL ORGANSCRABS CLAW[29]。
SEP MADS-box基因不仅调控花分生组织的确定性，而且与A、B和C类MADS-box基因共同决定花器官特征属性[18, 30-31]，在被子植物花起源和发育中发挥关键作用[32-34]。在现存被子植物多样性产生之前，发生第二次基因复增事件，SEP亚家族产生LOSEP和SEP3进化系。随后，SEP亚家族在有花植物中经历多次独立的物种特异性基因复增[35-39]。在双子叶植物类群中，LOFSEP进化系经历2次复增产生3类进化支：AGL3 (包括AtSEP4)、FLORAL BINDING PROTEIN9/23 (FBP9/23)和AGL2/4 (包括AtSEP1和AtSEP2)。在单子叶植物类群中同样经历2次复增而分别产生OsMADS34 (PAP2)进化支和LEAFY HULL STERILE1 (LHS1)/OsMADS1与OsMADS5进化支。与LOFSEP进化系相比较，SEP3 (AGL9)基因进化系所经历的复增事件较少，基因拷贝数少。目前，仅从双子叶植物中鉴定出了单一的SEP3拷贝。在禾本科植物中，SEP3进化系发生1次基因复增事件而形成OsMADS7和OsMADS8进化枝[32-33]。SEP同源基因间存在功能冗余现象。在花发育阶段2，拟南芥SEP1/2/4基因在整个花分生组织中表达，而SEP3仅在花原基起始前于形成内三轮花器官的区域内表达[13, 18, 40-41]。随着花原基的发育，SEP1/2在所有的花器官原基中表达，SEP3在内三轮花器官原基内表达，而SEP4在萼片中的表达明显降低。sep1/2/3/4突变体的所有花器官转变为叶状器官，表明SEP基因在促进花分生组织确定性和决定花器官特征属性的功能上具有冗余性[18]。已从多种模式植物中分离鉴定出了E类基因，例如金鱼草Antirrhinum majus的DEFH49/72/200基因、番茄Lycopersicon esculentum的TM5/29基因、白麦瓶草Silene latifolia的SlSEP1/SlSEP3基因等。
羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala)花的形态结构与拟南芥的相同，四轮花器官由外向内分别为4枚萼片、4枚花瓣、6枚雄蕊、1枚雌蕊。但是，在同一品系群体内也存在花瓣数目减少及增多的纯合突变体(图 1)。为分析SEP-like基因在羽衣甘蓝花发育中的作用及其与花瓣数目突变体表型的关系，本研究利用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术克隆调控羽衣甘蓝花发育的E类MADS-box基因，在利用生物信息学方法分析该类基因的序列结构特征及其系统发育的基础上，基于半定量RT-PCR和qRT-PCR对该类基因在羽衣甘蓝花发育不同时期的表达水平，以期为利用E类MADS-box进行羽衣甘蓝花型的遗传改良(包括增加花型多样性特别是多瓣花)、提高观赏价值奠定前期研究基础。
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| 图 1 羽衣甘蓝野生型及突变型花 Fig. 1 Kale wild-type and mutant flowers.(A) Wild-type flower. (B) Mutant flower with increased petals number. (C) Mutant flower with decreased petals number. |
| 图选项 |
1 材料与方法1.1 试验材料羽衣甘蓝自交系‘14 Line’ (花瓣数目正常，4枚)、在‘14 Line’群体中出现多瓣(8枚以上)突变体、少瓣(0–3枚)突变体(图 1)，进一步单株自交2代，突变性状稳定。由东北林业大学生命科学学院花卉生物工程研究所提供。野生型和两种突变体的遗传背景相同。2016年6月中旬将羽衣甘蓝种植于温室内，常规栽培管理，第2年2月中旬开始现蕾。采集5个时期的花蕾(花) (F1、F2、F3、F4、F5) (图 2)，同时采集开花期植株的根、茎、叶，用铝箔纸包裹后立即液氮速冻，保存于?80 ℃冰箱，用于提取总RNA。
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| 图 2 羽衣甘蓝花发育的5个时期 Fig. 2 Five developmental stages of kale flower. |
| 图选项 |
1.2 RNA提取与cDNA合成Trizol法(Cat. No. 15596018，Thermo Fisher Scientific)提取野生型花蕾的总RNA，NanoDrop1000微量紫外分光光度计与甲醛琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA的浓度和质量。利用TransScript?第一链cDNA试剂盒(Cat. No. AT301-02，北京全式金生物技术有限公司)进行反转录合成第一链cDNA。在20 μL反应体系中加入5 μg总RNA、1.0 μg引物P18E (5′-GACTCGAGTGCACATCG(T)17-3′) (表 1)、10 μL 2×TS反应混合液、1 μL SuperScript? RT/RI酶混合液。充分混匀后于42 ℃条件下温育30 min，然后80 ℃温育5 s终止反应。反应结束后加入1 μL RNase H (2 U/μL)，37 ℃温育20 min，降解可能存在的RNA。
表 1 羽衣甘蓝BroaSEP基因克隆及表达分析所用引物Table 1 List of primers used for cloning and expression analysis of BroaSEP from kale
| No. | Primer name | Sequence (5′–3′) |
| 1 | P19E | GACTCGAGTGCACATCG(T)17 |
| 2 | P18E | GACTCGAGTGCACATCG |
| 3 | BroaSEP gene specific primer for 3′-RACE | GTTCTT(C/A)TGT(C)GATGCT(A)GAGGT |
| 4 | BroaSEP1 GSP (gene specific primer)1 | CCCTCATATCTACCCTTGAGC |
| 5 | BroaSEP1 GSP2 | GAGCTTGCCACGGTTGGAGA |
| 6 | BroaSEP2 GSP1 | CTCGAGTTCTTTGGCAGGTTTG |
| 7 | BroaSEP2 GSP2 | TCTTGAGCATGTTGGAGGTGCT |
| 8 | BroaSEP3 GSP1 | GTCCGGAGAGCTCTGATATGC |
| 9 | BroaSEP3 GSP2 | CATCTGATACCCATCAGCTAACC |
| 10 | Oligo(dT)17 anchor primer | GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)17 |
| 11 | Adaptor primer | GGCCACGCGTCGACTAGTAC |
| 12 | BroaSEP1-F | GGGCATATCTCCTTCTCAAGAC |
| 13 | BroaSEP1-R | CTGGAGATCCTCAGGAC |
| 14 | BroaSEP2-F | CCCTACTACAATCAAATCAA |
| 15 | BroaSEP2-R | GGCTATGACAGTTATAGCC |
| 16 | BroaSEP3-F | AAAGGATTCACAACGGGAGAG |
| 17 | BroaSEP3-R | GCACACGAGACAGAGTATAG |
| 18 | BroaSEP1-RT-F | CAGAGCAGATAACTGCAACAAC |
| 19 | BroaSEP1-RT-R | GCGAGATTGATCACAGCATTAG |
| 20 | BroaSEP2-RT-F | AGTCATCCCAACCAGGAAA |
| 21 | BroaSEP2-RT-R | TCCTTATTGGGAGGGTAGAAGA |
| 22 | BroaSEP3-RT-F | GGTTACCGTATGACACCAACTC |
| 23 | BroaSEP3-RT-R | CGAGACAGAGTATAGAGAGAAGGG |
| 24 | Broa18S-RT-F | AGCCTGAGAAACGGCTAC |
| 25 | Broa18S-RT-R | CGAAGAGCCCGGTATTGTTATT |
表选项
1.3 羽衣甘蓝SEPALLATA -lik e基因的cDNA扩增根据SEPALLATA-like转录因子MADS区的保守氨基酸序列VLCDAEV设计正义兼并引物SEP-F (5′-GTTCTHTGYGATGCWGAGGT-3′)，以接头引物18E (5′-GACTCGAGTGCACATCG-3′)为反义引物、第一链cDNA为模板克隆SEP-like基因的3′-cDNA序列。50 μL反应体系中包含0.5 μL LA Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、5.0 μL 10×LA PCR Buffer Ⅱ、5.0 μL dNTPs (2 mmol/L)、1.0 μL SEP-F (20 μmol/L)、1.0 μL 18E (20 μmol/L)、2.0 μL cDNA。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火扩增30 s，72 ℃延伸90 s，25个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物利用EZNATM胶回收试剂盒(Cat. No. D2501-01，OMEGA)回收约950 bp的PCR产物，用pEASY?-T5 Zero Cloning Kit (Cat. No. CT501-02，北京全式金生物技术有限公司)进行PCR纯化产物的克隆，提取质粒(TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit，Cat. No. DP105，TIANGEN)，送北京六合华大基因科技有限公司测序。依据3′-cDNA序列设计SEP-like基因特异引物(表 1)，用5′/3′-RACE试剂盒(SMARTer? RACE 5′/3′ Kit，Cat. No. 634858，TaKaRa)，以SEP-like基因特异引物和oligo(dT)锚定引物通过巢式PCR克隆SEP-like基因5′-cDNA序列。PCR产物回收纯化、克隆、测序与3′-RACE实验操作程序一致。将5′-和3′-序列拼接全长cDNA序列，设计特异引物克隆SEP-like基因全长cDNA。
1.4 序列比对及系统进化树的构建为分析羽衣甘蓝E类SEP-like基因BroaSEP1/2/3的系统发育，在NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上对该cDNA序列进行核苷酸Blast分析。依据核苷酸酸序列推导出氨基酸序列，与已知的SEP蛋白利用GenDoc软件进行同源性比对，用MEGA7.0软件以邻近相连法(Neighbor joining，NJ)构建系统发育树，并进行Bootstrap检测。采用重复抽样分析系统发育树分支的置信度，重复抽样次数为1 000次，大于50%的bootstrap标注在树图上。
1.5 基于半定量RT-PCR和qRT-PCR的BroaSEP1/2/3基因表达分析提取F1、F2、F3、F4、F5花蕾的总RNA作为模板，利用Oligo(dT)17引物反转录合成第一链cDNA。再以第一链cDNA为模板进行基因特异性RT-PCR，以Broa18S rRNA基因作为内参。
在PE-9700型PCR仪上进行半定量RT-PCR，BroaSEP1/2/3与Broa18S rRNA基因特异引物BroaSEP1/2/3-RT-F、BroaSEP1/2/3-RT-R以及Broa18S-RT-F、Broa18S-RT-R见表 1。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环；72 ℃终延伸5 min。1.0%琼脂糖凝胶检测分析PCR扩增产物的质量和浓度。
以5个发育时期的羽衣甘蓝花蕾第一链cDNA为模板，利用SYBRTM Green PCR Master Mix试剂盒(Cat. No. 4344463，Thermo Fisher Scientific)配制PCR反应体系，7500 fast型实时荧光定量PCR仪进行qRT-PCR，分析BroaSEP1/2/3基因在野生型、多瓣突变体、少瓣突变体花发育不同时期的特异性表达模式。20 μL反应体系：10 μL稀释的第一链cDNA模板(2 ng cDNA)、浓度为10 μmol/L的正、反向引物各0.8 μL、SYBR? Green PCR Master Mix (2×) 10 μL。反应程序如下：95 ℃预变性2 min；随后40个扩增循环(95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s)。采用2–ΔΔCt法分析BroaSEP1/2/3基因在不同发育时期的相对表达水平。每个样品设置3个生物学重复。
2 结果与分析2.1 羽衣甘蓝E类MADS-box基因BroaSEP1/2/3克隆与序列结构分析以野生型F1至F5发育期的花蕾(花)构成混合样品池提取的总RNA (图 3A)经P19E反转录合成的第一链cDNA为模板，利用BroaSEP1/2/3基因3′-RACE特异引物和P18E接头引物分离羽衣甘蓝SEP-like基因的3′-端序列，3′-RACE扩增产物的长度约为950 bp (图 3B)。PCR产物回收、克隆、测序、比对，克隆得到了3条cDNA序列，长度分别为873 bp、974 bp和865 bp。核苷酸序列比对结果表明，分别与甘蓝型油菜Brassica napus、油菜Brassica rapa的SEPALLATA1-like (XM_013874090.2；XM_009133252.3)、SEPALLATA2- like (XM_013792022.2；XM_009119650.3)、SEPALLATA3-like (XM_022714754.1；XM_013839134.2)高度同源，序列相似性达97%–100%。其编码的氨基酸序列与芸薹属植物的SEP1/2/3蛋白高度同源。因此，将克隆获得的序列分别命名为BroaSEP1、BroaSEP2、BroaSEP3基因。
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| 图 3 羽衣甘蓝花芽BroaSEP1/2/3基因全长cDNA序列克隆电泳图 Fig. 3 Electrophoresis of amplified products of BroaSEP1/2/3 gene full-length cDNA sequence in floral buds of kale. |
| 图选项 |
混合花蕾(花)的总RNA经Oligo(dT)17锚定引物反转录合成第一链cDNA，用BroaSEP1、BroaSEP2、BroaSEP3基因特异引物和接头引物进行巢式5′-RACE扩增。PCR产物回收、克隆、测序，克隆获得了BroaSEP1、BroaSEP2、BroaSEP3基因的5′-cDNA序列，长度分别为312 bp、536 bp和580 bp。用DNAMAN软件分别将BroaSEP1/2/3基因3′和5′序列进行拼接，得到3个基因的全长cDNA序列(图 4)。最后用3个基因各自的特异引物(BroaSEP1-F/BroaSEP1-R、BroaSEP2-F/ BroaSEP2-R、BroaSEP3-F/BroaSEP3-R，表 1)扩增，确定了cDNA序列的准确性。BroaSEP1、BroaSEP2、BroaSEP3基因的GenBank登录号为分别为KC967957、KC967958、KC967960。利用NCBI的开放阅读框预测工具(Open reading frame finder)进行最大开放阅读框推测。结果表明，BroaSEP1的开放阅读框长801 bp，编码266个氨基酸，包含73个氨基酸残基的MADS结构域、27个氨基酸残基的I结构域、87个氨基酸残基的K结构域、79个氨基酸残基的C结构域(图 4)。理论等电点pI为9.05，分子量为30.6 kDa。BroaSEP2的开放阅读框长759 bp，编码252个氨基酸，包含57个氨基酸残基的MADS结构域、31个氨基酸残基的I结构域、87个氨基酸残基的K结构域、77个氨基酸残基的C结构域(图 4)。理论等电点pI为8.65，分子量为28.8 kDa。BroaSEP3的开放阅读框长753 bp，编码250个氨基酸，包含57个氨基酸残基的MADS结构域、31个氨基酸残基的I结构域、87个氨基酸残基的K结构域、75个氨基酸残基的C结构域(图 4)。理论等电点pI为7.68，分子量为28.9 kDa。
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| 图 4 羽衣甘蓝BroaSEP cDNA的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列 Fig. 4 Nucleotide and deduced amino acid sequences of BroaSEP cDNA from kale.MADS, I, K and C domains are underlined and defined by single, double, wave and dash line, respectively. The positions of the nucleotides and amino acids are shown on the left and the right, respectively. |
| 图选项 |
2.2 羽衣甘蓝BroaSEP1/2/3基因的同源性分析及系统发育分析多重氨基酸序列比对结果表明，BroaSEP1/2/3蛋白具有被子植物MADS-box蛋白质典型的MIKC结构[42-43] (图 3–4)。高度保守的M结构域大约由55–60个氨基酸残基构成[44]，包含保守的核定位序列[45]，在转录因子二聚体化及核定位的过程中发挥功能；位于M与K结构域之间的I (Intervening)结构域序列保守性较差，由25–30个氨基酸残基构成，主要参与二聚体的形成[46]；K (Keratin-like)结构域含有3个α-螺旋，主要作用是介导MADS转录因子形成二聚体和四聚体，参与花器官属性决定[47]；C末端结构(C-terminal domain)序列保守性差，但是也含有短序列保守基序(Motif)，具有靶基因转录激活作用或促进多聚蛋白复合体形成[43-44]。
羽衣甘蓝的BroaSEP1/2/3蛋白分别与甘蓝型油菜(Brassica napus)的SEP1 (XM_013874090.1)、SEP2 (XP_013647476.1)、SPE3 (XP_013647476.1)蛋白，野甘蓝(Brassica oleracea var. oleracea)[48]的SEP1 (XP_013625167.1)、SEP2 (XP_013639591)、SPE3 (XP_013638955.1)，萝卜(Raphanus sativus)的SEP1 (XP_018475126.1)、SEP2 (XP_01843724 2.1)、SPE3 (XP_018480838.1)，芜菁(Brassica rapa)的SEP1 (XP_009131500.1)、SEP2 (XP_009117898.1)高度同源，氨基酸序列的相似性大于96%，说明SEP-like基因在十字花科芸薹属植物中是高度保守的。
E类MADS-box基因家族可分为两个进化系LOFSEP (包括SEP1/2/4)和SEP3，每个进化系都具有高度保守的SEPⅠ和SEPⅡ基序[32-33, 49]。BroaSEP1/2/3蛋白的C末端区域具有保守的SEPⅠ和SEPⅡ基序(图 5)，证明克隆获得BroaSEP1/2/3基因属于B类MADS-box基因中的SEP进化系，C末端序列尽管保守性较差，然而，同属植物还是显示出较高的保守性。
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| 图 5 部分SEP-like蛋白质氨基酸序列比对 Fig. 5 Sequence alignment of amino acid sequences among several SEP-like proteins.SEP Ⅰ motif and SEPⅡ motif are boxed. M: MADS DNA-binding domain. I: intervening domain. K: keratin-like domain. C: C-terminal domain. |
| 图选项 |
为深入分析羽衣甘蓝BroaSEP1/2/3基因与其他被子植物E类MADS-box基因间的系统发育关系，利用MEGA7.0软件，以拟南芥Arabidopsis thaliana的AP1 (Z16421.1)、非洲菊Gerbera hybrida的GSQUA2 (CAX65661.1)、芜菁Brassica rapa的BrraAP1 (XP_009105460.1)等A类MADS-box基因为外部类群，从DDBJ/EMBL/ GenBank数据库中选取3个A类、9个AGL6类、75个SEP类MADS蛋白，对MIKC区氨基酸序列进行NJ (Neighbor-Joining)分析，构建系统发育树(图 6)。E功能MADS-box蛋白被划分为LOFSEP和SEP3进化系[32]，其中LOFSEP进化系又细分为SEP1/2、FBP9和SEP4 3个单元组[50]。同属物种的SEP同源蛋白具有较高的自展支持率。羽衣甘蓝BroaSEP1/2/3蛋白分别与甘蓝型油菜、野甘蓝、萝卜、芜菁的SEP蛋白聚为一支，分别属于SEP1/2和SEP3进化系。
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| 图 6 以邻位相连法构建的羽衣甘蓝E功能MADS-box蛋白系统发育树 Fig. 6 The phylogenetic tree of kale MADS-box proteins of class E generated using the Neighbor-joining method.The numbers next to the nods indicate bootstrap values of 50% or more support from 1 000 replicates. Three SEP genes in kale is showed by black triangles. |
| 图选项 |
2.3 BroaSEP1/2/3基因在羽衣甘蓝花发育不同时期的表达模式半定量RT-PCR和qRT-PCR分析BroaSEP1/2/3在野生型、多瓣型和少瓣型花发育的5个时期及营养器官根、茎、叶中的特异性表达(图 7)。结果表明，BroaSEP1/2/3基因在花发育的5个时期均有表达，但是表达水平在野生型、多瓣型和单瓣型花中存在差异。BroaSEP1基因在野生型花发育的前4个时期高丰度表达，而在花发育的第5时期则弱表达；在多瓣型花的整个发育过程均高丰度表达；在少瓣型花发育的第2、3时期弱表达。BroaSEP2基因在野生型花发育的1、4时期表达水平较高，在第5时期几乎无表达；在多瓣型花的整个发育过程均有表达，但第1时期弱表达；而在少瓣型花发育的第4时期表达水平最高，而在发育初期表达水平较低。BroaSEP3基因在所有类型花的发育过程中均高丰度表达，特别是在花发育的第1、2时期，相比较而言，在多瓣型花中的表达水平最高。但是这3个基因在根、茎中几乎无表达，在叶中微量表达，说明羽衣甘蓝SEP类是花发育特异性基因。
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| 图 7 羽衣甘蓝BroaSEP1/2/3基因半定量RT-PCR及qRT-PCR结果 Fig. 7 Quantification of expression levels of the BroaSEP1/2/3 gene in diferent developmental stages of kale flower as determined by gene-specific semi-quantitative RT-PCR and qRT-PCR. |
| 图选项 |
3 讨论3.1 羽衣甘蓝BroaSEP1/2和BroaSEP3基因分别属于E功能MADS-box基因家族中的LOSE P和SEP3进化系MADS-box转录因子在被子植物花发育过程中具有关键调控作用，而且在被子植物进化史中这种重要的同源功能是高度保守的。系统发育分析表明，调控花发育的E类MADS-box基因在被子植物进化过程中，发生了多次基因重复事件。第一次重复事件发生在现存被子植物起源之前，产生了SEP3 (以前命名为AGL9)和LOFSEP (以前命名为AGL2/3/4)进化系[32]；在基部核心真双子叶植物出现之前，LOFSEP进化系经历两次基因重复事件，产生SEP1/2、FBP9/23和SEP4进化系[51]。SEP1和SEP2则是通过最近的基因组复增而产生的[2]。这些旁系同源基因通过编码序列和(或)调控元件的变化而发生新功能化和亚功能化，引发花形态结构的多样性[2-3]。E类功能基因每个进化系编码的MADS蛋白在其C末端具有特异保守基序SEPⅠ和SEPⅡ基序(图 5)。SEP家族基因的数量、表达模式和功能因物种不同而有所差异，但其编码的蛋白质可以与其他MADS- box基因蛋白质形成复合体，与靶基因的CArG- box (CCArichGG，保守序列为5′-CC(A/T)6GG-3′)结合而调控靶基因表达[52-53]。
本研究分离鉴定的羽衣甘蓝BroaSEP1/2/3属于E类MADS-box基因，其中BroaSEP1/2属于SEP1/2亚家族、BroaSEP3属于SEP3亚家族。编码的氨基酸序列在MADS区具有保守的钙调蛋白依赖的蛋白激酶磷酸化位点RQVTF[49]，SEPⅠ和SEPⅡ位于C-末端区。BroaSEP1/2/3蛋白与被子植物其他E类MADS转录因子具有很高的相似性，其中与芸薹属植物E类MADS蛋白亲缘关系最近，特别是与野甘蓝、芜菁、萝卜、甘蓝型油菜E类MADS蛋白序列的同源性较高(96%以上)、亲缘关系最近(图 5–6)。研究结果证实羽衣甘蓝BroaSEP1/2、BroaSEP3基因分别是SEP1/2和SEP3的直系同源基因。
SEP类基因家族在被子植物中具有丰富的多样性，通过基因复制、可变剪辑而形成功能趋异、新功能、失功能、亚功能的旁系同源基因，羽衣甘蓝的SEP类基因是否存在旁系同源基因？还需通过花分化过程的特异组学的深入分析。
3.2 BroaSEP1/2/3基因在花发育期的特异性表达模式半定量和实时定量RT-PCR结果证实，BroaSEP1/2/3在野生型、多瓣型和少瓣型花中特异性表达。但是3个基因在不同发育时期的表达水平存在差异，BroaSEP1/2/3多瓣型花的5个发育时期表现为高表达，BroaSEP1/2在少瓣型花的2、3发育期表现为弱表达，可能与花瓣减少表型有关。BroaSEP1/2/3在花发育的初期均高水平表达，表明E类基因是花分生组织分化和花器官形成所必需的[54]。研究表明，拟南芥[55]、矮牵牛[56]、番茄[57]、水稻[58]的SEP类基因异位表达会引起早花，抑制SEP类基因如SEP1/2/3/4、FBP2/5和TM5/29，则产生多层萼片或叶状结构的花，花序分生组织处于无限生长模式。除了调控开花时间和花器官形成，SEP类基因如番茄的LeMADS-RIN 和TAGL2基因[57]、苹果的SEP1/2同源基因[59]在果实发育、烟草NsMADS3和NtMADS4[60]在营养生长等过程中发挥作用。拟南芥中的SEP1/SEP2/SEP4在花分生组织中起始表达，SEP3主要在内三轮花器官原基中表达。随着花原基的发育，SEP1/SEP2基因在四轮器官中均表达，SEP3仅在花瓣、雄蕊和雌蕊中表达，SEP4主要在萼片中表达[18]。与拟南芥SEP基因在调控花器官特征属性方面存在功能冗余[18]不同，蝴蝶兰Phalaenopsis amabilis的PeSEP3主要调控萼片和花瓣的形成[61]，唐松草属Thalictrum thalictroides的SEP基因主要调控心皮属性、器官边界以及萼片花瓣化[39]，非洲菊Gerbera hybrida的SEP1/2/4类基因GRCD1和GRCD2/7分别决定雄蕊和心皮的属性，而SEP1类基因GRCD4和SEP3类基因GRCD5在决定花瓣属性方面存在功能冗余[62]，E类基因还参与调控花分生组织属性[18, 62]。
本研究结果表明，羽衣甘蓝BroaSEP1/2/3在野生型、多瓣型、少瓣型花发育进程中的表达水平存在差异，具有花型特异性。这种表达差异性可能是由于基因表观突变或者基因启动子区突变造成的，需要进一步分析3种花型植株中这3个基因的DNA序列特别是启动子的表观修饰，同时还需要深入分析是否存在BroaSEP1/2/3的旁系同源基因以及在萼片、花瓣、雄蕊和心皮中特异性表达模式，并分析E类转录因子与其他MADS-box蛋白的互作关系。此外，也需要解析E类MADS转录因子调控的靶基因，以便综合阐释多瓣型、少瓣型花表型产生的分子基础。
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