首都师范大学 生命科学学院 植物基因资源与低碳环境生物技术北京市重点实验室，北京 100048
收稿日期：2020-03-10；接收日期：2020-06-11
基金项目：国家自然科学基金(Nos. 31571258, 31800244)资助
摘要：线性染色质经过多重折叠凝缩到真核生物的细胞核中，染色质的三维构象直接决定了真核生物的基因表达，因此染色质可以在局部或远程空间上发生互作调控基因转录。折叠成环状构象的染色质可以借助染色质构象捕获(Chromosome conformation capture，3C)技术来研究，基于3C技术扩展的4C/5C/Hi-C从单个位点延伸到全基因组捕捉三维构象，在此基础上，染色质构象核心技术可以与免疫共沉淀、核酸分子杂交、单细胞、基因组测序等技术偶联而产生新的衍生技术和应用，这极大地推动了染色质构象技术在基因时空特异性表达调控上的研究。文中将以3C和Hi-C等三维基因组核心技术为基础，重点介绍染色质构象捕获及其衍生技术的原理和前沿应用。
关键词：染色质构象捕获三维基因组高通量染色质构象捕获技术染色质免疫共沉淀配对末端标记测序技术分析染色质相互作用
Three-dimensional chromosome conformation capture and its derived technologies
Hao Tian*, Zijian Yang*, Xingwen Xu*, Liangyu Liu
Key Laboratory of Plant Gene Resources and Biotechnology for Carbon Reduction and Environmental Improvement, College of Life Sciences, Capital Normal University, Beijing 100048, China
Received: March 10, 2020; Accepted: June 11, 2020
Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31571258, 31800244)
Corresponding author: Liangyu Liu. Tel: +86-10-68901360; E-mail:liangyu.liu@cnu.edu.cn.
*These authors contributed equally to this study.
Abstract: Linear chromatin is compacted into eukaryotic nucleus through a complex and multi-layered architecture. Consequently, chromatin conformation in a local or long-distance manner is strongly correlated with gene expression. Chromosome conformation capture (3C) technology, together with its variants like 4C/5C/Hi-C, has been well developed to study chromatin looping and whole genome structure. In this review, we introduce new technologies including chromosome capture combined with immunoprecipitation, nuclei acid-based hybridization, single cell and genome sequencing, as well as their application.
Keywords: chromosome conformation capturethree-dimension genomehigh-throughput chromatin conformation capturechromatin immunoprecipitationchromatin interaction analysis by paired-end tag sequencing
人类基因组的线性DNA分子全长可达2 m，它经过各种形式的压缩、折叠、盘绕凝缩到直径约2 μm大小的细胞核中。生物体的组织细胞结构与其功能相适应，在分子层面上也是如此。在基因的转录调控中，除了反式作用因子的参与，染色质的三维构象(Three dimension，3D)也是一个非常重要的调控层次，即基因与远程调控元件之间形成的染色质空间结构会影响其基因表达和功能[1]。
早在2002年，Job Dekker等开发了基于DNA片段就近连接的3C技术(Chromosome conformation capture，3C)，并借助定量PCR的方式来检测染色质不同位点之间的互作频率。以3C技术为基础开发的环状染色质构象捕获技术4C (Circular chromatin conformation capture)、染色质构象捕获碳拷贝技术5C (Chromatin conformation capture carbon copy)、高通量染色质构象捕获技术Hi-C (High-throughput chromatin conformation capture)等技术(表 1)，为人们提供了从局部至全基因组范围内研究染色质远程相互作用的手段。
表 1 染色质构象捕获及其衍生技术的特征Table 1 The characteristic of Chromosome conformation capture and derived technology
| Groups | Technologies | Features | Advantages and disadvantages |
| Core technologies of chromatin conformation capture | 3C | One to One | Low cost, detect a few sites; need to predict interacting regions |
| 4C | One to Many | A few primers, higher throughput; need to characterize the interest target region | |
| 5C 3D-DSL | Many to Many | More interaction information; complicate to design primers | |
| Hi-C | All to All | Genome-wide detection, no bias, high throughput; high background | |
| Combined with ChIP | ChIP-loop | ChIP+3C | Compare to 3C, lower background and higher specificity, capture specific protein mediated chromatin organization |
| ChIA-PET | ChIP+Hi-C | Study genome-wide interactions mediated by specific proteins, with low background signal | |
| Hi-ChIP | ChIP+Hi-C+Tn5 | Construct sequencing library by Tn5 with reduced input | |
| Combined with OCT | Capture-C | 3C with OCT | Capture conformation formed by target regions based on oligonucleotide probes |
| Capture-Hi-C | Hi-C with OCT | Capture three-dimensional structure formed by target sequence in Hi-C library based on oligonucleotide probes, lower background signal | |
| Combined with single cell technology | Single cell Hi-C | Application of Hi-C technology at the single cell level | Detect chromatin dynamic changes in single-cell level, background may be high |
| Combined with genome assembly | Hi-C associated genomic assembly | Using Hi-C data features to assist genome assembly | Can effectively improve the quality of genome assembly |
表选项
此外，由于染色质的3D结构处在一个受多因素影响的动态变化的过程中，并已证实这和多种疾病成因有关[2]，因此基于3C和Hi-C等核心技术与免疫共沉淀技术(Oligonucleotide capture OCT)、单细胞分离获取和测序技术(Single-cell isolation and sequencing)、高通量测序(High-throughput sequencing)等技术结合(表 1)，在动植物发育的各阶段全面解析染色质的空间相互作用如何影响基因的表达调控，有助于人们在基因的线性调控认识之上，进一步从3D的较多理解生命体内的基因调控网络。
1 染色质构象捕获技术的基本原理1.1 3C技术3C技术由Job Dekker于2002年开发并首先应用于酵母染色质互作研究，此后，3C技术被迅速推广应用到动植物的染色质三维研究中。3C主要用于检测特定的DNA位点与相邻位点之间的相互作用[3]。该技术首先通过细胞交联(Cross-link)使得空间上相邻的染色质片段发生共价连接，然后用限制性核酸内切酶消化交联物，在极低的DNA浓度条件下借助T4 DNA连接酶促使空间上接近的DNA片段优先发生连接反应，这大大降低了随机发生的片段连接。最后，3C技术借助定量PCR方法检测新连接片段的相对丰度，从而推测目标染色质片段是否存在物理相互作用[4] (图 1)。2004年在酿酒酵母的研究中应用3C技术检测到SEN1基因在7 kb区间内发生染色质相互作用[5]。在较大的DNA区间内更容易检测3C相互作用，如Skok等在人胸腺细胞中确定了相距约600 kb的两个染色质片段之间存在远距离相互作用[6]。由于3C需要较长的操作流程，因此对照的设计对于3C实验的成功是必需的。首先，考虑到不同PCR引物扩增效率引起的差异，需要建立互作嵌合连接产物的DNA对照模板，通常是BAC文库或克隆质粒的酶切连接产物。其次，当比较两个以上不同样品时，需要选取已知互作频率的位点用于归一化处理，综上，3C技术需要严谨的操作、中间环节的质量控制和对照的设置[4]。
1.2 4C技术在应用3C技术时，互作片段的检测受限在一定的区间内。为了在全基因组范围内无偏好地筛选与目的片段互作的候选片段，4C技术被开发出来[7]。4C技术的关键是使交联的两个DNA分子连接成环，通过目的DNA片段的特异性引物进行反向PCR，这样只需设计一对引物就可以研究一个特定位点与所有互作位点的互作频率[8] (图 1)。若3C概括为研究“一对一”的技术，那4C可以概括为研究“一对多”的技术。Zhao等利用4C技术构建了人H19基因在全基因组范围内相互作用的调节网络[9]。Simonis等利用4C技术发现LMO3异位可能导致急性淋巴白血病细胞基因组发生染色质易位和倒位[10]。为了进一步提高4C技术的准确性和灵敏度，Huang等使用超声处理随机打断染色质的方法来代替特定位点的酶切反应，并结合新一代测序技术进行高通量分析，以减少假阳性的实验结果，增加检测精确度[11]。
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| 图 1 染色质构象捕获及其衍生技术 Fig. 1 Chromosome conformation capture and its derived technologies. 3C, 4C, 5C and Hi-C all need to cross-link cells, extract nuclei before experiments and digest chromatin by the restriction enzyme. 3C: During ligating the digested chromatin fragments in a big volume, the fragments that are physically close bias to be ligated first. Then the interaction frequency of two fragments is measured by qPCR. It's so called as "one to one". 4C: Chromatin fragments are cyclized based on two steps of digestion-ligation, and only a pair of primers is used to detect the interactions between the target site and other chromatin sites, namely "one-to-many". 5C: Amplifying DNA chimeric fragments with T3 and T7 adaptors followed by deep sequencing, namely "many to many". Hi-C: a biotin labeled nucleotide is incorporated to the ligation junction site and deep-sequencing is carried after purification by streptavidin beads, namely "all to all". ChIP-loop: Combining ChIP with 3C, the chromatin conformation mediated by specific protein is captured. ChIA-PET: Combining ChIP with Hi-C, and capturing the whole chromatin organization medicated by specific protein. HiChIP: Construct sequencing library by Tn5 transposase which could reduce starting material. Capture-C: Capture a few events of chromatin interaction among target DNA sites probed by biotin-labeled oligonucleotides. Capture Hi-C: Combination of Hi-C with Capture-C to measure whole genome interacting regions with target DNA fragments. Hi-C associated genomic assembly: Using the basic feature of Hi-C data that the interaction frequency decreases while increasing the distance to improve the quality of genome assembly. Hi-C single cell: Using single-cell sorting technology to barcode the isolated cell and combining with Hi-C high-throughput sequencing to capture chromosome conformation at single-cell level. |
| 图选项 |
1.3 5C技术5C技术的出现解决了3C技术研究多基因间互作时通量低的问题。在构建3C文库的基础之上，5C借助连接介导扩增的LMA方法(Ligation- mediated amplification)产生5C文库，并以此为模板，在引物末端加上测序通用接头。若相互作用的片段能够形成重组的DNA连接产物，则连接的片段可以被扩增，最后利用微阵列芯片或测序分析多个位点之间的互作(图 1)。5C技术可以概括为研究“多对多”的技术，Dostie等利用5C发现了K562细胞中两个珠蛋白基因非编码调控区之间存在染色质环相互作用[12]。2015年Sanyal等通过5C检测人类基因组近端启动子与远端增强子之间的互作，发现远程相互作用更加普遍[13]。然而，5C技术也存在技术上的不足，比如设计成百上千的引物耗时费力，而且会遗漏部分染色质远程相互作用的信息。Kim等对5C技术作了改进，他们在细胞核中进行限制性酶消化和连接反应实现了原位3C。此外，与常规5C中仅在酶切位点设计单一方向引物不同，该方法设计了正反双向引物，从而有效地提高了检测的灵敏度[14]。
与5C技术类似，3D-DSL技术结合了3C和DNA选择性连接(DNA selection and ligation，DSL)[15]的方法。它首先利用生物素标记富集了3C产物，然后利用预先设计的含接头探针对靶位点片段进行特异扩增，最后通过芯片或高通量测序检测染色质间的互作，大大提高信噪比[16]。借助3D-DSL技术，Harismendy等发现冠状动脉疾病(Coronary artery disease，CAD)相关增强子区域与染色体9p21等区域存在远程相互作用[17]。
1.4 Hi-C技术Hi-C技术通过结合生物素富集和高通量测序方法，研究全基因组范围内染色质内或染色质间空间位置上的互作关系，从而获得高分辨率的染色质相互作用图谱。Hi-C技术是基于3C技术建立的，该技术在酶切后通过末端补平加入生物素标记，再扩大反应体系进行邻位连接，然后利用链霉亲和素偶联的磁珠富集带有生物素标记的连接片段，建库并进行高通量测序，获得全基因组范围内的互作信息(图 1)。由于可以提供全基因组范围内的所有染色质位点之间的高精度互作信息，因此Hi-C技术被广泛应用于挖掘基因调控元件、揭示细胞时空特异性染色质构象变化以及绘制基因组三维图谱等研究工作中。2009年Job Dekker研究组利用Hi-C技术绘制出1 Mb分辨率人类三维基因组图谱[18]。Rudan等运用Hi-C技术发现CTCF (CCCTC-binding factor)蛋白与粘连蛋白(Cohesin)在细胞核中共定位，保守的CTCF在不同物种中均在染色质的拓扑相关结构域TAD (Topologically associated domains)边界进行富集，但是CTCF与不同DNA序列结合的差异可能导致内部结构域发生变化，进而造成功能不同[19]。Chandra等使用Hi-C绘制了细胞衰老过程中基因组的3D结构变化图谱，发现在衰老细胞中TAD内部相互作用减少，而TAD之间的相互作用增多[20]。Taberlay等利用Hi-C发现癌症细胞中TAD形成了额外的域边界(Domain boundaries)，因此导致TAD数目增多平均大小变小，癌细胞特有的域边界中大多出现在拷贝数发生变异的区域，此外还发现癌细胞染色质构象重构受远程表观遗传修饰的调节[21]。
植物的多倍体化增加了基因转录调控的复杂性，Hi-C技术的应用有助于对多倍体化和三维基因组结构动力学的理解。Wang等利用Hi-C技术绘制了二倍体和四倍体棉花的3D基因组结构，并发现了特异的A/B区室(A/B compartment)和TAD，这项研究增进了对多倍体植物染色质结构的了解，并为3D基因组进化与转录调控之间的关系提供了新的思路[22]。然而，在植物中是否广泛存在TAD目前还存在争论[23]。
为了提高Hi-C的精确性，人们开发了一系列Hi-C优化技术，如原位Hi-C (in situ Hi-C)和基于酶切酶连的Hi-C (Digestion-Ligation-Only Hi-C，DLO Hi-C)等技术。与2009年开发的在大体系下进行的Hi-C技术(也被称为第一代Dilution Hi-C)相比[24-18]，2014年开发的在小体系下进行的in situ Hi-C通过在完整的核内原位完成交联、酶切、连接步骤，降低了假阳性结果，在提高信噪比的同时缩短了实验周期。DLO Hi-C采用了边切边连的策略，先用Hind Ⅲ切割交联的染色质，然后在切口末端加上接头序列形成MmeⅠ的识别位点，这样可以保证Hind Ⅲ尽可能酶切彻底，同时有效地防止了Hind Ⅲ切点的自连，两个接头序列发生连接形成的嵌合片段被MmeⅠ切割成80 bp大小，此长度的片段通过凝胶电泳切胶富集，可以有效地降低Hi-C的背景信号。与Hi-C技术相比，DLO Hi-C成本低、周期短、获得有效数据比例高。DLO Hi-C与Dilution Hi-C相比，在较低测序深度的情况下，可以找到更多的染色质互作位点[25]。Rao等在2014年通过in situ Hi-C在GM12878细胞中绘制了分辨率达1 kb的基因组三维图谱[26]。
2 染色质构象捕获偶联免疫共沉淀的衍生技术2.1 染色质免疫共沉淀环技术染色质免疫共沉淀环ChIP-loop (Chromatin immunoprecipitation-loop)技术也被称为ChIP-3C。作为研究蛋白质介导的染色质互作的一种方法，ChIP-loop结合了染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)和3C技术。ChIP是鉴定反式作用因子结合基因组中DNA位点的常用方法，但是它无法确定这些DNA位点之间是否存在物理性的相互作用，而3C具有分析局部或远程染色质相互作用的优势，因此ChIP-loop融合两种技术的优点，识别受特定蛋白质介导的染色质间相互作用，降低了非特异性背景信号[27]。交联的染色质经过酶切后，利用靶蛋白的特异性抗体进行免疫沉淀，然后再进行产物的连接反应[28] (图 1)。Horike等采用ChIP-loop发现了由MECP2介导形成于DLX5和DLX6基因间的染色质环可以抑制相关基因的转录过程[29]。Kumar等利用超声技术代替限制性消化染色质的方法揭示了SATB1将核基质结合区(Matrix association regions，MAR)束缚到核基质上从而促进MHC-I基因组成独特的高级染色质环结构，进而调控基因表达[30]。为了更进一步证实特定蛋白直接参与了染色质环的形成，ChIP-loop往往需要在敲除该蛋白表达的突变体中检测染色质环的形成是否正常[31]。
2.2 配对末端标记测序技术分析染色质相互作用配对末端标记测序技术分析染色质相互作用(Chromatin interaction analysis by paired-end tag sequencing，ChIA-PET)主要结合ChIP和Hi-C，在全基因组范围内捕获靶蛋白特异介导的DNA互作片段。ChIA-PET技术流程类似于ChIP-loop，用靶标蛋白的特异性抗体免疫共沉淀DNA-蛋白质复合物后，进行建库测序[32] (图 1)。ChIA-PET可以无偏好性地检测全基因组范围内染色质之间的相互作用，它是ChIP-loop技术全基因组范围的升级扩展版本。Tang等利用ChIA-PET绘制了人类不同细胞系中由CTCF和RNA聚合酶Ⅱ介导的全基因组水平的染色质相互作用图谱[33]。Fullwood等利用ChIA-PET揭示了雌激素受体α通过远程相互作用调控下游基因启动子，并可通过形成染色质环整合相关基因调控共转录[34]。Peng等利用ChIA-PET技术捕获了H3K4me1等4种组蛋白修饰及RNA聚合酶Ⅱ介导的染色质构象，在玉米中构建了启动子和远端调控元件之间的高分辨率染色质相互作用图谱。研究结果表明调节元件之间形成了染色质环，近端启动子区发生染色质互作的基因更倾向于共表达[35]。Zhao等利用ChIA-PET技术绘制了水稻中由H3K4me3组蛋白修饰和RNA聚合酶Ⅱ介导的启动子-启动子相互作用，以及由H3K9me2组蛋白修饰介导的异染色质相互作用，从而划分出相应的活跃和非活跃转录潜能的独立染色质互作模块[36]。ChIA-PET通常是在一个文库中研究单个蛋白介导的染色质相互作用，而Fullwood等开发了Multiplex ChIA-PET，在ChIA-PET建库过程中引入6个半连接子(Half-linker)，可以同时分析多个转录因子并获得更多染色质相互作用信息，与ChIA-PET相比具有起始细胞量低、耗时少、费用低的优势[37]。
2.3 利用染色质免疫共沉淀的原位Hi-C技术利用染色质免疫共沉淀的原位Hi-C (in situ Hi-C followed by chromatin immunoprecipitation，HiChIP)是一种结合原位Hi-C、免疫共沉淀和转座酶建库来解析染色质构象的方法。HiChIP在免疫共沉淀后得到较低起始量DNA情况下，利用转座酶Tn5完成微量DNA建库。与ChIA-PET相比，HiChIP细胞起始量降低到1%，互作序列读取量高达10倍以上，与原位Hi-C相比其信噪比更高[38] (图 1)。HiChIP可以用于针对特定蛋白介导的染色质互作构象分析，转录因子作用机制研究，表观修饰对基因调控的机制研究。2017年科学家们利用HiChIP对人细胞H3K27ac、H3K27me3和RNA聚合酶Ⅱ介导的染色质相互作用进行了检测，揭示了细胞核中新的区室化特异互作[39]。
3 染色质构象捕获偶联核酸分子杂交的衍生技术3.1 Capture-CCapture-C结合了OCT和3C技术，它通过将3C文库与携带生物素的RNA捕获探针杂交并进行富集，以构建Capture-C文库(图 1)。Capture-C可在单个实验中提供数百个基因位点的无偏好、高分辨率的顺式互作图谱，除可以阐明互作的顺式作用元件调控基因时空表达的机制，它还可以进一步挖掘引发复杂疾病的DNA变异。Hughes等利用Capture-C技术获得了数百个基因启动子与调控元件之间高精度互作图谱[40]。Capture-C技术的主要局限是需要大量的细胞进行实验。但许多组织和稀有细胞群无法提供实验所需细胞的量，因此Oudelaar等开发了一种低起始量Capture-C方法(Low-input Capture-C)，这种方法通过超声处理、酶促反应后末端修复并添加连接子，可以利用约20 000个细胞以较大分辨率生成约10 000个高质量相互作用图谱[41]。
3.2 Capture Hi-C将OCT与Hi-C相结合衍生出Capture Hi-C技术，与Capture-C相比，Capture Hi-C可以无偏好、高精度地实现全基因组中基因与调控元件之间的互作。Capture Hi-C通过在Hi-C建库后，用带有生物素标记的RNA探针与Hi-C文库杂交，再进行富集测序(图 1)。2015年利用Capture Hi-C揭示了直肠癌风险基因CRC与长链非编码RNA (Long non-coding RNA，lncRNA)、已知癌基因和非编码区间存在相互作用[42]。Martin等利用Capture Hi-C发现4种自身免疫疾病变异位点会与功能靶点互作，并且这些疾病相关的单核苷酸多态性位点(Single nucleotide polymorphism, SNP)倾向与远距离的靶基因互作，而不是与其最近的基因[43]。
4 染色质构象捕获偶联单细胞测序的衍生技术3C、Hi-C及其衍生技术往往需要数以百万计的细胞材料，但是如胚胎细胞及干细胞等珍贵稀有样品，通常难以获得足量的细胞以完成三维基因组检测。同时荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)结果表明即便表型甚至基因组一致的细胞之间也存在着不同的三维染色质构象[1]。因此，检测单个细胞水平上的三维基因组结构有着重要的意义。而单细胞Hi-C的难点在于多个方面，如难以从组织分离获取单细胞；将单细胞技术与3C或Hi-C技术偶联；提高平行处理多个单细胞的通量；获取高质量数据等。应用流式细胞分选(Fluorescence-activated cell sorter，FACS)技术，激光捕获显微切割(Laser capture microdissection，LCM)等方法可以获取单细胞，利用微孔矩阵和微流控等方法可一次性区分103–106个细胞[44] (图 1)。
2013年Nagano等首次用毛细玻璃管在显微镜下通过吸取获得了单个细胞核实现了单细胞Hi-C，但难以提高分离获取单细胞的通量[45]。2018年Tan等开发的二倍体染色质构象捕获(Diploid chromatin conformation capture，Dip-C)技术，利用多末端标记扩增(Multiplex end-tagging amplification，META)方法进行全基因组扩增，具有灵敏度更高、假阳性低的优点，最终构建了分辨率20 kb的人类二倍体单细胞三维图谱[46]。2019年Zheng等利用微流控技术开发了ChIA-Drop技术(Multiplex chromatin-interaction analysis via DROPlet-based and barcode-linked sequencing)，利用微液滴及条形码标记的测序技术以单分子精度检测多重染色质相互作用，研究发现果蝇Drosophila melanogaster S2细胞利用RNA聚合酶Ⅱ捕获的启动子区域具有方向偏好性，该证据可能支持单向染色质外环外挤(One-sided extrusion)模型[47]，并且S2细胞中介导TADs形成的复合体具有高度异质性的特征，该结果与在单个细胞中使用超分辨率成像方法观测的结果类似[48]。未来，利用微液滴及条形码标记的ChIA-Drop等技术将弥补单细胞Hi-C在进行大规模细胞建库时的不足，辅助单细胞Hi-C分析。通过结合单细胞转录组测序以及单细胞转座酶介导的染色质可接近性(Assay for transposase-accessible chromatin，ATAC)等方法，Hi-C可以为我们展示单细胞水平上染色质空间结构与基因转录之间更加直接的调控关系[49]。
5 染色质构象捕获辅助基因组组装的衍生应用完整的基因组信息是开展基因功能研究的重要基础。基因组组装是指将测序获得的序列片段进行拼接获得全基因组序列信息的过程。基因组组装分为3个步骤：首先测序得到短读序列(Reads)，根据它们的重叠区域拼装成较长的连续序列(Contig)；然后再将连续序列按照顺序拼接成更长的支架结构(Scaffolds)；最后将支架合并组装到染色体上，在拼装过程中支架之间可能存在诸多空白(Gap)区域，即没有信息的序列[50]。基因组中gaps的多少成为制约基因组组装质量的关键。组装过程中，重复序列、同源多倍体等都可导致空白序列的产生。根据Hi-C技术中互作强度随距离衰减的原理，可以帮助scaffold成功拼接到染色体上，有效地辅助基因组的组装[51] (图 1)。
Hi-C技术在目前基因组组装中应用非常广泛，借助Hi-C技术，2017年将测序产生的埃及伊蚊Aedes aegypti大片段scaffold进行组装[52]，将大麦Hordeum vulgare基因组95%的超级scaffold (Super-scaffold)成功锚定在染色体上[53]。2018年利用Hi-C技术完成了亚洲棉Gossypium arboreum基因组的重新组装，将基因组Contig N50提升到1.1 Mb[54]。2019年结合Hi-C和纳米孔测序技术高质量完成了红斑石斑鱼Epinephelus akaara 97%基因组的组装[55]。另外，Hi-C技术也已成功应用于具有同源多倍体物种的基因组组装，如2018年基于Hi-C数据成功组装甘蔗野生种“割手密” Saccharum spontaneum基因组[56]。在宏基因组研究中，Burton等利用Hi-C技术成功地将真菌、细菌和古菌物种的基因组进行了区分和组装，能够高效高质地从微生物群落中鉴定和拼装出多个单物种的基因组[57]。
6 展望近年来3C及其衍生技术迅速发展并被广泛应用，人们对染色体异常相关疾病的了解也越来越深入。研究人员已经解析了乳腺癌和前列腺癌等细胞的染色质三维结构[21-57]。Barutcu等利用Hi-C发现了乳腺癌细胞(MCF-7)基因组中常染色质之间的互作频率降低，特别是端粒和亚端粒区域[58]。除了癌症外，非肿瘤相关疾病也可以通过改变染色质三维结构来影响相关基因表达。Lupianez等发现敲除、倒置或重复改变跨越TAD边界的WNT6等基因会引起人肢体畸形[52]。此外，基于3C及其各种衍生技术，研究人员能够揭示染色质中如A/B区室、TAD、染色质环等不同的三维拓扑结构[59-60]。此外，随着单细胞分离技术的日渐成熟，结合Hi-C等技术从单细胞的染色质构象动态变化上解析生命活动无疑是生命科学的一个热点领域。细胞内染色质构象的功能一直是基因组学研究的重点，3C及其衍生技术与应用有助于人类了解并攻克染色体异常疾病、细胞周期、细胞分化、动植物基因组进化等核心问题。
尽管染色质构象捕获及其衍生技术目前仍存在一些难题尚待解决，比如难以检测染色质间的弱相互作用、实验周期长导致无法快速真实反应互作状况、信噪比及分辨率低等，但3C及其衍生技术无疑为结构和功能基因组学的研究提供了强大工具支撑。三维基因组学及其衍生技术在生命科学中发挥着越来越重要的作用。随着交叉学科的不断加强，也会产生更多探究染色体生物学的新技术新方法。同时，基于染色质构象捕获衍生开发的新技术，也必将为遗传学、细胞生物学、生物物理、生物信息等学科发展注入新的活力。
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