1. 大连理工大学 生物工程学院，辽宁 大连 116024;
2. 大连理工大学 大连市合成生物学应用转化工程技术研究中心，辽宁 大连 116024
收稿日期：2020-01-07；接收日期：2020-03-30；网络出版时间：2020-04-08
基金项目：大连市科创基金项目(No.2018J12SN074), 国家自然科学基金(No.21878035), "兴辽英才计划"青年拔尖人才项目(No.XLYC1807269)资助
摘要：丙酮丁醇梭菌是生物丁醇合成的重要菌株，近年来，研究者们利用基因编辑等技术对其进行菌株改造。通过对丙酮丁醇梭菌中3个细胞分裂蛋白(RodA、DivIVA、DivIB)编码基因(cac1251、cac2118、cac2125)进行敲除，发现cac2118敲除菌株的细胞在产溶剂期为球状形态，细胞变小，ABE发酵的丁醇得率为0.19 g/g，与野生型相比提高了5.6%。cac1251敲除菌株的葡萄糖消耗量和丁醇产量与野生型相比降低了33.9%和56.3%，分别为47.3 g/L和5.6 g/L。cac1251和cac2125的敲除对细胞生长有显著影响，菌体浓度最大值与野生型相比分别降低了40.4%和38.3%。研究表明细胞分裂蛋白DivIVA对细胞的形态和大小调控起重要作用；细胞分裂蛋白RodA和DivIB调控细胞分裂进程，进而影响细胞生长和溶剂合成进程。
关键词：丙酮丁醇梭菌细胞分裂蛋白ABE发酵溶剂合成细胞形态
Effects of cell division protein-encoding genes knockout on solvent formation and cell morphology in Clostridium acetobutylicum
Meng Zhang1,2, Chuang Xue1,2
1. School of Bioengineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China;
2. Engineering Research Center of Application and Transformation for Synthetic Biology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China
Received: January 7, 2020; Accepted: March 30, 2020; Published: April 8, 2020
Supported by: Dalian Science and Technology Innovation Fund Project (No.2018J12SN074), National Natural Science Foundation of China (No.21878035), Youth Top Talent Project of "LiaoNing Revitalization Talents Program" (No.XLYC1807269)
Corresponding author: Chuang Xue. Tel: +86-411-84706625; E-mail: xue.1@dlut.edu.cn.
Abstract: Clostridium acetobutylicum is an important strain for bio-butanol formation. In recent years, gene-editing technology is widely used for developing the hyper-butanol-production strains. In this study, three genes (cac1251, cac2118 and cac2125) encoding cell division proteins (RodA, DivIVA and DivIB) in C. acetobutylicum were knocked out. The cac2118-knockout strain had changed its cell morphology to spherical-shape during the solventogenesis, and obtained a higher butanol yield of 0.19 g/g, increasing by 5.5%, compared with the wild type strain. The glucose utilization and butanol production of cac1251-knockout strain decreased by 33.9% and 56.3%, compared the with wild type strain, reaching to 47.3 g/L and 5.6 g/L. The cac1251-knockout strain and cac2125-knockout strain exhibited poor cell growth with cell optical density decreased by 40.4% and 38.3%, respectively, compared with that of the wild type strain. The results indicate that cell division protein DivIVA made the differences in the regulation of cell morphology and size. Cell division proteins RodA and DivIB played significant roles in the regulation of cell division, and affected cell growth, as well as solventogenesis metabolism.
Keywords: Clostridium acetobutylicumcell division proteinABE fermentationsolvent formationcell morphology
受全球环境变化和原油价格波动的影响，生物燃料作为一种重要的石油替代品，其相关研究受到人们的广泛关注。作为极具前景的新一代液体燃料，与生物乙醇相比，生物丁醇具有安全系数高、蒸汽压低、热值较高、能量密度高等优点[1-2]，利用丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum生产丁醇的方式尤其受到关注。丙酮丁醇梭菌是一种革兰氏阳性厌氧细菌，发酵产物主要包括丙酮、丁醇、乙醇等溶剂，其发酵也被称为ABE (Acetone-Butanol-Ethanol)发酵[3]。由于丁醇对细胞的毒性，野生型丙酮丁醇梭菌发酵的丁醇产量较低。近年来，研究者们利用Ⅱ型内含子插入失活技术[4-7]、基因过表达技术[8-9]、基于CRISPR系统的基因编辑[10-12]等方式对丙酮丁醇梭菌进行分子改造，从而获得高丁醇产量、高耐性的菌株。
丙酮丁醇梭菌发酵过程分为产酸阶段和产溶剂阶段。产酸阶段发生在发酵的指数生长期，细胞分裂较快，乙酸和丁酸的生成导致培养基内pH的下降，胁迫环境使丙酮丁醇梭菌启动溶剂化和孢子化生存机制，引起丙酮、丁醇和乙醇等溶剂的产生，同时通过细胞不对称分裂的方式产生高抗性孢子[13-15]。目前对于丙酮丁醇梭菌细胞分裂蛋白的研究较少，由于丙酮丁醇梭菌与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的基因组序列具有较高相似度，因此枯草芽孢杆菌的研究成果对于丙酮丁醇梭菌有重要的参考价值。在枯草芽孢杆菌的细胞分裂过程中，细胞分裂蛋白调节着细胞分裂进程[16-17]。细胞分裂蛋白DivIVA在细胞分裂和产孢过程中起着重要作用，在正常细胞分裂过程中，DivIVA调节细胞分裂抑制因子MinCD复合物的活性，从而帮助细胞对称分裂；在产孢过程中，DivIVA在不对称细胞分裂前将染色体的复制起点引导到细胞极上[18]。细胞分裂蛋白DivIB在枯草芽孢杆菌中调控着与细胞壁合成的相关酶，同时在孢子生长的第一轮复制过程中起到调控作用[19]，细胞分裂蛋白RodA在枯草芽孢杆菌的细胞伸长过程中调控肽聚糖的合成[20]。
通过查询NCBI数据库发现，丙酮丁醇梭菌中cac1251、cac2118、cac2125基因分别对应编码RodA蛋白、DivIVA蛋白和DivIB蛋白。本研究通过Ⅱ型内含子插入失活技术对丙酮丁醇梭菌的上述3个编码细胞分裂蛋白的基因进行敲除，获得基因敲除菌株?cac1251、?cac2118和?cac2125，考察敲除菌株的细胞溶剂合成和细胞形态变化，进一步分析丙酮丁醇梭菌中3个细胞分裂蛋白的调控作用。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 菌株和质粒本研究所使用的丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC 55025、大肠杆菌Escherichia coli DH5α、大肠杆菌E. coli DH10B (含PAN1质粒)以及质粒载体pSY6均为本实验室保存。
1.1.2 主要仪器和试剂本研究所用主要仪器包括：PCR扩增仪(TaKaRa Bio公司)、电泳仪(北京六一生物科技有限公司)、温控高速离心机(德国Eppendorf公司)、厌氧培养箱(英国Don Whitley Scientific公司)、发酵罐(KoBioTech公司)、气相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)、液相色谱仪(美国Waters公司)、Multiskan Ascent酶标仪(Thermo Labsystems公司)、Leica EM UC6超薄切片机(徕卡显微系统贸易有限公司)、JEM-2000EX电子显微镜(日本电子株式会社)。
本研究所需试剂包括：DNA聚合酶KOD- Plus-Neo、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶BsrGⅠ和XhoⅠ、DNA marker、T4 DNA连接酶、引物EBS universal、EBS 2、EBS1d和IBS等购自生工生物工程(上海)股份有限公司；质粒DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒购于大连美仑生物技术有限公司。
1.1.3 培养基和缓冲液的配制LB培养基、CGM培养基、P2培养基、玉米培养基的配制见参考文献[21]；LB培养基用于大肠杆菌的培养，CGM培养基用于丙酮丁醇梭菌的培养，P2培养基用于ABE发酵，玉米培养基用于丙酮丁醇梭菌的菌株保藏。
ETM缓冲液和ET缓冲液分别用于丙酮丁醇梭菌感受态细胞制备的清洗和重悬。ET缓冲液的配方为：蔗糖92.5 g/L、Na2HPO4 0.09 g/L、NaH2PO4 0.52 g/L；ETM缓冲液的配方为：蔗糖92.5 g/L、Na2HPO4 0.09 g/L、NaH2PO4 0.52 g/L、MgCl2 0.85 g/L。上述培养基及缓冲液均需在121 ℃灭菌15 min[21]。
1.2 实验方法1.2.1 表达载体构建目标片段获取：在NCBI网站上，查找丙酮丁醇梭菌中编码细胞分裂蛋白的基因cac1251、cac2118和cac2125，下载基因序列信息。登录内含子片段设计网站(http://clostron.com)，输入目的基因序列，选择内含子插入位置，设计内含子及对应PCR引物(表 1)。以pSY6质粒为模板进行PCR反应，第一轮PCR扩增合成片段intron-1和片段intron-2，反应体系为：KOD DNA聚合酶1 μL、10×Buffer 5 μL、dNTPs 5 μL、MgSO4 3 μL、质粒pSY6 2 μL、ddH2O 30 μL、引物各2 μL，其中intron-1片段的引物为IBS和EBS universal，intron-2片段的引物为EBS2和EBS1d。第二轮PCR以片段intron-1和intron-2为模板，扩增合成目标内含子片段，PCR反应体系为：KOD DNA聚合酶1 μL、10×Buffer 5 μL、dNTPs 5 μL、MgSO4 3 μL、片段intron-1和intron-2各2 μL、引物IBS和EBS1d各2 μL、ddH2O 28 μL。每轮PCR反应结束后，均需用PCR纯化试剂盒对产物进行纯化。
表 1 本研究中所使用的引物Table 1 Primers used in this study
| Primer names | Primer sequences (5′–3′) | Size (bp) | Notes |
| cac1251-IBS | CCGCTCGAGATAATTATCCTTAGAAATCATATACGTGCGCCCAGATAGGGTG | 52 | Used for first round PCR and second round PCR |
| cac1251-EBS1d | CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCATATACGGTAACTTACCTTTCTTTGT | 60 | |
| cac1251-EBS2 | TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGATTATTTCTCGATAGAGGAAAGTGTCT | 49 | |
| cac2118-IBS | CCGCTCGAGATAATTATCCTTAGAGAGCGACTTGGTGCGCCCAGATAGGGTG | 52 | |
| cac2118-EBS1d | CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCGACTTGATTAACTTACCTTTCTTTGT | 60 | |
| cac2118-EBS2 | TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGATTCTCTCTCGATAGAGGAAAGTGTCT | 49 | |
| cac2125-IBS | CCGCTCGAGATAATTATCCTTAGGTGTCTTATTGGTGCGCCCAGATAGGGTG | 52 | |
| cac2125-EBS1d | CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCTTATTGGATAACTTACCTTTCTTTGT | 60 | |
| cac2125-EBS2 | TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGATTACACCTCGATAGAGGAAAGTGTCT | 49 | |
| EBS Universal | CGAAATTAGAAACTTGCGTTCAGTAAAC | 28 | |
| cac1251-s | GCGCTTGCAAGTACATGG | 18 | Used for colony PCR |
| cac1251-a | CATCCTTCATTGCATCTAC | 19 | |
| cac2118-s | CAGAGAATTATGAGCAGC | 18 | |
| cac2118-a | CTGCTGCTTAACATTATCG | 19 | |
| cac2125-s | GAGGAAAATGAGTACATAG | 19 | |
| cac2125-a | CCATTTTTCAAGGTAACC | 18 |
表选项
酶切和连接：在37 ℃恒温条件下，对目的片段和pSY6质粒分别进行酶切4 h，酶切体系为目的片段或质粒12 μL、酶BsrGⅠ和XhoⅠ各0.5 μL、10×buffer 2 μL、ddH2O 5 μL。将所得酶切产物利用DNA凝胶回收试剂盒进行胶回收，将所得目的片段和质粒的酶切产物于16 ℃恒温连接16 h，获得连接产物pSY6-intron，连接体系为质粒双酶切产物1.3 μL、目的片段双酶切产物3.9 μL、酶SolutionⅠ5.2 μL。
连接产物转化：取10 μL所得到的连接产物(pSY6-intron)，热激转化至E. coli DH5α感受态细胞中，在含有终浓度为100 μg/mL氨苄(Amp)抗性的LB固体培养基上培养筛选，挑取单菌落接种于含有终浓度为100 μg/mL的Amp抗性的LB液体培养基中，提取质粒后由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，内含子序列完全准确的即为正确重组质粒。
重组质粒甲基化：由于丙酮丁醇梭菌中存在限制性修饰系统，会降解外源DNA，故需要利用表达来自枯草芽孢杆菌噬菌体甲基化酶的大肠杆菌对所转化质粒进行甲基化修饰，进而保护外源质粒在丙酮丁醇梭菌中的存在。将3个构建好的质粒分别取1.5 μL，加至E. coli DH10B (含PAN1质粒)感受态细胞中，冰浴30 min后立即在42 ℃的水中热激90 s，再次放置冰上3 min后加入700 μL LB液体培养基，在37 ℃摇床中复苏1 h，将复苏后的菌液涂布于含有终浓度分别为100 μg/mL氨苄(Amp)和氯霉素(Cm)抗性的LB固体培养基上，37 ℃过夜培养，挑取单菌落转接至5 mL含有终浓度分别为100 μg/mL的Amp和Cm抗性的LB液体培养基中，过夜培养后提取甲基化质粒。
1.2.2 基因敲除的菌株构建梭菌感受态细胞制备：将丙酮丁醇梭菌ATCC 55025在CGM固体培养基上进行划线，培养20 h后，挑取单菌落至5 mL的CGM液体培养基中；过夜培养后，接种至50 mL CGM培养基中，待OD600至0.6左右，4 ℃、4 500 r/min离心10 min，弃掉上清；向菌体中加入30 mL ETM缓冲液，进行重悬混匀，冰上静置10 min后，4 ℃、4 500 r/min离心10 min，弃掉上清；在菌体中加入ET缓冲液2.5 mL，进行重悬混匀。
电击转化将表达载体转入梭菌：将10 μL甲基化后的重组质粒和190 μL丙酮丁醇梭菌ATCC 55025重悬缓冲液混匀，冰上静置10 min；设置电转电压为1.8 kV，电转后立即加入800 μL CGM液体培养基混合均匀，放于37 ℃厌氧箱内复苏4 h后，涂布于含有40 μg/mL的红霉素(Em)的CGM固体培养基上。
阳性转化子的验证：挑取转化子单菌落进行菌落PCR验证，菌落PCR所用引物见表 1，反应体系为：Taq DNA聚合酶10 μL、s-primer 0.3 μL、a-primer 0.3 μL、ddH2O 7.4 μL、菌液2 μL。验证正确的单菌落在无Em抗性的CGM固体培养基上传代3次，丢失外源质粒。
保菌：挑取丢失外源质粒的阳性转化子菌落在4 mL CGM液体培养基中培养12 h后，转接至20 mL的玉米培养基中，培养36–48 h后，加入等体积的40% (V/V)甘油溶液，分装到2 mL离心管中，?80 ℃保存。菌株构建过程在厌氧环境下进行，所获得基因敲除菌株名称分别为?cac1251、?cac2118和?cac2125。
1.2.3 ABE发酵配制1.4 L P2培养基，灭菌后立即通入氮气以去除发酵罐内溶氧，连接好冷凝水和循环水管路，控制温度为37 ℃，pH不低于5.0。将保存的2 mL菌液接入至100 mL的CGM液体培养基内，培养20 h后接入发酵罐中。在发酵过程中，利用酶标仪测量菌体浓度OD600；取4 mL菌液在12 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液进行发酵产物分析。利用Water 1525高效液相色谱仪测定所收集发酵液的葡萄糖、乙酸、丁酸浓度，色谱柱为有机酸分析柱(30 cm×7.8 mm，Bio-Rad)，使用PDA检测器在210 nm的检测波长下测定酸浓度，流动相为0.005 mol/L的稀硫酸，流速为0.5 mL/min，进样量为20 μL，处理时间为40 min。采用内标法，利用气相色谱仪测定所收集发酵液的丙酮、乙醇、丁醇浓度[22]，柱温设定为100 ℃，FID检测器的温度为300 ℃，进样口温度为250 ℃。H2流速为40 mL/min，空气流速为400 mL/min，N2流速为40 mL/min，进样量为0.1 μL。利用液相色谱仪和气相色谱仪测定样品含量还需制备标准曲线，所用葡萄糖、乙酸、丁酸、丁醇、丙酮、乙醇、异丁醇均为阿拉丁试剂(上海)有限公司生产，试剂规格为色谱纯。
1.2.4 透射电镜分析取所构建的3株敲除菌株?cac1251、?cac2118、?cac2125和野生型菌株ATCC 55025在发酵第32 h的发酵液4 mL，12 000 r/min离心10 min，弃净上清。所获得菌体细胞用1% (V/V) PBS缓冲液重悬3次，加入4 ℃预冷的2.5% (V/V)戊二醛溶液进行处理。待细胞固定24 h后，分别在50%、70%、80%、90%、100%的酒精溶液(V/V)中依次进行脱水，在环氧树脂包埋和Leica EM UC6超薄切片机切片后，经醋酸铀和柠檬酸铅染色液染色，在JEM-2000EX电子显微镜下对样品进行观察[23]。
2 结果与分析2.1 敲除菌株构建验证2.1.1 Ⅱ型内含子片段验证以IBS和EBS universal、EBS2和EBS1d为引物进行第一轮PCR，得到两个内含子片段，片段长度约为200 bp和100 bp，以第一轮所得两个PCR片段作为模板、以IBS和EBS1d为引物进行第二轮PCR，得到内含子片段约为300 bp。图 1A为两轮内含子片段的电泳结果图，其中泳道1、2、3、4、5、6分别为?cac1251-intron1、?cac1251- intron2、?cac2118-intron1、?cac2118-intron2、?cac2125-intron1和?cac2125-intron2的第一轮PCR内含子片段，泳道7、8、9分别为?cac1251- intron、?cac2118-intron和?cac2125-intron的第二轮PCR内含子片段，各片段大小均与预期结果相符。将第二轮得到的内含子片段与pSY6质粒连接并转化至E. coli DH5α中，得到重组质粒pSY6-intron-cac1251、pSY6-intron-cac2118、pSY6-intron-cac2125，将重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果与内含子片段的碱基序列完全一致。
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| 图 1 电泳结果图(A：内含子片段电泳结果图；B：菌落PCR的电泳结果图) Fig. 1 Results of electrophoresis. (A) Results of intron fragment electrophoresis. M: DL2 000 DNA marker; 1: ?cac1251-intron1; 2: ?cac1251-intron2; 3: ?cac2118-intron1; 4: ?cac2118-intron2; 5: ?cac2125-intron1; 6: ?cac2125-intron2; 7: ?cac1251-intron; 8: ?cac2118-intron; 9: ?cac2125-intron. (B) Results of colony PCR electrophoresis. M: DL2 000 DNA marker, 1: PCR product from ATCC 55025, 2: PCR product from ?cac1251, 3: PCR product from ?cac2118, 4: PCR product from ?cac2125. |
| 图选项 |
2.1.2 内含子片段转入梭菌的验证挑取电转涂板后的单菌落进行菌落PCR验证：在目的基因插入位点上下游各200 bp左右的位置设计引物，经菌落PCR反应，若内含子未插入到丙酮丁醇梭菌中，则该片段长400 bp左右；若内含子已整合到目的基因中，则该片段长1 600 bp左右。图 1B为菌落PCR的电泳结果，其中泳道2、3、4分别为?cac1251、?cac2118和?cac2125的菌落PCR条带，大小约为1 600 bp左右，说明丙酮丁醇梭菌中对应的基因cac1251、cac2118和cac2125均得到了有效的敲除。
2.2 透射电镜分析图 2A–D分别为菌株ATCC 55025、?cac1251、?cac2118、?cac2125在发酵第32 h的透射电镜图，其中左侧图片的放大倍数为10 000倍，右侧图片的放大倍数为25 000倍。从图中可以看出，菌株ATCC 55025的细胞呈现了典型的杆状形态，在电镜视野中细胞较为密集。而菌株?cac1251的细胞与野生型细胞相比已发生裂解，在电镜视野中没有找到生长良好的细胞，说明细胞在这一时期已经提前进入衰老期，大部分细胞出现了凋亡现象。菌株?cac2118在电镜视野中细胞较为密集，但细胞的大小与野生型细胞相比明显变小，细胞的形态有明显的变化，呈现为球状形态；菌株?cac2125在电镜视野中的细胞与野生型相比较为稀疏，细胞呈现为典型的杆状形态，细胞的大小与野生型相比无明显差异。
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| 图 2 四种菌株在发酵第32 h的透射电镜图(A：丙酮丁醇梭菌ATCC 55025；B：菌株?cac1251；C：菌株?cac2118；D：菌株?cac2125.左侧图片的放大倍数为10 000倍，右侧图片的放大倍数为25 000倍) Fig. 2 Transmission electron microscope image of C. acetobutylicum in fermentation (32 h). (A) ATCC 55025. (B) ?cac1251. (C) ?cac2118. (D) ?cac2125. Left were the magnification of 10 000×, and right were the magnification of 25 000×. |
| 图选项 |
在野生型菌株的透射电镜图片中，呈现肿胀、明亮状态的物质是由葡萄糖合成的淀粉粒，与细胞的孢子化进程相关[24]。菌株?cac2118和菌株?cac2125的透射电镜图片中也能够观察到淀粉粒的存在，但是细胞中淀粉粒的数量与野生型相比明显减少，说明这两个编码细胞分裂蛋白的基因敲除后，影响了细胞中葡萄糖合成淀粉粒的进程，进而可能会对细胞的孢子化进程产生影响。而菌株?cac1251在发酵第32 h的电镜图片中大部分细胞发生裂解，无法检测到成熟细胞内淀粉粒的数量。
2.3 细胞生长比较将菌株?cac1251、?cac2118、?cac2125和野生型菌株ATCC 55025进行ABE发酵，各设置3个发酵平行实验，图 3A为发酵过程中细胞生长情况。菌株ATCC 55025在发酵第32 h的OD600值最大，为4.7；菌株?cac1251在发酵第48 h的OD600值最大，为2.9，与野生型相比降低了38.3%；菌株?cac2118在发酵第32 h的OD600值最大，为4.5，与野生型相比降低了4.3%；菌株?cac2125在发酵第32 h的OD600值最大，为2.8，与野生型相比降低了40.4%。在发酵的指数生长期，菌株ATCC 55025的生长速率最快，菌株?cac2118的生长速率仅次于ATCC 55025，而菌株?cac1251、?cac2125的生长速率较为缓慢。结果表明cac2125和cac1251的敲除影响了细胞在指数生长期的生长速率，最大OD600值也与野生型相比分别降低了40.4%和38.3%，而cac2118的敲除对细胞生长速率和最大OD600值无明显影响。
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| 图 3 四种菌株细胞生长和葡萄糖消耗比较图(A：4种菌株细胞生长情况(OD600)比较；B：葡萄糖消耗情况比较，每个菌株的发酵均设置3个平行实验) Fig. 3 Comparative of optical density and glucose consumption for four strains. (A) Comparative of optical density (OD600) for four strains. (B) Comparative of glucose consumption for four strains. Three parallel experiments were set up for the fermentation using each strain. |
| 图选项 |
2.4 底物利用比较利用液相色谱仪对4种菌株在发酵液中的葡萄糖含量进行测定，图 3B为4种菌株的葡萄糖消耗情况。菌株ATCC 55025在发酵前32 h的葡萄糖消耗速率为2.1 g/(L·h)；在发酵第32–72 h的葡萄糖消耗量较小；发酵结束时的葡萄糖消耗量为71.6 g/L。菌株?cac1251在发酵前20 h的葡萄糖消耗速率明显低于其他3个菌株，仅为0.5 g/(L·h)，说明菌株?cac1251存在延迟生长的现象；而在发酵第21–32 h，菌株?cac1251的葡萄糖消耗速率增大，为1.6 g/(L·h)；在发酵第32–72 h的葡萄糖消耗量较小；发酵结束时的葡萄糖消耗量仅为47.3 g/L。菌株?cac2118在发酵前32 h的葡萄糖消耗速率为1.9 g/(L·h)，仅次于菌株ATCC 55025；在发酵第32–72 h的葡萄糖消耗量较小；发酵结束时的葡萄糖消耗量为70.1 g/L。菌株?cac2125在发酵前32 h的葡萄糖消耗速率为1.5 g/(L·h)；在发酵第32–42 h的葡萄糖消耗量增大，消耗速率为1.7 g/(L·h)；发酵结束时的葡萄糖消耗量为70.9 g/L。结果表明cac1251的敲除对细胞葡萄糖的消耗影响较大，葡萄糖消耗量与野生型相比下降了33.9%，而cac2118和cac2125的敲除对于细胞葡萄糖的消耗无明显影响。
2.5 中心碳代谢比较利用液相色谱仪对4种菌株发酵过程中乙酸和丁酸产量进行测定，图 4A比较了4种菌株的乙酸产量，4种菌株的乙酸产量均呈现了上升的趋势。从乙酸生成速率来看，4种菌株在前6 h的乙酸生成速率最快，菌株ATCC 55025和?cac2125的乙酸生成速率在发酵第6–21 h较高，而菌株?cac1251和?cac2118的乙酸生成速率较低，均仅为0.001 g/(L·h)。在发酵结束时，菌株ATCC 55025、?cac1251、?cac2118、?cac2125的乙酸产量分别为5.2 g/L、4.0 g/L、4.4 g/L、3.8 g/L，野生型菌株的乙酸产量比其他菌株高。
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| 图 4 四种菌株中心碳代谢产物的产量比较图(A：乙酸含量；B：丁酸含量；C：丁醇含量；D：总溶剂含量) Fig. 4 Comparative of central carbon metabolites production for four strains. (A) The concentration of acetate. (B) The concentration of butyrate. (C) The concentration of butanol. (D) The concentration of total solvents. |
| 图选项 |
图 4B比较了4种菌株的丁酸生成情况，由于在发酵过程中丁酸重吸收生成丁醇，4种菌株的丁酸产量均呈现了先上升后下降的趋势。菌株ATCC 55025在发酵第21 h的丁酸产量达到最大，为7.5 g/L，随后丁酸产量逐渐下降，到发酵结束时丁酸产量仅为1.0 g/L。菌株?cac2118在发酵第32 h的丁酸产量最大，为4.1 g/L，在发酵结束时的丁酸产量仅为1.0 g/L。菌株?cac1251在发酵第42 h的丁酸产量最大，为6.8 g/L，在发酵结束时的丁酸产量为4.7 g/L；菌株?cac2125在发酵第21 h的丁酸产量最大，为4.9 g/L，在发酵结束时的丁酸产量为2.9 g/L。结果表明cac1251和cac2125的敲除降低了细胞内丁酸重吸收生成丁醇的能力。
利用气相色谱仪对4种菌株发酵过程中丙酮、乙醇、丁醇产量进行测定，图 4C、4D分别比较了4种菌株的丁醇产量和总溶剂产量。从丁醇生成情况看，菌株ATCC 55025在发酵前6 h无丁醇生成，发酵第21–47 h中的丁醇产量明显增加，丁醇生成速率为0.4 g/(L·h)，发酵结束时丁醇产量达到12.8 g/L。菌株?cac1251在发酵前21 h均无丁醇产生，在发酵第21–47 h的丁醇生成速率仅为0.1 g/(L·h)，在发酵第47–52 h的生成速率较大，达到0.5 g/(L·h)，发酵结束时丁醇产量仅为5.6 g/L，与野生型相比降低了56.3%。菌株?cac2118的丁醇生成情况与野生型相似，在发酵前6 h无丁醇生成，发酵第21–47 h中的丁醇生成速率为0.3 g/(L·h)，发酵结束时丁醇产量达到12.7 g/L。菌株?cac2125在发酵前6 h无丁醇生成，发酵第21–47 h中的丁醇生成速率为0.3 g/(L·h)，发酵结束时丁醇产量为11.1 g/L，与野生型相比降低了13.3%。4种菌株的总溶剂生成情况与丁醇生成情况相似，菌株?cac2118的丙酮和乙醇产量分别为4.9 g/L和1.6 g/L，菌株ATCC 55025的丙酮和乙醇产量分别为4.3 g/L和1.2 g/L，故菌株?cac2118的总溶剂产量比菌株ATCC 55025高，分别为19.2 g/L和18.4 g/L；菌株?cac2125的总溶剂产量为17.1 g/L，而菌株?cac1251的总溶剂产量仅为7.5 g/L。表 2为4种菌株的丁醇得率和总溶剂得率，菌株?cac2118的丁醇得率和总溶剂得率分别比野生型菌株高5.6%和7.7%，而菌株?cac1251的丁醇和总溶剂得率则比野生型菌株低22.2%和40.0%。
表 2 四种菌株的丁醇得率和总溶剂得率情况Table 2 Butanol yield and total solvents yield for four strains
| ATCC 55025 | ?cac1251 | ?cac2118 | ?cac2125 | |
| Butanol yield (g/g) | 0.18 | 0.14 | 0.19 | 0.16 |
| Total solvents yield (g/g) | 0.26 | 0.19 | 0.28 | 0.25 |
表选项
3 讨论在丙酮丁醇梭菌中，对细胞分裂蛋白的研究大多为转录组学和蛋白质组学的数据分析[25-26]，没有编码细胞分裂蛋白的基因敲除对细胞溶剂合成和细胞形态影响的研究。作为目前较为成熟的基因编辑技术，基于Ⅱ型内含子的基因失活技术在丙酮丁醇梭菌中一直被广泛应用[27-29]，本研究利用该技术成功构建了丙酮丁醇梭菌中3个编码细胞分裂蛋白基因的敲除菌株?cac1251、?cac2118和?cac2125，通过对3种菌株进行ABE发酵和透射电镜照射，进一步分析编码细胞分裂蛋白的基因敲除对发酵过程中溶剂合成和细胞形态的影响。由于丙酮丁醇梭菌的发酵先后经历产酸期和产溶剂期，本研究中发酵前12–20 h为典型的产酸期和指数生长期，发酵20 h后，细胞进入产溶剂期。而在ABE发酵的32 h左右，细胞处于产溶剂期的中期，溶剂合成较为旺盛，OD600值最大。在这一时期进行透射电镜分析，既能观察到更多的细胞，也能全面分析不同细胞在溶剂生成期的变化，故选取发酵第32 h的样品作为透射电镜分析的取样点。在ABE发酵过程中对细胞生长(OD600)、葡萄糖消耗量、酸和溶剂的产量进行测定并分析。
在其他细菌中，细胞分裂蛋白的研究对本研究的分析有重要参考意义。Costa等[30]将鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium中编码RodA蛋白的基因敲除后，细胞出现了延迟分裂的情况，敲除菌株的OD650值也比野生型低；在丙酮丁醇梭菌中，对编码细胞分裂蛋白RodA的基因cac1251敲除后，细胞会提前进入凋亡期，菌株的最大OD600值也比野生型低。Ni等[31]将猪链球菌Streptococcus suis编码DivIVA蛋白的基因敲除后，细胞出现隔膜位置异常和不对称分裂等情况，细胞存活率与野生型相比下降；在本研究中，敲除编码cac2118基因后对细胞形态和大小有所影响，但并没有对ABE发酵过程中的细胞生长情况产生影响。Bottomley等[32]在金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus中发现，编码DivIB蛋白的基因敲除会导致细胞存在分裂隔膜的错位，细胞会出现不止一个分裂起始点，进而发生溶解破坏；在本研究中，菌株?cac2125透射电镜下的细胞稀疏，可能由于细胞发生溶解破坏，影响了细胞的分裂，导致成活细胞数量的减少。
将野生型菌株和敲除菌株在ABE发酵过程中的细胞生长、葡萄糖利用、溶剂生成等方面进行比较，在细胞生长方面，细胞最大OD600值由大到小的顺序为：菌株ATCC 55025≈菌株?cac2118 > 菌株?cac1251 > 菌株?cac2125；在葡萄糖利用方面，葡萄糖消耗量由高至低的顺序为：菌株ATCC 55025 ≈ 菌株?cac2118≈菌株?cac2125 > 菌株?cac1251；在溶剂生成方面，溶剂产量由高至低的顺序为：菌株ATCC 55025 > 菌株?cac2118 > 菌株?cac2125 > 菌株?cac1251，溶剂得率由高至低的顺序为：菌株?cac2118 > 菌株ATCC 55025 > 菌株?cac2125 > 菌株?cac1251。根据上述结果分析，菌株?cac2118的ABE发酵与野生型菌株发酵大致相似，葡萄糖消耗量、酸和溶剂的产量与野生型相比无明显差异，发酵结束时，丁醇得率由野生型的0.18 g/g略提高至0.19 g/g，说明菌株?cac2118利用葡萄糖转化丁醇的能力有所提高。菌株?cac1251的最大OD600值虽然比菌株?cac2125高，但是菌株?cac1251在发酵第32 h的透射电镜图像中，大部分细胞均已发生凋亡，说明细胞代谢活性较低，导致葡萄糖的利用和丁醇的产量受到影响；相反，菌株?cac2125在发酵第32 h的透射电镜图像中虽然细胞分布稀疏，但是细胞呈现典型的杆状形态，生长情况良好，故菌株能够有效利用葡萄糖并生产丁醇，上述分析也能够说明菌株?cac2125的葡萄糖利用率和丁醇的产量比菌株?cac1251高。值得注意的是，虽然菌株?cac2125葡萄糖的消耗量与菌株?cac2118大致相同，但在发酵结束时丁醇产量比菌株?cac2118低1.6 g/L，这可能是因为菌株?cac2125产酸能力要比菌株?cac2118强，菌株?cac2125有机酸的产量比菌株?cac2118高1.4 g/L。
本研究分别敲除3种编码细胞分裂蛋白的基因，分析了3种细胞分裂蛋白各自在丙酮丁醇梭菌中对溶剂合成和细胞生长的作用，实验结果表明细胞分裂蛋白DivIVA对细胞的形态和大小调控起重要作用；细胞分裂蛋白RodA和DivIB调控细胞分裂进程，进而影响溶剂合成和细胞生长进程。但是细胞分裂蛋白的作用都是由多蛋白、多基因水平共同调控，研究细胞分裂蛋白在丙酮丁醇梭菌的分子机制与生理机理，应从分子、代谢和组学等方面深入、全面地整合分析，以期阐明细胞分裂蛋白在丙酮丁醇梭菌中的详细机制。
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