北京中医药大学 生命科学学院，北京 102488
收稿日期：2020-03-28；接收日期：2020-07-29；网络出版时间：2020-08-12
基金项目：北京中医药大学发展基金(No. 2020071420021)，国家自然科学基金(No. 81774014)资助
摘要：外源基因的表达效率低是蓝藻基因工程发展的瓶颈之一，T7 RNA聚合酶表达系统实现了大肠杆菌中外源基因的高效表达，蓝藻与大肠杆菌同为革兰氏阴性菌，具有较高的遗传同源性，在蓝藻中构建T7 RNA聚合酶表达系统有可能提高外源基因在蓝藻中的表达效率。为了在鱼腥藻7120中构建T7 RNA聚合酶表达系统，采用重叠延伸PCR技术和酶切连接等方法构建能够表达T7 RNA聚合酶的定点整合载体pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2以及由T7启动子驱动hG-CSF基因表达的穿梭表达载体pRL-T7-hG-CSF；采用电击转化法将定点整合载体导入野生型鱼腥藻中，通过三亲接合的方法将穿梭表达载体转入已定点整合T7 RNA聚合酶的转基因鱼腥藻中。利用PCR技术鉴定外源基因在蓝藻中的存在；RT-PCR方法检测外源基因在蓝藻中的转录情况；Western blotting实验检测外源基因在蓝藻中的蛋白表达情况。结果表明两种载体构建成功，T7 RNA聚合酶基因和hG-CSF基因被转入鱼腥藻中，两个基因均在藻中表达，T7 RNA聚合酶表达系统在鱼腥藻中构建成功，与传统蓝藻表达系统相比，文中在鱼腥藻中构建的T7表达系统使hG-CSF基因的表达量提高2倍。该表达系统将为蓝藻基因工程的应用提供更优的工具，将促进蓝藻作为底盘细胞在合成生物学等领域的发展。
关键词：T7 RNA聚合酶T7启动子鱼腥藻Anabaena sp. PCC 7120人粒细胞集落刺激因子电击转化三亲结合
Construction of T7 RNA polymerase gene expression system in Anabaena sp. PCC 7120 for the expression of hG-CSF
Xueqing Xie, Yuqi Tian, Jinghuan Tian, Wenyan Ning, Chunmei Wang
School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China
Received: March 28, 2020; Accepted: July 29, 2020; Published: August 12, 2020
Supported by: Development Fund of Beijing University of Chinese Medicine (No. 2020071420021), National Natural Science Foundation of China (No. 81774014)
Corresponding author: Chunmei Wang. Tel: +86-10-53912163; Fax: +86-10-53912158; E-mail: wchunmei@126.com.
Abstract: The low expression rate of exogenous genes in cyanobacteria is one of the bottlenecks of cyanobacteria genetic engineering. The T7 RNA polymerase expression system has achieved the efficient expression of exogenous genes in Escherichia coli. Cyanobacteria and E. coli are both Gram-negative bacteria with high genetic homology. The construction of T7 RNA polymerase expression system in cyanobacteria may improve the expression of foreign genes. In order to construct the T7 RNA polymerase expression system in Anabaena sp. PCC 7120, methods such as overlapping extension PCR and digestion-ligation technique were used to construct a site-specific integration vector pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2 and a shuttle expression vector pRL-T7-hG-CSF. The site-specific integration vector is capable of expressing T7 RNA polymerase, and the shuttle expression vector expresses hG-CSF driven by the T7 promoter. Then we introduced the site-specific integration vector into the wild type cyanobacteria by electroporation and transferred the shuttle expression vector into the site-integrated transgenic cyanobacteria by triparental conjugative transfer. In the end, we identified the presence of foreign genes in cyanobacteria by PCR, tested the transcription level of foreign genes in cyanobacteria by RT-PCR, and detected the protein expression of foreign genes in cyanobacteria by Western blotting. The two vectors were successfully constructed, the T7 RNA polymerase gene and hG-CSF gene were transferred into cyanobacteria well, and both genes were also expressed in cyanobacteria. In summary, the T7 RNA polymerase expression system was successfully constructed in cyanobacteria, and the expression rate of hG-CSF gene was doubled than the traditional cyanobacteria expression systems. This expression system will provide a better tool for the application of cyanobacteria genetic engineering and will promote the development of cyanobacteria as a chassis cell in the fields of synthetic biology in the future.
Keywords: T7 RNA polymeraseT7 promoterAnabaena sp. PCC 7120hG-CSFelectroporationtriparental conjugative transfer
蓝藻Cyanobacteria也被称为蓝绿藻，是一种革兰氏染色阴性、无鞭毛、含叶绿素a的大型原核生物。蓝藻是合成生物学最具应用潜力的底盘细胞之一。相对于常用的底盘细胞大肠杆菌和酵母菌，蓝藻具有独特的优势：蓝藻能够通过光合作用和Calvin-Benson循环在仅使用二氧化碳和阳光作为唯一的碳源和能源的条件下生成生物质[1]，并且可以将这些生物质转化为有价值的代谢产物，这将大大降低合成生物学产业化的成本。另外，与能进行光合作用的真核藻类和植物相比，蓝藻在遗传上更简单，便于进行基因操作[2]，且蓝藻生长速度较快，在光反应器中培养已接近大肠杆菌的生长速度[3]。已有大量的研究实现了基因工程蓝藻的异源生物产品的生物合成[1]。然而，蓝藻在合成生物学领域取得的进展落后于大肠杆菌和酵母系统，除了缺少安全稳定的基因组改造方法，获得的藻株稳定性和可控性不足等原因以外，可供选择的高效外源基因表达系统较少也是重要因素[4]。蓝藻外源基因表达体系最早由Peter Wolk实验室建立[5]，他们以蓝藻内源质粒为蓝本，与大肠杆菌质粒相结合，构建了可以同时在蓝藻和大肠杆菌中表达目的基因的穿梭表达载体。这套体系虽然经过多方改进，包括启动子[6-7]、SD序列[8]、核糖开关[9]等，外源蛋白表达量仅能达到可溶性蛋白的1%-15%[10-11]，而大肠杆菌的pET表达系统外源蛋白表达量达到30%-70%。pET表达系统由整合了T7 RNA聚合酶的大肠杆菌和含有T7启动子的质粒组成。T7 RNA聚合酶具有如下特性[12]：(1)与多亚基细菌RNA聚合酶相比，它是一种单亚基酶；(2)较高的生产力；(3)对T7启动子的高度特异性；(4)不受辅助转录因子的影响；(5)具有产生长转录本的能力；(6)与细菌转录终止位点明显不同，仅通过Ⅰ类和Ⅱ类终止信号终止。这些特性使得T7 RNA聚合酶表达系统在大肠杆菌中实现了外源基因的高表达，同时具有作为一种简单、高效、特异性强的转录系统在不同生物体中应用的潜力。借助病毒基因是目前实现大肠杆菌和哺乳动物细胞高表达效率的策略，由于没有找到蓝藻自身的噬菌体，使得此策略无法在蓝藻中应用。
蓝藻属于革兰氏阴性菌，与大肠杆菌相似性较高。鱼腥藻7120与大肠杆菌基因组序列同源性77.91%，本课题组尝试借用大肠杆菌的pET表达系统思路，首先将T7 RNA聚合酶通过同源重组整合到鱼腥藻7120中，然后将T7启动子构建到表达载体pRL489中，以人粒细胞集落刺激因子(Human granulocyte colony-stimulating factor，hG-CSF)作为报告基因，构建蓝藻的T7表达体系。本课题组已于2014年将T7 RNA聚合酶整合到鱼腥藻PCC7120中，2015年有研究者在集胞藻PCC6803中构建了T7表达系统[13]。重组人粒细胞集落刺激因子是在大肠杆菌中表达最成功的几个重组蛋白药物之一，虽然其本身为糖蛋白，但无糖基的蛋白多肽基本保持了G-CSF的生物活性，且分子量较小，比较适合用原核生物来表达[14]。首个大肠杆菌表达的rh G-CSF药物由美国FDA于1991年批准上市。根据国家食品药品监督管理局网站2017年1月数据，中国陆续有18家制药企业获生产rhG-CSF。前期本实验室已经实现rhG-CSF在蓝藻中表达[7]，因此，此文中用其作为报告基因对构建的表达系统进行研究。
1 材料与方法1.1 质粒与菌株运载质粒pRL-489由美国密歇根大学Peter Wolk教授惠赠；pUC-G-CSF质粒由施定基课题组惠赠；pGEX质粒、pHSG398质粒、辅助质粒pRL-58和接合质粒RP4均由北京中医药大学生物制药系实验室保存，大肠杆菌E. coli BL21(DE3)、野生型鱼腥藻7120与转pRL-tac-GCSF鱼腥藻同由该实验室保存。
1.2 主要试剂BamHⅠ、EcoRⅠ、Hind Ⅲ等限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自纽英伦生物公司；PCR扩增酶、RT-PCR试剂盒、PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis kit试剂盒购自TaKaRa公司；氯霉素、卡那霉素等抗生素及引物合成与测序来自生工生物工程(上海)股份有限公司；质粒小量提取试剂盒、超纯RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、核酸Marker、小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体、β-actin鼠单克隆抗体、兔抗人G-CSF单抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG等购自北京拜尔迪；其他化学试剂均为国产分析纯。
1.3 Tac-T7 RNAP-CmR基因片段的获得Tac-T7 RNAP-CmR通过重叠PCR获得[15]。分别以pGEX质粒、BL21(DE3)基因组DNA、pHSG398质粒为模板，扩增Tac启动子基因、T7 RNA聚合酶基因以及氯霉素抗性基因(引物见表 1)，其中T7 RNA聚合酶基因首先通过一次引物重叠延伸PCR在C端添加6×His tag序列，将上述片段等量加入作为模板，通过重叠延伸PCR扩增出Tac-T7 RNAP-CmR片段，经TA克隆，获得pEASY-T1-Tac-T7 RNAP-CmR载体。
表 1 重叠延伸PCR引物序列Table 1 The sequence of the overlapping PCR primers
| Primer name | Sequence (5′-3′) | Size (bp) |
| pTacF | gagctgttgacaattaatcatcggct | 26 |
| pTacR | GTTAATCGTGTTCATctgtttcctgtgtgaaattgttatccg | 42 |
| pT7RNAP-F | tcacacaggaaacagATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACG | 43 |
| pT7RNAP-R | TTACGCGAACGCGAAGTCC | 19 |
| pT7RNAP (His)-R | gaagtgatcttccgtTTAATGGTGATGGTGATGATGCGC | 39 |
| pCmR-F | CACCATCACCATTAAacggaagatcacttcgcagaataaataaatc | 46 |
| pCmR-R | ttacgccccgccctg | 15 |
| All capital letters in the sequences indicate specific binding sequence, and lowercase letters represent 30 bp homologous sequence. | ||
表选项
1.4 定点整合载体的构建定点整合载体通过酶切连接的方法获得[16]。CTAB法提取鱼腥藻基因组DNA为模板[17]，分别以引物对pF1-F/R、pF2-F/R进行PCR，扩增得到同源臂F1、F2片段，TA克隆后获得克隆载体pMD19-T-F1、pEASY-T3-F2，克隆载体经测序鉴定正确后待用。使用Hind Ⅲ与SacⅠ双酶切pEASY-T1-Tac-T7 RNAP-CmR与pMD19-T-F1克隆载体，分别回收7 517 bp与1 143 bp条带，T4 DNA连接酶连接，连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞，涂布于氨苄抗性的LB琼脂平板，菌落PCR方法筛选阳性克隆，引物使用pF1-F/R，扩大培养阳性克隆，提取质粒，质粒命名为pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR；NotⅠ单酶切此质粒与pEASY-T3-F2质粒，分别回收8 690 bp与1 175 bp条带，连接、转化、菌落鉴定，引物使用pCmR-F、pF2-R，扩大培养阳性克隆，提取质粒，质粒命名为pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2；酶切连接流程如图 1所示。
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| 图 1 定点整合载体的构建流程图 Fig. 1 The schematic illustration of constructing the site-specific integration vector. |
| 图选项 |
1.5 含T7启动子hG-CSF基因的扩增由北京合生基因生物公司通过人工化学方法合成T7-hG-CSF基因片段。片段含19 bp的T7启动子、47 bp的T7终止子、556 bp的SD-hG-CSF基因，其中G-CSF基因序列源于施定基课题组工作[18]，同时对空载体pRL489进行酶切位点分析，EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切可以去掉空载体原有PpsbA启动子。首尾分别添加EcoRⅠ和BamHⅠ位点，合成的全基因长678 bp，获得克隆载体T5-T7-hG-CSF。
1.6 穿梭表达载体的构建穿梭表达载体pRL-T7-hG-CSF通过酶切连接的方法获得[16]。EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pRL489与T5-T7-hG-CSF，分别回收各自酶切片段，T4 DNA连接酶4 ℃连接过夜，连接产物转化E. coli HB101感受态细胞，涂布于卡那抗性的LB琼脂平板，菌落PCR筛选阳性克隆，引物使用pG-CSF-F、pG-CSF-R，扩大培养阳性克隆，提取质粒经测序验证后保存。
1.7 蓝藻的转化与筛选1.7.1 转T7 RNA聚合酶鱼腥藻的构建采用电击转化法[19]。(1)将等同10 μg叶绿素a当量的对数生长期鱼腥藻细胞悬浮于1.3 mL的电穿孔缓冲液中，该缓冲液含有10 mmol/L HEPES、50 mmol/L CaCl2和100 mmol/L LiCl，pH 7.5，并在28 ℃光照下培养1 h。(2)定点整合载体pEASY-F1-Tac-T7 RNAP-Cm-F2进行Hind Ⅲ限制性内切酶单酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收线性整合载体DNA。(3)用1 μg线性定点整合载体在1 200 V (6 kV/cm)电压下，在电穿孔器中的3 mL反应杯中用5 ms脉冲进行鱼腥藻的电穿孔。(4)电穿孔后用等量的2×BG11培养基混合，28 ℃培养24 h后将培养物均匀涂布于纤维素酯微孔滤膜，在含有氯霉素的平板上培养并逐步提高抗生素浓度，直至转基因藻平板出现阳性克隆而野生藻死亡。
1.7.2 转完整T7表达体系鱼腥藻的构建采用三亲接合转移法[5]。(1) E. coli的准备：在含有相应抗生素的LB培养液中，分别接种含穿梭表达载体pRL-T7-hG-CSF和辅助质粒的HB101菌，37 ℃过夜培养，离心收集沉淀，等体积混合后重悬于LB培养液中。(2)蓝藻的准备：三亲接合转移前更换新鲜培养液，离心收集野生藻与含T7 RNA聚合酶转基因藻，洗涤后重悬于BG11培养液中，并作梯度稀释。(3)接合转移：将藻细胞与细菌以适当的比例混合均匀，涂布于纤维酯微孔滤膜上，先在不含抗生素的培养平板上培养，然后连膜转移至含卡那霉素或卡那霉素和氯霉素的培养基上继续照光培养，每周更换一次平板，并逐步提高抗生素浓度，直至转基因藻平板出现阳性克隆而野生藻死亡。
1.8 转基因鱼腥藻的检测采用PCR[20]、RT-PCR[21]、Western blotting[22]等分子检测的方法进行转基因藻的检测。(1) PCR检测：CTAB法提取转基因鱼腥藻基因组DNA为模板，用引物pT7RNAP-F、pT7RNAP-R进行PCR扩增，检测转基因鱼腥藻中T7 RNA聚合酶基因的存在；SDS碱裂解法提取转基因鱼腥藻质粒DNA为模板，用引物pG-CSF-F、pG-CSF-R进行PCR扩增，检测转基因鱼腥藻中hG-CSF基因的存在。(2) RT-PCR检测：超纯RNA提取试剂盒法提取转基因鱼腥藻RNA，使用TaKaRa的PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。以合成的cDNA为模板，用引物pT7RNAP-F、pT7RNAP-R进行PCR扩增，检测转基因鱼腥藻中T7 RNA聚合酶基因的转录；用引物pG-CSF-F、pG-CSF-R进行PCR扩增，检测转基因鱼腥藻中hG-CSF基因的转录。(3) Western blotting检测：在处于对数生长期的鱼腥藻中加入诱导剂IPTG至终浓度0.5 mmol/L，28 ℃、140 r/min培养7 d，离心收集藻细胞并充分洗涤，将藻细胞重悬于PBS缓冲液中反复超声破碎冻融，离心取上清液；采用BCA法测定上清液蛋白浓度[23]。上清液进行10% SDS-PAGE分析[24]，用半干转电泳仪电转硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭液4 ℃过夜，洗膜3次，加入小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体(1:5 000)，37 ℃结合2 h，洗膜3次；加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1:5 000)，37 ℃结合2 h，选用全自动化学发光检测仪显色，检测转基因鱼腥藻中T7 RNA聚合酶基因的表达；上清液进行12% SDS-PAGE[24]，转膜，封闭，洗膜后加入兔抗人G-CSF单抗(1:5 000)，37 ℃结合2 h，洗膜3次；加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1:5 000)，37 ℃结合2 h，显色，检测转基因鱼腥藻中hG-CSF基因的表达。蓝藻中外源基因T7 RNA聚合酶基因与hG-CSF基因表达产物的检测均选用β-actin作为内参蛋白。
2 结果与分析2.1 质粒的构建2.1.1 Tac-T7 RNAP-CmR基因片段的获得由图 2A-C显示获得了Tac启动子基因、T7 RNA聚合酶基因、氯霉素抗性基因的PCR产物，经重叠延伸PCR方法得到Tac-T7 RNAP-CmR基因片段，结果如图 2D所示。
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| 图 2 Tac-T7 RNAP-CmR基因片段的获得 Fig. 2 The acquisition of Tac-T7 RNAP-CmR gene sequences. (A) The acquisition of Tac promoter gene sequence. M: 100 bp DNA ladder; 1: PCR product of Tac promoter. (B) The acquisition of T7 RNA polymerase with 6×His tag gene sequence. M: 1 kb DNA ladder; 1: PCR product of T7 RNA polymerase; 2: PCR product of T7 RNA polymerase with 6×His tag. (C) The acquisition of chloramphenicol resistant gene sequence. M: DNA marker Ⅳ; 1: PCR product of chloramphenicol resistant gene. (D) The acquisition of Tac-T7 RNAP-CmR gene sequence. M: 1 kb DNA ladder; 1: gene of Tac-T7 RNAP-CmR by overlap PCR. |
| 图选项 |
2.1.2 定点整合载体的构建与鉴定定点整合载体由克隆载体pMD19-T-F1、pEASY-T3-F2、pEASY-T1-Tac-T7 RNAP-CmR酶切、连接、筛选获得。图 3A为5′同源臂F1及3′同源臂F2的PCR结果，其分别来源于鱼腥藻PCC7120基因组中asl2383和all2384之间的非编码序列，长度均为1 111 bp。图 3B、3C、3D分别为克隆载体pMD19-T-F1、pEASY-T3-F2、pEASY-T1-Tac-T7 RNAP-CmR各自酶切结果。最终获得载体pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2如图 3E所示，长度为9 865 bp，为了进一步验证载体的正确性，图 3F为最终获得定点整合载体经SacⅠ/ApaⅠ与Hind Ⅲ/ApaⅠ双酶切结果，酶切结果显示载体构建成功。所有克隆载体经测序鉴定，序列完全正确。
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| 图 3 定点整合载体pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2的构建与鉴定 Fig. 3 The construction and identification of the site-specific integration vector pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2. (A) The acquisition of homologous arms. M: 1 kb DNA ladder; 1: PCR product of homologous arm F1; 2: PCR product of homologous arm F2. (B) The acquisition of homologous arm F1 with restriction enzyme site. M: 1 kb DNA ladder; 1: pMD19-T-F1 digested by Hind Ⅲ and SacⅠ. (C) The acquisition of homologous arm F2 with restriction enzyme site. M: 1 kb DNA ladder; 1: pEASY-T3-F2 digested by NotⅠ. (D) The acquisition of the linearized plasmid pEASY-T1- Tac-T7RNAP-CmR. M: 1 kb DNA ladder; 1: pEASY-T1-Tac-T7RNAP-CmR digested by Hind Ⅲ andSacⅠ. (E) The acquisition of the site-specific integration vector pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2. M: 1 kb DNA ladder; 1: The recombinant plasmid pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2. (F) The identification of the site-specific integration vector pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2. M: 1 kb DNA ladder; 1: pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2 digested by SacⅠ and ApaⅠ; 2: pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2 digested by Hind Ⅲ and ApaⅠ. |
| 图选项 |
2.1.3 穿梭表达载体的构建与鉴定穿梭表达载体pRL-T7-hG-CSF由克隆载体T5-T7-hG-CSF与空载体pRL489经酶切、连接、筛选获得；提取阳性克隆质粒进行EcoRⅠ/ BamHⅠ双酶切鉴定，在700 bp左右获得目的条带，结果如图 4所示，显示获得正确的载体。
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| 图 4 穿梭表达载体pRL-T7-hG-CSF的构建与鉴定 Fig. 4 The construction and identification of the shuttle expression vector pRL-T7-hG-CSF. (A) The acquisition of T7-hG-CSF gene fragment with restriction enzyme site. M: 1 kb DNA ladder; 1: T5-T7-hG-CSF; 2: T5-T7- hG-CSF digested by EcoRⅠand BamHⅠ. (B) The acquisition of the linearized plasmid pRL489. M: 1 kb DNA ladder; 1: pRL489 digested by EcoRⅠ and BamHⅠ; 2: pRL489. (C) The acquisition and identification of the shuttle expression vector pRL-T7-hG-CSF. m: 100 bp DNA ladder; M: 1 kb DNA ladder; 1: the recombinant plasmid pRL-T7-hG-CSF; 2: pRL-T7-hG-CSF digested by EcoRⅠand BamHⅠ. |
| 图选项 |
2.2 转基因鱼腥藻的筛选与检测2.2.1 转T7 RNA聚合酶鱼腥藻的筛选与检测两周后，含定点整合载体的转基因藻在氯霉素抗性的BG11固体培养基上长出单藻落，而野生藻在氯霉素压力下死亡，将获得的单藻落转移至含有氯霉素的BG11液体培养基进行筛选和扩大培养，经多次不加抗生素继代培养，再用氯霉素筛选，转基因藻仍生长良好(图 5A)所示，表明pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2已稳定整合于鱼腥藻基因组。PCR检测结果如图 5B所示，转基因鱼腥藻中含有T7 RNA聚合酶基因，而野生型鱼腥藻没有得到有效扩增，表明T7 RNA聚合酶基因已成功转入鱼腥藻7120；RT-PCR检测结果如图 5C所示，在转基因鱼腥藻中含有T7 RNA聚合酶基因的转录产物，表明转基因鱼腥藻中T7 RNA聚合酶基因已成功转录；图 5D为Western blotting结果，在略小于100 kDa的位置，转基因藻诱导组出现明显有异于未诱导组及野生组的条带，与理论分子量相符，故可认为T7 RNA聚合酶基因已在转基因鱼腥藻中成功表达。
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| 图 5 转T7 RNA聚合酶鱼腥藻的筛选与检测 Fig. 5 The screening and identification of the transgenic Anabaena sp. PCC7120 harboring T7 RNA polymerase. (A) Resistance screening of transgenic algae. 1: Anabaena 7120; 2: Anabaena 7120 harboring T7 RNA polymerase. (B) PCR identification of transgenic algae. M: 1 kb DNA ladder; 1: negative control; 2: positive control; 3-6: cloned genome from Anabaena 7120 harboring T7 RNA polymerase; 7: cloned Anabaena 7120 genome. (C) RT-PCR detection of transgenic algae. M: 1 kb DNA ladder; 1: negative control; 2: positive control; 3-6: cloned cDNA from Anabaena 7120 harboring T7 RNA polymerase; 7: cloned Anabaena 7120 cDNA. (D) Western blotting detection of transgenic algae. M: protein marker; 1: Anabaena 7120; 2-4: Anabaena 7120 harboring T7 RNA polymerase and 3, 4 with IPTG. |
| 图选项 |
2.2.2 转完整T7表达体系鱼腥藻的筛选与检测两周后，经pRL-T7-hG-CSF转化的野生藻和含T7 RNA聚合酶的转基因藻均在膜上长出菌落，而未加质粒的野生藻在抗生素压力下死亡。将单藻落转移至含有卡那霉素或氯霉素和卡那霉素的BG11液体培养基进行筛选和扩大培养，经多次不加抗生素继代培养，再用抗生素筛选，转pRL-T7-hG-CSF的鱼腥藻仍生长良好，如图 6A所示，获得了转T7-hG-CSF鱼腥藻与转完整T7表达体系鱼腥藻。经PCR检测结果如图 6B所示，在转T7-hG-CSF鱼腥藻与转完整T7表达体系鱼腥藻中均含有hG-CSF基因，而野生藻没有得到有效扩增，表明hG-CSF基因已成功转入野生藻与含T7 RNA聚合酶的转基因藻；RT-PCR检测结果如图 6C所示，在转T7-hG-CSF鱼腥藻与转完整T7表达体系鱼腥藻中均含有hG-CSF基因的转录产物，结果表明转T7-hG-CSF鱼腥藻与转完整T7表达体系鱼腥藻中hG-CSF基因已成功转录；图 6D为Western blotting结果，在19 kDa的位置，转完整T7表达体系鱼腥藻IPTG诱导组与转pRL-tac-GCSF鱼腥藻IPTG诱导组异于未诱导组及野生组出现明显条带，同时转T7-hG-CSF鱼腥藻组未出现条带。故可认为hG-CSF基因已在转完整T7表达体系鱼腥藻中成功表达，且表达含量远高于转T7-hG-CSF鱼腥藻组，利用Western blotting结果经条带灰度值的相对分析，表达量比传统方法提高2倍。
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| 图 6 转完整T7表达体系鱼腥藻的筛选与鉴定 Fig. 6 The screening and identification of the transgenic Anabaena sp. PCC7120 harboring complete T7 expression system. (A) Resistance screening of transgenic algae. 1: Anabaena 7120; 2: Anabaena 7120 harboring T7-hG-CSF; 3: Anabaena 7120 harboring complete T7 expression system. (B) PCR identification of transgenic algae. M: 100 bp DNA ladder; 1: positive control; 2-3: cloned plasmid from Anabaena 7120 harboring T7-hG-CSF; 4-5: cloned plasmid from Anabaena 7120 harboring complete T7 expression system; 6: cloned Anabaena 7120 genome; 7: negative control. (C) RT-PCR detection of transgenic algae. M: 100 bp DNA ladder; 1: positive control; 2-3: cloned cDNA from Anabaena 7120 harboring T7-hG-CSF; 4-5: cloned cDNA from Anabaena 7120 harboring complete T7 expression system; 6: cloned Anabaena 7120 cDNA; 7: negative control. (D) Western blotting detection of transgenic algae. M: protein marker; 1: Anabaena 7120; 2-3: Anabaena 7120 harboring T7-hG-CSF and 3 with IPTG; 4-5: Anabaena 7120 harboring complete T7 expression system and 5 with IPTG; 6-7: Anabaena 7120 harboring pRL-tac-GCSF and 7 with IPTG. |
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3 讨论蓝藻是藻类中最早能稳定地表达外源基因的种类，从1970年报道外源DNA可以转化进入蓝藻，1973年证明蓝藻中含有质粒，1981年首次在蓝藻中表达外源基因(抗菌素抗性基因)成功，1988年蓝藻形成稳定的基因转化体系，到1996年集胞藻6803作为第一个光合生物完成全基因组测序，至今已经有30多种外源基因在蓝藻中表达成功，主要用于制备重组药物、治理环境污染、农药生产等方面。然而从外源基因首次表达成功到现在已经快40年，至今国内外尚无工业化的产品，蓝藻基因工程仍存在较多问题需要解决[25]。Andrew Hitchcock等提出了3个努力方向：(1)提高无需标记的基因组改造的速度和效率，例如通过优化基于CRISPR的技术实现。(2)开发新的表达外源基因的系统，如制造新的复制穿梭质粒。(3)对引入的外源基因簇的表达实现更严格的调控，以提高突变藻株的长期稳定性。因此，高效的外源基因表达工具仍然是目前蓝藻基因工程需要研究的重要环节之一。本研究在鱼腥藻7120中构建了T7 RNAP/T7-hG-CSF表达体系。Jin等[26]曾经将T7 RNAP/T7 GFP基因回路成功引入单细胞集胞藻6803中，实现了绿色荧光蛋白的高表达。在此我们使用hG-CSF重组药物基因作为报告基因，构建了含有T7噬菌体转录相关调控原件的表达载体pRL-T7-hG-CSF，与表达T7 RNA聚合酶的定点整合载体pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2组成T7 RNAP/T7启动子共表达体系，从而将T7 RNAP/T7-hG-CSF引入丝状体鱼腥藻7120中，PCR实验和测序证明了基因整合入蓝藻，RT-PCR实验证明外源基因实现了转录，蛋白印迹实验结果表明目的蛋白得到翻译和表达，结果证明了T7 RNAP/T7-hG-CSF共表达体系可以在鱼腥藻7120中正常工作，且有效表达目的基因，与本课题组前期构建的转pRL-tac-GCSF鱼腥藻相比较，经多次实验验证，G-CSF表达量至少提高了2倍。
原核pET表达系统也曾被研究用于解决真核表达系统低效的问题，Fuerst等[27]在Hela细胞中构建了基于两种重组痘苗病毒组成的T7表达系统，一种含有受痘苗启动子控制的T7 RNA聚合酶基因，另一种含有T7启动子和终止子调控元件的靶基因，其中感染两种病毒的细胞表达靶基因效率比以前的病毒质粒系统高14倍。袁志刚等[28]将T7 RNAP/启动子原核表达系统引入C2C12、SP2/0、NIH3T3、BALB/c3T3四种不同来源的真核细胞中，实现了目的基因表达，且在C2C12细胞株中，共转染pCMV-T7pol/pT7IRES-HBs双质粒的细胞株相比较共转染pCMV-T7pol/pT7-HBs双质粒细胞株表达效率提高4倍。本研究虽然在蓝藻中实现了T7系统表达外源基因，但表达效率相比较其他宿主细胞中T7表达体系的应用仍然较低，分析其原因，可能与T7 RNA聚合酶的表达量有关。有实验表明[26]，使用强启动子驱动T7 RNA聚合酶对细胞有毒性甚至致死，但通过融合蛋白降解标签控制藻细胞中T7 RNA聚合酶积累的水平后T7表达体系正常工作，因此，在后续的改进研究中可以在使用强启动子驱动T7 RNA聚合酶表达时，通过添加蛋白降解标签或在SD序列前补加核糖开关来控制T7 RNA聚合酶的积累或表达。早期研究表明[29] T7启动子中的突变会影响启动子强度，在集胞藻6803中[26]，4个T7启动子突变体的强度相差20倍，所以在鱼腥藻7120中研究最适T7启动子突变体也非常重要。
目前，蓝藻虽然已开发大量遗传工具用于表达外源基因，但其表达效率与经典底盘细胞大肠杆菌相比还有很大差距，在新的蓝藻遗传工具开发方面仍需加强研究力度。
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