, 杨利敏2 1. 沈阳农业大学，辽宁 沈阳 110866;
2. 中国科学院微生物研究所 病原微生物与免疫学重点实验室，北京 100101;
3. 中国科学院大学，北京 100049;
4. 中国科学院微生物研究所 生物安全三级实验室，北京 100101;
5. 安徽大学，安徽 合肥 230601
收稿日期：2020-03-12；接收日期：2020-04-09；网络出版时间：2020-04-23
基金项目：国家重点研发计划(Nos. 2018YFC1200602，2018YFC1200502)，国家科技重大专项(Nos. 2016ZX10004222-006，2018ZX10734-404)资助
摘要：登革病毒(Dengue virus，DENV)是全球传播最为广泛的虫媒病毒，由于缺乏快速鉴别感染病毒血清型的诊断技术，导致异型交叉感染引起重症登革出血热病例居高不下。为实现免疫学方法快速鉴别诊断不同血清型DENV感染，本研究采用哺乳动物细胞293T表达并纯化了4种DENV血清型NS1蛋白，免疫小鼠后通过杂交瘤技术制备了针对NS1蛋白的单克隆抗体。利用酶联免疫吸附方法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence assay，IFA)、免疫斑点杂交试验(Dot blotting)以及蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)确认所制备的单克隆抗体能够有效识别天然病毒NS1以及重组NS1蛋白。获得的单克隆抗体包含2株可识别1-4型DENV NS1蛋白的通用型抗体及3株分别针对DENV-1、DENV-2和DENV-4的血清型特异抗体。以所制备的DENV NS1抗体为基础，采用双抗体夹心ELISA可快速鉴别不同血清型DENV。DENV血清型特异单克隆抗体的制备和甄别DENV血清型ELISA方法的建立为快速鉴别感染DENV血清型的临床诊断奠定了基础。
关键词：登革病毒NS1蛋白单克隆抗体血清型特异
Development and characterization of serotype-specific monoclonal antibodies against Dengue virus NS1
Yang Liu1,2, Yuan Zhang2,5, Yanqiu Wei2, Xiaojuan Jia4, Qijun Chen1, Weijun Liu2,3
, Limin Yang2 1. Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning, China;
2. Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
4. The Biological Safety Level-3 (BSL-3) Laboratory of Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
5. Anhui University, Hefei 230601, Anhui, China
Received: March 12, 2020; Accepted: April 9, 2020; Published: April 23, 2020
Supported by: National Key Research and Development Program of China (Nos. 2018YFC1200602, 2018YFC1200502), National Key Technologies Research and Development Program of China (Nos. 2016ZX10004222-006, 2018ZX10734-404)
Corresponding author: Wenjun Liu. Tel: +86-10-64807497; E-mail: liuwj@im.ac.cn;
Limin Yang. Tel: +86-10-64807503; E-mail: lmyang@im.ac.cn.
Abstract: Dengue virus (DENV) is the most widely transmitted arbovirus in the world. Due to the lack of diagnostic technology to quickly identify the virus serotypes in patients, severe dengue hemorrhagic fever cases caused by repeated infections remain high. To realize the rapid differential diagnosis of different serotypes of DENV infection by immunological methods, in this study, four DENV serotype NS1 proteins were expressed and purified in mammalian cells. Monoclonal antibodies (MAbs) against NS1 protein were obtained by hybridoma technology after immunizing BALB/c mice. Enzyme-linked immunosorbent assay, indirect immunofluorescence assay, dot blotting, and Western blotting were used to confirm the reactivity of MAbs to viral native NS1 and recombinant NS1 protein. These MAbs include not only the universal antibodies that recognize all DENV 1-4 serotype NS1, but also serotype-specific antibodies against DENV-1, DENV-2 and DENV-4. Double antibody sandwich ELISA was established based on these antibodies, which can be used to achieve rapid differential diagnosis of serotypes of DENV infection. Preparation of DENV serotype-specific MAbs and establishment of an ELISA technology for identifying DENV serotypes has laid the foundation for the rapid diagnosis of DENV clinical infection.
Keywords: Dengue virusNS1 proteinmonoclonal antibodyserotype-specific
登革病毒(Dengue virus，DENV)属于黄病毒科黄病毒属，通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播，是世界上传播最广泛的虫媒病毒之一[1-3]。病毒在热带及亚热带地区广泛流行，据统计约128个国家和地区感染过DENV，且每年约3.9亿人被感染[4-5]。随着经济全球化进程的推进、旅游业规模的不断扩张以及全球气候变暖的影响，埃及伊蚊或白纹伊蚊的宜居地不断扩大，感染DENV的区域和人群数量也在逐年攀升[6]。由于缺乏理想的抗病毒药物以及疫苗，登革热成为东南亚旅行者感染的主要疾病之一，已经被世界卫生组织视为热带及亚热带地区的重大公共卫生问题[7-9]。
DENV是单股正链RNA病毒。根据抗原性差异可分为4种血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4)，其中2型流行最广泛[10]。初期感染DENV后可能引起典型登革热(Dengue fever，DF)症状，如发烧、头痛、斑丘疹和淋巴结肿大，在免疫力良好的状态下，通常可以治愈。在某些特殊情况下，如二次异型感染或儿童老人免疫低下时可导致登革出血热(Dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克综合征(Dengue shock syndrome，DSS)[11-12]。初次感染者会对所感染的对应血清型病毒产生终身免疫力[13]，但DENV存在“抗体依赖性感染增强” (Antibody-dependent enhancement，ADE)机制，造成早期感染过DENV，继发感染异种血清型病毒时更容易引起重症登革热[14-16]。并且90%的重症登革热受害者大都是15岁以下的儿童，这给家庭和社会造成了巨大的心理和经济负担[17]。
DENV基因组编码3种结构蛋白，即包膜蛋白(Envelope，E)、膜蛋白(Membrane，M)和衣壳蛋白(Capsid，C)以及7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。NS1是非结构蛋白中唯一可以分泌到胞外的糖蛋白，是DENV重要的致病因子，在基因组复制、病毒组装以及免疫逃逸中均发挥重要作用[18]。研究证明感染后发病第一天即可在血清中检测到NS1，因此NS1被用作检测DENV感染的最重要靶标[19]。考虑到ADE反应，针对二次感染患者，尽早确认所感染的病毒血清型，制定治疗方案，对于防止出现重症登革出血热具有重要意义。目前已上市的DENV血清学检测产品均无法区分所感染的病毒血清型，尽管荧光定量PCR产品可以区分，但由于能够开展荧光PCR检测的实验室仅局限于少数高级别医院，而登革热高发区域多处于不发达地区。免疫学检测技术，如ELISA、胶体金免疫层析技术(Immune colloidal gold technique，GICT)等，具有成本低廉且便于操作的优势，因此能够区分病毒血清型的免疫学检测技术更适合当前的实际需求。
本研究采用293T细胞表达1-4型DENV NS1重组蛋白，经亲和层析纯化后免疫BALB/c小鼠，制备了多株抗DENV-NS1通用型及血清特异型单克隆抗体。我们首次筛选到3株能够特异识别单一血清型的抗体，基于这些抗体的ELISA方法能够有效鉴别感染DENV的血清型，为感染后快速确认临床治疗方案和进一步研究NS1的功能奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 质粒、病毒和蛋白白纹伊蚊细胞C6/36细胞、人肾上皮细胞HEK293T细胞、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞、真核表达载体pcDNA3.1质粒均由本实验室保存，4种血清型DENV毒株由本实验室保存，分别为Dengue virus 1 Nauru/West Pac/1974，P17763；Dengue virus 2 Puerto Rico/PR159-S1/1969，P12823；Dengue virus 3 Singapore/8120/1995，Q5UB51；Dengue virus 4 Thailand/0348/1991，Q2YHF0。黄热病毒(Yellow fever virus，YFV)、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)、西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)、蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus，TBEV)和日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)重组NS1蛋白由本实验室制备并保存(分别含有5个病毒NS1编码基因的原核表达质粒pET-32a/YFVNS1 (GenBank:JX949181)、pET-32a/ZIKVNS1 (GenBank:KX266255.1)、pET-32a/WNVNS1 (GenBank:JX015523.1)、pET-32a/TBEVNS1 (GenBank:KJ922515)、pET-32a/JEVNS1 (GenBank: NC_001437.1)，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达、镍离子金属螯合亲和层析获得)。
1.1.2 主要试剂DMEM细胞培养基、RPMI 1640细胞培养基、胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)均为美国Gibco公司产品；大肠埃希菌TOP10感受态细胞为本实验室保存；限制性内切酶NotⅠ、XbaⅠ及T4 DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司；TMB底物显色液、质粒大提试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；LinKineTM HRP偶联试剂盒购自武汉艾美捷公司；96孔酶标板购自上海源叶生物科技有限公司；Protein A亲和层析柱、Ni-NTA His Bind Resin购自北京全式金生物技术有限公司；辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗鼠IgG购自达科为生物技术有限公司；小鼠抗6×His标签单克隆抗体购自北京博奥瑞京科技发展有限公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。
1.1.3 实验动物6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。
1.1.4 细胞及病毒培养复苏C6/36细胞，在含有10% FBS 1640培养基中，28 ℃、5% CO2培养箱中培养。待长成单层细胞后，分别接种4种血清型DENV，吸附1 h后，弃去培养基，换至含1% FBS RPMI 1640培养基继续培养，4-5 d后细胞病变达顶峰时，反复冻融后收集病毒液，-80 ℃保存备用。复苏293T细胞，在含有10% FBS DMEM细胞培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养至对数期。
1.2 实验方法1.2.1 真核表达载体的构建与表达DENV的4种血清型NS1蛋白基因序列(DENV-1，GenBank: KX452065.1；DENV-2，GenBank: KX452045；DENV-3，GenBank: AB189127.1；DENV-4，GenBank: AY858049.1)，序列经密码子优化并在C端加入6×His标签后由苏州金唯智生物科技有限公司进行人工合成。四种目的基因再经NotⅠ/XbaⅠ双酶切后克隆至具有相同酶切位点的pcDNA3.1载体，构建重组表达载体。转化TOP10感受态细胞，涂板后，挑取单菌落进行菌液PCR及双酶切进行鉴定。将经鉴定结果为阳性的送至北京博迈德生物技术有限公司进行测序。测序结果正确的质粒采用脂质体转染法，分别瞬时转染至对数期生长的293T细胞中(Lipofectamine 2000与质粒混合物，2.5 μL/μg)，进行少量表达并验证，同时设转染pcDNA3.1空白质粒的细胞为阴性对照。转染48 h后，使用小鼠抗6×His标签单克隆抗体对转染的重组表达质粒进行Western blotting鉴定。
1.2.2 1-4型DENV重组NS1蛋白的制备将正确表达的质粒分别转染293T细胞进行大量表达，以收获蛋白。细胞转染72 h后，细胞破碎后1 300 r/min离心10 min去除细胞沉淀，经0.22 μm滤膜过滤并使用10 kDa超滤浓缩管进行浓缩。通过AKTA FPLC蛋白层析仪先后进行镍离子金属螯合层析及Superdex 75分子筛层析纯化，收集目标蛋白峰，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。
1.2.3 小鼠免疫纯化后的DENV 1-4型重组NS1蛋白等量混合后作为免疫原，以60 μg/每只的剂量与弗氏佐剂乳化注射到6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠背颈部皮下多点区域，接种6只小鼠。每2周加强免疫一次，共免疫4次，第四次免疫后7 d，小鼠尾尖采少量血，通过间接ELISA测定免疫小鼠效价，对抗体效价最高的小鼠进行冲击免疫，腹腔注射免疫原，100 μg/每只。3 d后，小鼠断颈处死取脾细胞。
1.2.4 杂交瘤细胞的融合与筛选将脾细胞与SP2/0细胞以1︰5的比例采用PEG法进行融合。融合后细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养。期间通过间接ELISA方法对挑选的克隆进行多次筛选，直至筛选出阳性结果。
1.2.5 DENV NS1单克隆抗体制备与鉴定将筛选到的阳性克隆细胞在10% FBS 1640培养基、37 ℃、5% CO2培养箱中大量培养。待细胞生成至对数期时进行细胞计数，以106/只、0.5 mL/只的剂量腹腔注射到被石蜡致敏的小鼠中，待小鼠腹部膨大时收获腹水。利用Protein A亲和层析柱纯化腹水得到单抗，SDS-PAGE鉴定单抗纯度。
1.2.6 间接ELISA用包被液分别稀释1-4型重组DENV-NS1蛋白、黄热病毒NS1蛋白、寨卡病毒NS1蛋白、西尼罗病毒NS1蛋白、蜱传脑炎病毒NS1蛋白、日本脑炎病毒NS1蛋白，使其终浓度为2 μg /mL，100 μL/孔，4 ℃，过夜包被；洗液PBST洗涤3次；3% BSA封闭液封闭，200 μL/孔；37 ℃温箱孵育2 h；洗液PBST洗涤3次；一抗(抗NS1单抗)、阴性对照(未免疫小鼠血清)，均为100 μL/孔，37 ℃温箱孵育1 h；用洗液PBST洗涤3次；山羊抗鼠IgG作为二抗(1︰5 000)，100 μL/孔，37 ℃温箱孵育1 h；洗液PBST洗涤3次；显色液TMB 100 μL/孔，避光显色10 min左右，最后每孔加入50 μL终止液进行终止。酶标仪读取450 nm处吸收值。
1.2.7 间接免疫荧光试验将C6/36细胞铺至24孔板中，约12 h后细胞密度达到80%后感染1-4型DENV，同时设置未感染细胞作为空白对照。待细胞出现轻微病变后，用预冷的(-20 ℃) 4%多聚甲醛室温固定10 min；用PBST洗3遍；5% BSA，37 ℃，封闭1 h；加入一抗(纯化后腹水) 5 μg/mL，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h；PBST洗3遍；避光加入FITC标记的羊抗鼠IgG (1︰5 000)，37 ℃避光孵育1 h；用PBST洗3遍后(注意避光)在荧光显微镜下检测。
1.2.8 蛋白免疫印迹试验将制备的1-4型重组DENV-NS1蛋白经SDS-PAGE后转至PVDF膜后在含有1% BSA、5%脱脂奶粉的TBST中室温封闭2 h。制备的DENV单抗(1:1 000)作为一抗4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次10 min。辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG作为二抗(1:5 000)室温孵育45 min，TBST洗3次，每次10 min，最后使用底物显色试剂盒显影。
1.2.9 斑点杂交试验C6/36细胞感染1-4型DENV，同时设置未感染细胞作为空白对照。待病变后加入裂解缓冲液收集病毒液，并将其滴在硝酸纤维素膜上，静置2 min后至1% BSA封闭2 min。在含有一抗、二抗混合液(DENV单抗作为一抗1:1 000，HRP标记山羊抗鼠IgG作为二抗1:5 000)中孵育10 min，用TBST洗3次，每次2 min，最后使用底物显色试剂盒显影。
1.2.10 双抗体夹心ELISA检测感染血清以筛选获得的通用型单抗包被酶标板，将通用型和血清型特异单抗标记辣根过氧化物酶，具体标记方法参照产品说明书(LinKineTM HRP试剂盒)，分别建立可检测4种血清型DENV和可特异检测DENV-1、DENV-2和DENV-4的双抗体夹心ELISA方法。采集分别感染4种血清型DENV后3 d的免疫缺陷小鼠AG129血清以及未感染病毒的对照小鼠血清，用RT-PCR鉴定阳性后，用建立的ELISA方法进行鉴定。
2 结果与分析2.1 1-4型DENV重组质粒构建及表达四种血清型的DENV NS1蛋白编码基因人工合成后克隆至真核载体pcDNA3.1，构建重组表达质粒。对构建成功的4种质粒pcDNA3.1-NS1- DENV1、pcDNA3.1-NS1-DENV2、pcDNA3.1-NS1- DENV3、pcDNA3.1-NS1-DENV4以及对照空载体pcDNA3.1分别转染293T细胞后，对细胞总蛋白进行Western blotting表达验证，结果(图 1)显示，转染4种重组质粒的293T细胞在48 kDa处有一条特异性条带，与DENV的NS1蛋白大小一致。然而转染空载体pcDNA3.1的293T细胞(Control)没有条带。表明构建的4种质粒均已正确表达。
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| 图 1 Western blotting检测4种重组质粒在293T细胞中表达 Fig. 1 Western blotting analysis of the expression of four recombinant plasmids in 293T cells. |
| 图选项 |
2.2 1-4型DENV重组NS1蛋白纯化将4个正确表达质粒分别转染293T细胞进行大量表达后，收集并离心得300 mL细胞上清，浓缩后经亲和层析和分子筛层析纯化，获得纯化的目的蛋白。蛋白经SDS-PAGE (图 2)验证，结果显示目的蛋白在48 kDa有表达，且条带单一，与预期大小一致。
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| 图 2 四种血清型DENV纯化重组NS1蛋白SDS- PAGE鉴定 Fig. 2 Identification of the purified recombinant NS1 proteins of DENV 1-4 by SDS-PAGE. |
| 图选项 |
2.3 DENV NS1单克隆抗体制备小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养。期间通过间接ELISA方法对挑选的克隆进行多次筛选，共筛选出30株阳性杂交瘤细胞株，优选其中5株进行后续试验，分别是1A3、3E9、10D8、12C2、13B11。然后将这些阳性克隆细胞培养至对数期后注射到小鼠腹腔制备腹水。利用Protein A亲和层析柱对腹水进行纯化，经SDS-PAGE鉴定，结果显示，纯化后单抗均表现为2条蛋白条带，分子量大小分别为48 kDa和25 kDa，与抗体的重链和轻链大小相符合(图 3)。
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| 图 3 SDS-PAGE鉴定5株纯化DENV NS1单抗 Fig. 3 Identification of five purified MAbs against DENV-NS1 by SDS-PAGE. |
| 图选项 |
2.4 单克隆抗体效价及特异性验证以梯度稀释的纯化抗体和未免疫小鼠血清分别作为一抗，利用间接ELISA方法测定单克隆抗体效价。结果显示，抗体1A3和3E9对1-4型DENV NS1蛋白均有较高的反应性，抗体效价均达到1︰640 000；抗体12C2只针对DENV-1型NS1蛋白有较高的反应性，抗体效价达到1︰320 000；抗体13B11只针对DENV-2型NS1蛋白有较高的反应性，抗体效价达到1︰640 000；抗体10D8只针对DENV-4型NS1蛋白有较高的反应性，抗体效价达到1︰640 000 (图 4)。并且结果显示，制备的单抗与其他黄病毒属病毒寨卡病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒NS1蛋白均无交叉反应，表明制备的抗体对DENV具有良好的特异性。
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| 图 4 间接ELISA鉴定5株单抗特异性 Fig. 4 Binding of MAbs to diverse flaviviruses rNS1 proteins determined by indirect ELISA. A variety of rNS1 of DENV 1-4, ZIKV, YFV, WNV, TBEV, JEV were coated separately, and then confirmed their response to MAbs (1A3, 3E9, 10D8, 12C2 and 13B11). These MAbs showed specificity for reactivity to DENV rNS1 only. |
| 图选项 |
除此之外，通过蛋白质免疫印迹试验(重组蛋白) (图 5)以及蛋白免疫斑点杂交试验(天然病毒蛋白) (图 6)来验证单克隆抗体的特异性。结果显示，1A3、3E9抗体对1-4型DENV病毒蛋白均有反应，12C2抗体只针对DENV-1型病毒蛋白有特异性，13B11抗体只针对DENV-2型病毒蛋白有特异性，10D8抗体只针对DENV-4型病毒蛋白有特异性，与间接ELISA试验结果一致，证明了获得的单抗可以特异识别天然及重组靶蛋白。
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| 图 5 Western blotting鉴定4种血清型DENV重组NS1蛋白与5株单抗的特异性结合 Fig. 5 Binding of MAbs to rNS1 proteins of DENV 1-4 determined by Western blotting. M: protein molecular weight marker; 1: purified rNS1 protein of DENV-1; 2: purified rNS1 protein of DENV-2; 3: purified rNS1 protein of DENV-3; 4: purified rNS1 protein of DENV-4. |
| 图选项 |
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| 图 6 斑点杂交试验鉴定4种血清型DENV天然病毒蛋白NS1与5株单抗的特异性结合 Fig. 6 Binding of MAbs to native NS1 proteins of DENV 1-4 determined by dot blotting to determine the reactivity of five purified MAbs to supernatants from DENV-1-4-infected C6/36 cells. |
| 图选项 |
2.5 间接免疫荧光试验间接免疫荧光试验(IFA)结果显示，制备的单抗可与感染DENV的C6/36细胞产生特异性反应，在细胞浆中有明显的红色荧光(图 7)。其中抗体1A3和3E9对1-4型DENV均有较高的活性；抗体12C2只针对DENV-1型有较高的活性；抗体13B11只针对DENV-2型有较高的活性；抗体10D8只针对DENV-4型有较高的活性；而未感染病毒的对照组均未出现红色荧光，表明这5种单抗能够与天然病毒蛋白结合。
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| 图 7 间接免疫荧光鉴定5株单抗与感染1-4型DENV的C6/36细胞的反应 Fig. 7 Indirect immunofluorescence assays of C6/36 cells infected by the DENV 1-4 with anti-NS1 MAbs. 1A3 and 3E9 exhibited reactivity to all of the DENV1-4 infected C6/36 cells, while 12C2, 13B11 and 10D8 had specific reactivity to DENV 1, DENV 2 and DENV 4, respectively. |
| 图选项 |
2.6 双抗体夹心ELISA鉴别不同血清型DENV感染将制备的单抗建立了可检测DNEV NS1的通用型(1A3包被，3E9标记)和血清型特异(DENV-1：1A3包被，12C2标记；DENV-2：1A3包被，13B11标记；DENV-4：1A3包被，10D8标记)双抗体夹心ELISA方法，对4种血清型DENV感染血清进行了检测，结果显示，4种血清型DENV感染血清均可以被通用型ELISA检出，其他3种ELISA均可以特异检出对应的感染血清，而未出现交叉反应(图 8)。
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| 图 8 双抗体夹心ELISA检测不同血清型DENV感染 Fig. 8 Double-antibody sandwich ELISA to detect different serotypes of DENV infection. |
| 图选项 |
3 讨论目前DENV感染区正在不断扩大，造成其住院率和死亡率仍在不断增加[20]，但没有理想登革热疫苗以及抗病毒药物，登革热感染的治疗仅是对症治疗，所以早期的快速诊断对于降低登革出血热和登革休克综合征的发病率和死亡率具有重要作用[21-23]。目前关于DENV的实验室检测方法基本有3种：病毒分离、核酸扩增技术以及检测DENV抗原或者抗体的血清学免疫检测方法。病毒分离是检测DENV感染最经典的诊断方法，但该方法不仅需要专业的操作人员和实验室，而且病毒分离的时间也较长，因此达不到快速检测的目的。PCR核酸扩增技术具体高灵敏和特异性，能够有效区分不同感染病毒血清型，但只能由少量高等级的具有专门仪器设备的实验室和经过培训的人员来开展，无法满足DENV流行区域基础医疗的需求，特别是在一些登革热流行资源匮乏的地区。血清学免疫检测方法较PCR技术相比成本低廉、检测通量高且易开展临床检测，更适合DENV高发区实际情况的需求。但是目前已有的血清学免疫检测技术均无法对感染病毒的血清型进行鉴别，考虑到二次感染患者有可能出现的重症登革热风险，一种能够快速对患者体内感染的DENV的血清型进行鉴别诊断，对治疗方案的确立及防止病患进入重症具有至关重要的意义[24]。
感染者体内NS1蛋白是DENV唯一可进入血液循环的非结构蛋白，是早期诊断的重要指标，也已被部分研究者用作制备疫苗的重要靶点[21, 25]。在DENV的检测手段中基于NS1蛋白建立的检测方法成为关键趋势[26]。NS1蛋白高度保守但同时也存在少量差异序列，这使得我们通过制备针对这些差异区段的单抗，即可获得区分不同登革热血清型的特异单抗，为后续开发登革热血清型鉴别产品提供可能。由于NS1蛋白为糖蛋白，为获得与天然病毒NS1蛋白更接近的重组蛋白，本研究利用293T细胞表达纯化了1-4型DENV-NS1，此表达体系可使蛋白进行翻译后修饰，即NS1蛋白正确折叠并进行糖基化修饰，这样使其更加接近于天然病毒蛋白的真实形态。再利用此重组蛋白免疫小鼠制备NS1抗体，得到的抗体也更易于识别天然病毒蛋白。经过细胞融合和筛选，共得到5种可识别DENV-NS1蛋白的杂交瘤细胞株。经过间接ELISA、IFA、DB以及WB鉴定，发现这5种抗体均可特异性识别DENV NS1，其中制备的单克隆抗体1A3和3E9可识别DENV 1-4型NS1，即DENV通用型抗体；抗体12C2只识别DENV-1型NS1，抗体13B11只识别DENV-2型NS1，抗体10D8只识别DENV-4型NS1，即DENV血清型特异型抗体。基于这些抗体建立的ELISA方法可有效区分不同血清型DENV感染的阳性血清。
综上，本研究总共制备了5株抗DENV NS1蛋白的单克隆抗体，均具有较高的特异性和敏感性。抗DENV NS1蛋白的单克隆抗体的成功制备不仅为后续血清型鉴别技术的研究提供材料，也为抗DENV药物及疫苗研发奠定了重要基础。在后续的研究中我们将利用这些单抗研制DENV血清型鉴别检测试纸条，用于快速甄别感染病毒血清型，以降低重症登革出血热风险。
参考文献
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