1. 河南科技大学 医学院,河南 洛阳 471023;
2. 新乡医学院 医学检验学院,河南 新乡 453003
收稿日期:2020-03-18;接收日期:2020-05-19
基金项目:国家自然科学基金(No. 81770140),河南省自然科学基金(No. 162300410226),河南省科技攻关项目(No. 182102410079)资助
摘要:近年来,质谱技术在膜蛋白结构与功能研究中被广泛应用。由于膜蛋白的跨膜结构域含有大量疏水性氨基酸,常常导致液质串联质谱检测的序列覆盖率较低,从而限制了质谱技术在膜蛋白结构与功能研究中的应用。文中利用人的整合膜蛋白维生素K环氧化物还原酶为模型,优化胶内消化条件,建立了一种稳定提高膜蛋白质谱序列覆盖率的糜蛋白酶胶内消化方法。通过探索钙离子浓度、pH值和缓冲体系对序列覆盖率、检测特异肽段的总数和类型以及特异肽段大小的影响,发现在5-10 mmol/L钙离子浓度、pH 8.0-8.5的Tris-HCl缓冲液中,可以兼顾序列覆盖率和肽段的多样性。该方法可以使膜蛋白的质谱覆盖率达到80%以上,将在膜蛋白结构与功能、膜蛋白相互作用位点的鉴定以及膜蛋白与小分子药物结合位点的鉴定等研究中具有广泛的应用价值。
关键词:膜蛋白胶内消化序列覆盖率糜蛋白酶液质串联质谱维生素K环氧化物还原酶膜蛋白结构
An in-gel digestion method of chymotrypsin to improve sequence coverage of membrane protein by mass spectrometry
Hongli Liu1, Yan Shen1, Wenwen Gao1, Haichuan Yu2, Shoumin Xi1, Guomin Shen1
1. College of Medicine, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, Henan, China;
2. School of Medical Laboratory, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, Henan, China
Received: March 18, 2020; Accepted: May 19, 2020
Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81770140), Natural Science Foundation of Henan Province, China (No. 162300410226), Scientific and Technological Projects in Henan Province, China (No. 182102410079)
Corresponding author: Shoumin Xi. Tel: +86-379-64252715; E-mail: xishoumin1968@163.com;
Guomin Shen. Tel: +86-379-64830345; E-mail: shenba433@163.com.
Abstract: In recent years, mass spectrometry has been widely used to study membrane protein structure and function. However, the application of mass spectrometry to study integral membrane protein is limited because there are many hydrophobic amino acids in the trans-membrane domain of integral membrane protein to cause low sequence coverage detected by LC-MS/MS. Therefore, we used vitamin K epoxide reductase (VKORC1), a human integral membrane protein, as a model to optimize the digestion conditions of chymotrypsin, and developed an in-gel digestion method of chymotrypsin to improve sequence coverage of membrane protein by mass spectrometry. By exploring the effects of calcium concentration, pH value and buffer system on the percentage of sequence coverage, number of total detected and types of unique peptide, and the size of unique peptide, sequence coverage and peptide diversity could be considered under condition of Tris-HCl buffer with 5-10 mmol/L calcium ion concentration and pH value 8.0-8.5. This method could make the sequence coverage of membrane protein to reach more than 80%. It could be widely used in the study of membrane protein structure and function, identification of interaction site between membrane proteins, and identification of binding site between membrane protein and small molecular drug.
Keywords: membrane proteinin-gel digestionsequence coveragechymotrypsinLC-MS/MSvitamin K epoxide reductasemembrane protein structure
质谱技术是研究蛋白质的常用技术,在蛋白质鉴定、蛋白质定量、蛋白质组学、蛋白质翻译后修饰、蛋白与蛋白相互作用等方面有广泛的应用[1-5]。近年来,质谱技术与其他方法结合广泛应用于探测蛋白质三维结构的研究。通过化学交联,将蛋白质中空间相近但序列相距较远的部分连接起来,就可以推断出蛋白结构的信息[6]。激光诱导共价标记技术被用于研究蛋白质的折叠[7]。氨基酸残基的化学标记技术用于研究蛋白质构象变化以及小分子化合物结合位点的鉴定[8-9]。氢-氘交换质谱用于研究蛋白质结构已有20多年,利用氢-氘交换的速率和程度推测蛋白质高级结构及非共价结合物的作用位点,该方法还适用于研究蛋白质结构的动力学性质[10]。整合膜蛋白在调节细胞与细胞外环境之间的通讯方面起着关键的调节作用,现在临床用药有50%以上作用靶点是膜蛋白[9]。据估计,人类基因组中编码膜蛋白的基因占20%-30%[11]。因此,质谱技术在膜蛋白结构的研究中具有广泛的应用价值。
在对膜蛋白结构与功能、膜蛋白相互作用位点的鉴定以及膜蛋白与小分子药物结合位点的研究中[7-9],需要达到较高的蛋白序列覆盖率,但目前存在一定的技术瓶颈。由于膜蛋白酶切消化困难、疏水肽段从跨膜结构域中的回收和分离困难等,这严重影响了质谱技术在膜蛋白结构与功能等研究中的应用[12]。在一些研究中,通过结合多种方法,可以对一些膜蛋白达到较高的序列覆盖率,但这些方法步骤繁琐、耗时、耗力[13-15]。本研究以人维生素K环氧化物还原酶(VKORC1)蛋白为研究模型,摸索出一个糜蛋白酶的胶内消化方法,该方法结合串联质谱技术可以显著提高整合膜蛋白的序列覆盖率,将有助于提高质谱技术在膜蛋白结构与功能研究中的应用。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 膜蛋白人VKORC1蛋白和人维生素K环氧化物还原酶1的同源蛋白(VKORC1L1)按文献方法[8, 16]从稳定表达细胞系中纯化。重组表达的人葡萄糖转运体4 (rGLUT4)蛋白和重组表达的细菌4-羟基苯甲酸八异戊烯基转移酶(rUBIA)蛋白由圣路易斯华盛顿大学Li Weikai实验室馈赠。
1.1.2 试剂与耗材三乙基碳酸氢铵(TEAB)缓冲液、氯化钙、NEM、Tris-base、三(2-羧乙基)膦(TECP)和色谱级乙腈、甲醇、甲酸购自Sigma公司;表面活性剂RapiGest SF购自Waters公司;测序级糜蛋白酶购自Promega公司;0.5 mL的蛋白质低亲和力离心管购自Eppendorf公司。
1.1.3 仪器液质串联质谱(LC-MS/MS)的配置:Eksigent 2D nano LC Eksigent (二维纳升液相色谱仪)分离酶解的肽段,Thermo LTQ Orbitrap XL质谱检测仪(或更好的质谱仪)检测多肽段。低温离心机,37 ℃恒温水浴锅。
1.2 方法1.2.1 糜蛋白酶胶内消化方法(1) 切胶:SDS-PAGE胶用考马斯亮蓝染色,切目的蛋白条带,把凝胶切成约0.5 mm3的小块,转移胶块到0.5 mL的蛋白质低亲和力的收集管中,加入300 μL的去离子水;(2)吸取去离子水,加入350 μL质谱级的乙腈,在室温孵育10 min,待凝胶收缩成小块,12 000×g离心1 min后去除液体;重复该步骤1次;之后静置10-20 min使其干燥;(3)加入100 μL TECP溶液(5 mmol/L TECP,50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5),12 000×g离心1 min,56 ℃孵育30 min;室温冷却,吸去TECP溶液,重复步骤(2);(4)加入150 μL NEM溶液(10 mmol/L NEM,50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5),封闭自由的半胱氨酸,12 000×g离心1 min,室温孵育60 min;吸去NEM溶液,重复步骤(2);(5)加入350 μL胶块脱色液(等体积100 mmol/L pH 8.5的TEAB缓冲液和乙腈),4 ℃在混合仪上混合30 min,12 000×g离心1 min,吸去液体;重复该步骤3-5次;最后1次,4 ℃在混合仪上混合过夜脱色;第二天,12 000×g离心1 min,吸去液体,重复步骤(2);(6)加入适量体积(70-150 μL)的糜蛋白酶消化液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,0.02 μg/μL糜蛋白酶,10 mmol/L氯化钙,0.1% RapiGest)覆盖胶块,12 000×g离心1 min,在冰上放置30 min;后再加入30 μL糜蛋白酶消化缓冲液(0.1% RapiGest,10 mmol/L氯化钙,50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)覆盖胶块,再在冰上放置30 min (注:在本步骤进行优化条件,比如改变Tris-HCl缓冲液的pH值,改变钙离子浓度,改变缓冲液为TEAB缓冲体系);(7)用研磨杵在离心管中碾碎胶块,12 000×g离心1 min后,在37 ℃水浴中过夜消化;(8)加质谱级的甲酸终止消化,终浓度为1% (V/V),充分涡旋,12 000×g离心1 min,37 ℃水浴中孵育30 min;(9) 20 000×g离心15 min,吸取10 μL转移到蛋白质低亲和力的收集管中,之后加1 μL质谱级的甲酸,混匀,用于LC-MS/MS分析(注:如样品不能立即分析,可放置于-80 ℃保存)。
1.2.2 LC-MS/MS参数设定Eksigent 2D nano-LC Eksigent系统和Thermo LTQ Orbitrap XL质谱检测仪用于对糜蛋白酶水解的肽段进行LC-MS/MS分析。质谱分析参数按文献方法[1]进行。首先,消化的样品先上样至C18的Trap柱上(Acclaim PepMap100,100 μm×2 cm,5 μm,100 ?)进行脱盐处理,流速为4.5 μL/min,时间为10 min,流动相为0.1%的甲酸水溶液;然后串联至C18的反相色谱柱(0.007 5 mm×180 mm,5 μm,200 ?)进行肽段的分离,其中流动相A相为0.1%甲酸水溶液,B相为含0.1%甲酸的乙腈溶液,流速为260 nL/min,0-5 min设定梯度为0-10% B相的梯度分离液,5-100 min设定梯度为10%-40% B相的梯度分离液。在高质量分辨率(50 000)下获得洗脱肽段的质谱图(m/z范围350-2 000),选取7个丰度最强的肽段离子进行串联质谱分析(MS/MS),不限制检测肽段离子的带电荷数。
1.2.3 对质谱数据进行肽段搜索质谱数据用Matrix Science公司的Mascot数据库进行蛋白鉴定和肽段搜索。搜索条件:无酶解特异性,可变蛋白修饰包括蛋氨酸氧化,半胱氨酸NEM修饰,半胱氨酸NEM修饰+水。
2 结果与分析2.1 人VKORC1蛋白的纯化人VKORC1蛋白是含有163个氨基酸残基,4个跨膜结构域,分子量约20 kDa的整合膜蛋白(图 1A),其跨膜结构域占总序列的52%。在稳定细胞系293TRex-VKORC1细胞中表达VKORC1蛋白,用Anti-Flag亲和柱纯化蛋白,之后进行还原的SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色,切取目的条带(图 1B),用于糜蛋白酶胶内消化。
图 1 人VKORC1蛋白 Fig. 1 Human VKORC1 protein. (A) Topology model of human VKORC1. (B) Reduced SDS-PAGE of affinity purified human VKORC1. |
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2.2 钙离子对糜蛋白酶消化VKORC1的影响为了探索钙离子浓度对糜蛋白酶消化膜蛋白的影响,本实验只改变1.2.1胶内消化步骤(6)中的钙离子浓度。在不同钙离子浓度下,糜蛋白酶对VKORC1序列的覆盖范围有一定的影响(图 2A),但对其序列覆盖率基本没有影响,都可以达到80%以上(图 2B)。该结果提示,在不同钙离子浓度下,糜蛋白酶对蛋白的酶切位点可能有一定的影响。进而我们分析了不同钙离子浓度对检测到特异肽段的总次数、类型和长度的影响,发现在5 mmol/L钙离子浓度下,检测到特异肽段的总次数最高,大约是不加钙离子条件下的3倍(图 3A);在10 mmol/L钙离子浓度下,检测到肽段类型最多,大约是不加钙离子条件下的2倍(图 3A);在2.5-20.0 mmol/L钙离子浓度范围下,可以获得较短的特异肽段,但无钙离子的条件下检测到肽段的长度明显更长些(图 3B)。这些结果提示一定浓度的钙离子可能增加糜蛋白酶的非特异酶切活性,进而增加了对蛋白的酶切位点。综上所述,5-10 mmol/L的钙离子浓度范围是糜蛋白酶消化膜蛋白获得较多特异肽段的总次数和肽段类型的最适条件。
图 2 钙离子对糜蛋白酶消化VKORC1的序列覆盖的影响 Fig. 2 Effect of calcium ion on sequence coverage of VKORC1 digested by chymotrypsin. (A) Sequence coverage of VKORC1 at different calcium ion concentrations. (B) Percentage of sequence coverage VKORC1 at different calcium ion concentrations. |
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图 3 不同钙离子浓度下糜蛋白酶消化VKORC1的肽段特征 Fig. 3 Peptides feature of VKORC1 digested by chymotrypsin under different calcium concentrations. (A) Total detected number and types of unique peptides. (B) Size distribution of unique peptides. |
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2.3 不同pH值对糜蛋白酶消化VKORC1的影响为了探索pH值对糜蛋白酶消化膜蛋白的影响,本实验只改变1.2.1胶内消化步骤(6)糜蛋白酶消化液中Tris-HCl缓冲液的pH值。我们发现不同pH值对糜蛋白酶消化VKORC1的覆盖范围(图 4A)和序列覆盖率(图 4B)基本没有影响,提示在不同pH值条件下糜蛋白酶对蛋白消化的模式变化不大。通过分析不同pH值条件对检测到特异肽段的总次数、类型和长度的影响,我们发现在pH 8.0-9.0的范围内,随着pH值增加,检测到特异肽段的总次数和类型都逐渐减少(图 5A),但对特异肽段的长度无明显变化(图 5B)。这些结果提示在pH 8.0-9.0的范围内,pH值可能主要影响糜蛋白酶对蛋白的消化效率,但对酶切模式影响不大,因而pH 8.0-8.5的范围是较适宜的糜蛋白酶消化条件。
图 4 pH值对糜蛋白酶消化VKORC1的序列覆盖的影响 Fig. 4 Effect of pH values on sequence coverage of VKORC1 digested by chymotrypsin. (A) Sequence coverage of VKORC1 at different pH values. (B) Percentage of sequence coverage VKORC1 at different pH values. |
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图 5 不同pH值中糜蛋白酶消化VKORC1的肽段特征 Fig. 5 Peptides feature of VKORC1 digested by chymotrypsin under different pH values. (A) Total detected number and types of unique peptides. (B) Size distribution of unique peptides. |
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2.4 TEAB缓冲液对糜蛋白酶消化VKORC1的影响为了探索TEAB缓冲液对糜蛋白酶消化膜蛋白的影响,本实验把1.2.1胶内消化步骤(6)中糜蛋白酶消化液和缓冲液中的Tris-HCl缓冲液改为100 mmol/L、pH 8.5的TEAB缓冲液。我们把TEAB缓冲液的消化结果与2.2中10 mmol/L钙离子的消化结果进行比较,发现两种条件下的序列覆盖范围(图 6A)基本没有影响,但在TEAB缓冲液条件下检测到特异肽段的总次数和类型均较少(图 6B);此外,发现在TEAB缓冲液中检测到特异肽段的长度要长一些(图 6C)。该结果提示TEAB缓冲液和Tris-HCl缓冲液对糜蛋白酶消化VKORC1的模式可能不同。由于TEAB可以和钙离子反应生成碳酸钙沉淀,从而降低了该缓冲液中的钙离子浓度,这可能是TEAB缓冲液影响糜蛋白酶消化的主要原因。
图 6 TEAB缓冲液对糜蛋白酶消化VKORC1的影响 Fig. 6 Effect of TEAB buffer on VKORC1 digested by chymotrypsin. (A) Sequence coverage of VKORC1 digested by chymotrypsin in TEAB buffer. (B) Total number and types of unique peptides. (C) Size distribution of unique peptides. |
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2.5 糜蛋白酶胶内消化方法在其他整合膜蛋白中的应用为了检验该酶切方法的适用性,我们选择了3个整合膜蛋白VKORC1L1、rUBIA和rGLUT4进行胶内消化和分析。在Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)和10 mmol/L氯化钙的条件下进行消化。VKORC1L1、rUBIA和rGLUT4的序列覆盖率分别为80%、89%和94%,均在80%以上(图 7A)。分析3种蛋白检测到特异肽段的总次数,VKORC1L1、rUBIA和rGLUT4的结果分别为465、1 035和1 980;分析3种蛋白检测到特异肽段的类型(图 7B),VKORC1L1、rUBIA和rGLUT4的结果分别为51、152和289 (图 7B)。结果表明检测到的特异肽段的总数和类型呈正相关。VKORC1L1、rUBIA和rGLUT4氨基酸残基数分别为176、303和552,结果表明检测到的特异肽段的总数和类型与氨基酸残基数呈正相关,这也说明该方法中糜蛋白酶对膜蛋白具有稳定的消化效果。
图 7 糜蛋白酶消化VKORC1L1、rUBIA和rGLUT4的结果 Fig. 7 Results of VKORC1L1, rUBIA and rGLUT4 digested by chymotrypsin. (A) Sequence coverage of VKORC1L1, rUBIA and rGLUT4 digested by chymotrypsin. (B) Total detected number and types of unique peptides. |
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3 结论膜蛋白在多种生命活动中发挥重要作用,是药物研发的重要靶点。近年来,质谱技术在研究膜蛋白结构与功能方面具有广泛的应用。由于膜蛋白的跨膜结构域含有大量疏水性氨基酸,常常导致质谱检测的序列覆盖率较低,从而限制了质谱技术在膜蛋白结构与功能研究中的应用。本研究以糜蛋白酶对膜蛋白VKORC1进行胶内消化为模型,探索在不同钙离子浓度、pH值和缓冲体系的条件下,对样品质谱分析数据的序列覆盖范围、序列覆盖率、检测到特异肽段的总数、类型以及大小的影响,进而建立了一种稳定提高膜蛋白质谱序列覆盖率的胶内消化方法。该方法选择Tris-HCl缓冲液,最适pH值在8.0至8.5的范围,最适钙离子浓度为5-10 mmol/L。该方法不仅可以获得较高的序列覆盖率,还可以获得较多的肽段类型,为膜蛋白结构和功能的研究提供更多的分析选择。该方法将在膜蛋白结构与功能、膜蛋白相互作用以及膜蛋白与小分子药物相互作用等研究方面具有广泛的应用价值。
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