兰州大学 生物化学与分子生物学实验室，甘肃 兰州 730000
收稿日期：2017-10-20;接收日期：2018-02-26; 网络出版时间：2018-04-25 基金项目：国家自然科学基金(No. 21272107)，甘肃科技支撑计划资助
摘要：构建随机ssDNA文库，通过SELEX技术，以正常、炎性宫颈脱落细胞为反筛细胞，以上皮内低级别病变(CIN1)、上皮内高级别病变(CIN2、CIN3)和鳞状细胞癌脱落细胞为正筛细胞，经过12轮筛选特异性适配子高度富集得到宫颈癌前病变适配子库，经特异性、亲和力分析和细胞免疫荧光确立高特异性适配子CIN-Ap4可作为诊断宫颈癌前病变生物标志物，为宫颈癌前病变分子诊断奠定理论基础，提供新思路。利用Prime Premier 5.0设计构建了随机ssDNA文库并根据文库两端固定序列设计引物，对对称PCR和间接不对称PCR中的退火温度、循环数以及上、下游引物浓度比等条件进行优化，分析确定50 μL反应体系中对称PCR的最佳反应条件为：最佳退火温度为49.5 ℃，最佳循环数为15个循环；间接不对称PCR的最佳反应条件为：50 μL反应体系中上、下游引物浓度的最佳比例为80:1，最佳循环数为35个循环。实验结果表明成功构建了寡核苷酸文库，在最适PCR条件下可获得理想的dsDNA和ssDNA，并具有良好的重复性，为顺利筛选适配子提供保证。
关键词：宫颈癌前病变 指数式富集的配体系统进化技术 生物标志物 PCR条件优化
Selection of DNA aptamers to cervical intraepithelial neoplasia by SELEX
Wenhui Li*, Dalin Shi*, Ruhan Jia, Jing Yang, Yanyan Zhang, Wei Chen, Yuewu Han
Biochemistry and Molecular Biology Laboratory, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu, China
Received: October 20, 2017; Accepted: February 26, 2018; Published: April 25, 2018
Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21272107), Science-Technology Support Plan Projects of Gansu Province
Corresponding author:Yuewu Han. Tel: +86-931-8915023; E-mail: hanyuewu730000@163.com
*These authors contributed equally to this study.
Abstract: An in vitro synthesized random ssDNA library was subjected to 12 rounds of selection against anti-screening cells and sieving cells by SELEX. Normal and inflammatory cervical exfoliation cells were selected as anti-screening cells, and the cervical exfoliation cells of low-grade squamous intraepithelial lesion (CIN1), high-grade squamous intraepithelial lesion (CIN2, CIN3) and cervical carcinoma were selected as sieving cells during the screening process. Then, the highly specific aptamer CIN-Ap4 was established by the analysis of the specificity, affinity and cell immunofluorescence, which can be used as biomarker for Cervical Intraepithelial Neoplasia. Prime Premier 5.0 was applied to design a random ssDNA library. According to the fixed sequence at both ends of the library, a pair of primers were designed and synthesized. At the same time, the optimal annealing temperature, cycle times and primer concentration ratio of PCR procedure were selected. The results under the optimal condition are shown as follows. In the 50 μL reaction system, the optimum reaction conditions of symmetry PCR are as follows: annealing temperature is 49.5 ℃, number of cycles is 15. The optimal reaction conditions of indirect asymmetric PCR are as follows: the primer concentration ratio is 80:1, and the number of cycles is 35. The experiment proves that the oligonucleotide library is constructed successfully, and the highly specific dsDNA and ssDNA can be obtained under optimal PCR conditions with good repeatability, which establishes the foundation for the further exploration and experimentation.
Key words: cervical intraepithelial neoplasia (CIN) systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) biomarker optimize of PCR conditions
世界卫生组织(WHO)公布，2012年全世界有超过50万的宫颈癌新发病例，其中超过85%的病例来自发展中国家。据全国肿瘤登记中心统计，2011年我国宫颈癌新发病例87 000人，死亡病例23 000人，近30年来宫颈癌发病率呈上升趋势，且发病高峰趋于年轻化。宫颈癌早期没有明显症状和体征，及早发现宫颈癌前病变，并通过治疗阻断癌前病变的发展，可最大程度降低宫颈癌的发生率，因此寻找宫颈癌前病变诊断的生物标志物具有重要意义。1990年Tuerk等[1]和Ellington等[2]分别报道了应用指数富集配体系统进化技术(Sysrematie evolution of ligands by exponential enriehmen，SELEX)筛选得到能与噬菌体T4 DNA聚合酶和有机染料特异性结合的RNA片段，并命名为“适配子”或“配体”[3]。该技术原理是利用大容量的随机单链寡核苷酸文库进行体外多轮筛选、扩增，并最终获得与非核酸靶分子高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸序列[4]。大容量的随机单链寡核苷酸文库进行体外多轮筛选适配体是折叠成特异性3D结构的具有高亲和力的单链DNA或RNA，能够特异性结合多肽、蛋白质[5]、细胞[6]乃至整个器官的靶分子[7-9]。另外，适配子在一些生理条件下，可通过反义寡核苷酸杂交使其失活，因此可以用于设计解毒剂[10]。近年来，随着研究的不断深入，越来越多实验结果表明相比于抗体，适配子具有更强的亲和力、热稳定性、靶标多样性、高特异性、可化学合成等优点[11-15]，可以代替抗体用于疾病的诊断、医药学和工业等领域[16]。本研究采用SELEX技术筛选宫颈癌前病变宫颈脱落细胞特异性适配子库[17-18]，并通过特异性、亲和力分析和细胞免疫荧光确立高特异性适配子，可作为宫颈癌前病变诊断标志物，为宫颈癌前病变分子诊断奠定理论基础，提供新思路。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样本实验所用样本均取自液基薄层细胞检测结果为：正常、炎性、上皮内低级别病变(CIN1)上皮内高级别病变(CIN2、CIN3)和鳞状细胞癌宫颈脱落细胞，所有样本由甘肃迪安同享医学检验中心提供。
1.1.2 随机ssDNA文库及引物由Prime Premier 5.0软件设计随机ssDNA文库及引物(表 1)[19]，随机ssDNA文库5′端和3′端均为18个碱基固定序列，中间N (54)为54个碱基随机序列。上游引物P1与ssDNA文库5′端固定序列相同，下游引物P2与ssDNA文库3′端固定序列互补，同时合成5′端FITC荧光标记的上游引物P3。上述均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表 1 随机ssDNA文库及引物序列Table 1 Sequences of random ssDNA library and primer
| Name | Sequence (5'–3') |
| Random ssDNA library | TAGATTGCACTTACTATC-N(54) -ATTGAATAAGCTGGTATA |
| Primer1 | TAGATTGCACTTACTATC |
| Primer2 | TATACCAGCTTATTCAAT |
| Primer3 | FITC-TAGATTGCACTTACTATC |
表选项
1.2 方法1.2.1 PCR扩增反应条件优化经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定随机ssDNA文库及引物是否构建成功并确定其条带位置，同时确定dsDNA条带的位置，作为后续实验PCR产物目的条带的参考标准。
以50 μL反应体系(模板、引物各2 μL，2×PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 19 μL)进行PCR扩增(95 ℃变性30 s，退火1 min，72 ℃延伸30 s)，经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，ImageJ作灰度分析，确定对称PCR最佳退火温度及循环次数[20-22]、间接不对称PCR扩增反应最佳循环数及最佳上下游引物浓度比[23]。
1.2.2 适配子库筛选参照文献采用SELEX技术进行适配子筛选[24]。筛选过程如下：
① 细胞预处理：脱落细胞经磷酸盐缓冲液洗涤数次后用120目钢滤过滤，细胞计数板计数，冻存于–80 ℃超低温冰箱。每次实验取出细胞冻存管放置37 ℃水浴锅1 min，离心收集细胞。②ssDNA文库预处理：取ssDNA文库加入500 μL结合缓冲液，沸水浴5 min，冰浴10 min。③筛选：向预处理的ssDNA文库中加入15 μL 3% BSA以降低非特异性吸附，将其与阴性细胞(正常、炎性) 37 ℃孵育结合，离心取上清，收集与反筛细胞不结合的核酸。再将收集的核酸与阳性细胞(上皮内低级别病变(CIN1)、上皮内高级别病变(CIN2、CIN3)和鳞状细胞癌) 37 ℃孵育结合，离心取沉淀，加入洗涤缓冲液洗涤以弃去未与细胞结合的核酸，再加入200 μL洗脱缓冲液，离心取上清，收集得到与正筛细胞结合的核酸。④次级文库获得：收集到的核酸经苯酚:氯仿:异戊醇法纯化后，经间接不对称PCR扩增、回收单链作为下一轮筛选的次级文库。⑤测定结合率：以每轮筛选获得的次级文库为模板进行间接不对称PCR扩增，扩增得到荧光素标记的ssDNA。取200 pmol荧光修饰的ssDNA和1 000 μL结合缓冲液，沸水浴5 min，冰浴10 min；分别与2×106个/mL阴性细胞、阳性细胞37 ℃孵育结合30 min，荧光分光光度计测定总荧光强度；回收细胞悬液离心后用洗涤缓冲液洗涤3次，重悬于1 000 μL结合缓冲液中，荧光分光光度计测定荧光强度值，测3次取平均值；不加荧光修饰的ssDNA为空白对照。根据ssDNA文库与细胞结合率=荧光强度平均值/总荧光值×100%，分别计算各轮筛选获得的次级文库与阳性细胞及阴性细胞的结合率判断筛选进度。⑥整个筛选过程通过不断增加筛选压力，如减少加入的ssDNA量、减少孵育时间、增加洗涤次数，以获得高亲和力、高特异性适配子库。经过10–12轮筛选，次级文库与靶细胞结合强度不再增加，达到平台期则筛选终止。筛选条件见表 2。⑦将最终获得的ssDNA核酸适配子库送生工生物工程(上海)股份有限公司克隆测序，运用DNAMAN软件进行一级结构同源性分析。
表 2 适配子各轮筛选条件Table 2 Screening conditions of aptamer
| Number | Cell (1×106/mL) | ssDNA(pmol) | Incubationtime (min) | Wash times (times) |
| 1 | 4.0 | 200 | 240 | 3 |
| 2 | 4.0 | 200 | 180 | 2 |
| 3 | 3.0 | 200 | 120 | 1 |
| 4 | 2.0 | 150 | 60 | 3 |
| 5 | 2.0 | 150 | 60 | 2 |
| 6 | 2.0 | 150 | 60 | 1 |
| 7 | 1.0 | 100 | 45 | 3 |
| 8 | 1.0 | 100 | 45 | 2 |
| 9 | 1.0 | 100 | 45 | 1 |
| 10 | 0.5 | 50 | 30 | 3 |
| 11 | 0.5 | 50 | 30 | 2 |
| 12 | 0.5 | 50 | 30 | 1 |
表选项
1.2.3 高特异性适配子确立测序后，选择长度正确且没有双峰的适配子，将其转化菌经培养、质粒抽提，制备荧光素标记的ssDNA。
1) 特异性测定：取200 pmol荧光素标记的适配子加入1 000 μL结合缓冲液，沸水浴5 min，冰浴10 min；分别与2×106个/mL阴性细胞、阳性细胞37 ℃孵育结合30 min，离心去上清，洗涤缓冲液洗涤3次，重悬于1 000 μL结合缓冲液中，测定荧光强度值，测3次取平均值。
2) 亲和力分析：制备不同浓度荧光素标记的适配子，取等体积适配子加入1 000 μL结合缓冲液，沸水浴5 min，冰浴10 min；分别与2×106个/mL阳性细胞37 ℃孵育结合30 min，离心去上清，洗涤缓冲液洗涤3次，重悬于1 000 μL结合缓冲液中，测定荧光强度值，测3次取平均值。根据公式Y=Bmax×X/ (Kd+X)，运用SigmaPlot 12.1软件，在非线性分析Regression Wizard公式类型中选择双曲线(Hyperbola)的类型，对数据进行分析，结合SPSS 16.0软件得出各适配子与宫颈癌前病变宫颈脱落细胞的平衡解离常数Kd值。
3) 细胞免疫荧光：根据特异性及亲和力分析结果确立高特异性适配子，进一步明确该适配子能够与子宫颈癌前病变宫颈脱落细胞特异性结合。分别取1×106个/mL阴性细胞、阳性细胞爬片后经4%多聚甲醛固定30 min，0.01 mol/L PBS洗涤3次，每次5 min；抗原修复液沸水浴10 min，0.01 mol/L PBS洗涤3次，每次5 min；1% Triton-X100通透10 min，倾去后加入10%正常山羊血清37 ℃恒温封闭30 min；倾去封闭液后加入荧光素标记的适配子(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)，4 ℃避光过夜；0.01 mol/L PBS洗涤3次，每次5 min；抗荧光衰减封片剂(含DAPI)封片后观察。
2 结果与分析2.1 PCR扩增反应条件优化结果以文库为模板，经对称PCR后得到90 bp的dsDNA目的条带，即ssDNA文库及引物构建成功。根据2%琼脂糖凝胶电泳鉴定(图 1)，确定对称PCR扩增反应最佳循环数为15个循环；最佳退火温度为49.5 ℃；间接不对称PCR扩增反应最佳循环数为35个循环；最佳上下游引物浓度比为80:1。
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| 图 1 PCR条件优化 Figure 1 Optimization of PCR conditions. (A) The verification result of random ssDNA library, primer and ssDNA PCR products. 1: random ssDNA library; 2?3: primer; 4: ssDNA PCR products. (B) Optimization of symmetry PCR conditions. A?H annealing temperature: 55, 54.5, 53.5, 51.7, 49.5, 47.8, 46.6, 46 ℃; 1?7 cycle times: 5, 8, 10, 12, 15, 20, 25. (C) Optimization of indirect asymm PCR conditions. A?D cycle times: 30, 35, 40, 45; 1?5 primer concentration ratio: 10:1, 30:1, 50:1, 80:1, 100:1. |
| 图选项 |
2.2 宫颈上皮内癌变宫颈脱落细胞SELEX筛选2.2.1 筛选条件筛选过程中，一方面加入BSA以封闭非特异性结合位点，去除非特异性结合从而提高筛选效率；另一方面，刚开始进行筛选时，如果ssDNA文库加入量过少会导致筛选失败，因此要以较多量的ssDNA和细胞进行前几轮筛选，随着筛选的进行要不断增加筛选压力(表 2)，使特异性的ssDNA能竞争结合在细胞膜表面的特异性物质上而特异性较弱的ssDNA被淘汰。
2.2.2 次级文库鉴定每轮筛选获得的次级文库经不对称PCR扩增ssDNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定(图 2)，可见90 nt目的片段ssDNA，满足筛选要求，可作为下轮筛选的文库。
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| 图 2 1–12轮筛选获得的ssDNA次级文库产物电泳图 Figure 2 2% agarose gel electrophoresis of ssDNA secondary library. M: marker; 1–12: ssDNA secondary library for each round. |
| 图选项 |
2.2.3 结合率测定在12轮筛选过程中，次级文库与阳性细胞的结合率从17%增加至75%；与阴性细胞的结合率从83%减少至19% (图 3)。随着筛选的进行，在第9轮后结合率基本稳定达到平台期，说明特异性高的适配子得到富集，即筛选结束。
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| 图 3 1–12轮ssDNA次级文库与宫颈脱落细胞荧光结合率 Figure 3 The combination rate of ssDNA secondary library and cervical exfoliation cells for 12 rounds. |
| 图选项 |
2.2.4 核酸适配子库克隆测序及一结构同源性分析随机挑选40个克隆子进行测序，结果发现大量重序列及2个错误序列，最终确定适配子库共有9条适配子序列(表 3)。DNAMAN 7.0软件进行一级结构同源性分析表明(图 4)所有序列无共同的保守序列，但CIN-Ap2、CIN-Ap3、CIN-Ap4和CIN-Ap9含有保守序列GGGAT，剩下的适配子无同源性，且无共有保守序列。
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| 图 4 适配子同源性比对结果 Figure 4 Homology comparison. |
| 图选项 |
表 3 适配子序列Table 3 Sequences of aptamers
| Name | Aptamer sequence (5′–3′) |
| CIN-Ap1 | TAGATTGCACTTACTATCCAACGGATAGTGAGGCGGTTATTAATCTGATGGTTACATCCCCGTAGTCGCACTATTGAATAAGCTGGTATA |
| CIN-Ap2 | TAGATTGCACTTACTATCCCGAAGGGATCACGATTAAAGGGCCTTGTCGTCCAATTCTGTACAGTAGCGTGGATTGAATAAGCTGGTATA |
| CIN-Ap3 | TAGATTGCACTTACTATCCCGAAGGGATCACGATTAAAGGGCCTTGTCGTCCAATTCTGTACAGTAGCGTTGATTGAATAAGCTGGTATA |
| CIN-Ap4 | TAGATTGCACTTACTATCCCAAGGGGATACCTCTCAAGCTGGTGTGTTTGTTATTATCGTCCTACAGTTTCCATTGAATAAGCTGGTATA |
| CIN-Ap5 | TAGATTGCACTTACTATCCAACGGATAGTGAGGCGGTTATTAATCTGATGATTACATCCCCGTAGTCGCACTATTGAATAAGCTGGTATA |
| CIN-Ap6 | TAGATTGCACTTACTATCCGGGAAGCGGATAGCGGATTACTTAGATTGAAGTGTATGCTAACGGGTTAATAGATTGAATAAGCTGGTATA |
| CIN-Ap7 | TAGATTGCACTTACTATCCCGAAGGGGTCACGATTAAAGGGCCTTGTCGTCCAATTCTGTACAGTAGCGTTGATTGAATAAGCTGGTATA |
| CIN-Ap8 | TAGATTGCACTTACTATCTCCACCAGCAGTACGAGCGCCGCACCTGACACCACGCACCTCGCCATCCCCGTAATTGAATAAGCTGGTATA |
| CIN-Ap9 | TAGATTGCACTTACTATCCCAAGGGGATACCTCTCAAGCTGGTGTGTTTGTTATTATCGTCCCACAGTTTCCATTGAATAAGCTGGTATA |
| The underlined sequence is the specific nucleic acid sequence of each aptamer. | |
表选项
2.3 高特异性适配子确立2.3.1 适配子特异性及亲和力分析9条适配子(除CIN-Ap1)与阳性细胞和阴性细胞结合力均具有极显著性差异(P < 0.01)，其中适配子CIN-Ap3、CIN-Ap4、CIN-Ap5、CIN-Ap6的特异性较高。拟合各适配子与阳性细胞的结合曲线，计算得到平衡解离常数Kd值。根据解离常数Kd值越小，亲和力越大，确定CIN-Ap4、CIN-Ap5具有较高的亲和力(图 5)。综合上述结果，最终确立CIN-Ap4作为子宫颈癌前病变宫颈脱落细胞高特异性适配子。
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| 图 5 适配子特异性及亲和力分析结果 Figure 5 Specificity and affinity analysis of aptamers. (A) Specific analysis. (B) Affinity analysis. |
| 图选项 |
2.3.2 适配子CIN-Ap4细胞免疫荧光采用细胞免疫荧光法进一步验证适配子CIN-Ap4与阳性细胞和阴性细胞结合力(图 6)，阳性细胞组荧光强度远高于阴性细胞组，说明所确立的适配子CIN-Ap4确实能够与子宫颈癌前病变宫颈脱落细胞高特异性结合，可作为子宫颈癌前病变诊断标志物，为宫颈癌前病变宫颈分子诊断提供理论基础和新思路。
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| 图 6 适配子CIN-Ap4细胞免疫荧光结果 Figure 6 Cell immunofluorescence of CIN-Ap4. |
| 图选项 |
3 讨论对称PCR和不对称PCR是实验过程的关键，对PCR反应条件进行优化，尤其对不对称PCR条件进行优化，是获得特异性和亲和力均较强的ssDNA适配子的核心。适配子的筛选过程就是不断重复PCR的过程，所以PCR是筛选适配子的关键。优化PCR条件可以降低非特异性扩增，得到高特异性、高纯度的PCR产物，为今后筛选目标物的适配子奠定一定的基础。但值得一提的是，我们发现在开始的几轮筛选过程中，对称PCR及不对称PCR均能获得较高特异的目的产物。但在后面的几轮筛选过程中，即使在优化的条件下，PCR非特异性产物增多。分析原因可能是筛选之初模板纯度高，所以PCR产物特异性高，但经过多轮筛选后模板纯度降低，故PCR产物特异性降低，尤其是不对称PCR要经过35个如此多的循环，非特异性产物会更多[25-26]，因此在筛选过程中可采用多次胶回收的方法以提高每一轮ssDNA纯度。
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