, 严小军11 宁波大学海洋学院 浙江省动物蛋白食品精深加工重点实验室 应用海洋生物技术教育部重点实验室，浙江 宁波 315211;
2 浙江易测环境科技有限公司，浙江 宁波 315194;
3 香飘飘食品股份有限公司，浙江 湖州 313000;
4 中国水稻研究所，浙江 杭州 311400
收稿日期：2017-09-01;接收日期：2018-02-21; 网络出版时间：2018-03-06 基金项目：国家海洋局海洋公益性行业重大科研专项(No. 201305013)，浙江省科技厅公益技术应用研究计划项目(No. 2017C33009)，宁波市科技局农业科技攻关项目(No. 2014C10034)资助
摘要：畜禽屠宰加工、鱼粉饲料加工等一些食品工业生产过程中会释放出大量的硫化氢恶臭气体，导致周边环境的严重污染。为实现以培养异养型细菌脱除硫化氢气体的目的，取分离到的异养脱硫细菌XJ-2，通过诱变筛选得到一株高效脱硫菌株ZJNB-B3，其脱硫率达97%。基于形态学研究、API 50 CHB生理生化鉴定及16S rRNA基因测序，鉴定该菌为蜡状芽胞杆菌Bacillus cereus ZJNB-B3。该菌GenBank登录号为MF679650。降解特性研究表明，ZJNB-B3菌株对有毒的硫化物有较高耐受性，耐受上限高达300 mg/L。采用响应面法优化环境因素对菌株降解硫化物效率的影响，得到在最适培养温度30 ℃下，初始S2–浓度为211.8 mg/L、初始pH值6.72、接种量为5.04%时，菌株氧化脱硫效果最显著，经过实测在48 h产生的硫酸盐浓度为63.8 mg/L，脱硫率达97.3%。菌株在氧化硫化物时不会产生硫酸抑制菌株的生长，可以在pH值温和的环境条件下脱硫，因此，该菌有较高的工业应用价值。本研究为异养型细菌应用于工业反应器脱除硫化氢恶臭气体提供了小试研究基础。
关键词：硫化物 脱硫 异养型细菌 蜡状芽胞杆菌 脱臭 鉴定
Characterization and optimization of a heterotrophic bacterium for sulfide degradation
Rongyu Zhuang1, Yangyong Zhao2, Qingqing Shen3, Xiaodie He4, Yuting Ren1, Meiyan Li1, Yongjiang Lou1
, Xiaojun Yan1 1 Key Laboratory of Animal Protein Foods Deep Processing of Zhejiang Province, School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, Zhejiang, China;
2 Zhejiang Easy Testing Environmental Technology Co., Ltd., Ningbo 315194, Zhejiang, China;
3 Xiangpiaopiao Food Co., Ltd., Huzhou 313000, Zhejiang, China;
4 China National Rice Research Institute, Hangzhou 311400, Zhejiang, China
Received: September 1, 2017; Accepted: February 21, 2018; Published: March 6, 2018
Supported by: The Marine Public Welfare Industry Research Key Grant Project of State Oceanic Administration of China (No.201305013), Research Project of Public Welfare Technology in Zhejiang Province (No.2017C33009), Agricultural Science and Technology Project of Ningbo Municipality (No.2014C10034)
Corresponding author:Yongjiang Lou. Tel/Fax: +86-574-87600167; E-mail: louyongjiang@nbu.edu.cn
Xiaojun Yan. Tel/Fax: +86-574-87608347; E-mail: yanxiaojun@nbu.edu.cn
Abstract: The emission of hydrogen sulfide in the waste gas from slaughter plant, fishmeal feed processing and some other food industrial processing could cause serious air pollution to the surrounding environment. The purpose of this study was to screen heterotrophic bacterium strains for the removal of hydrogen sulfide odor. One heterotrophic bacterial mutant ZJNB-B3 was derived from the sulfide degrader Bacillus cereus XJ-2 and its sulfide removal efficiency was 97%. Based on the morphology studies, biochemical tests and 16S rRNA gene analysis, the strain was identified as Bacillus cereus ZJNB-B3. The NCBI GenBank accession number is MF679650. Batch tests showed that the strain tolerated up to 300 mg/L of toxic S2– concentration. Response surface methodology was applied to optimize the conditions of degradation of sulfide. The optimal parameters were as follows: initial sulfide concentration 211.8 mg/L, initial pH 6.72, inoculum volume 5.04%, and incubation temperature 30 ℃. The accumulated sulfate concentration was 63.8 mg/L and the sulfide removal efficiency was 97.3% after 48 h incubation. No sulfuric acid was generated during sulfide oxidation by the strain. Sulfide could be removed effectively by this strain under mild pH conditions. The results suggested that the strain may have great industrial application potential. This study provides the fundamentals for the removal of hydrogen sulfide gas.
Key words: sulfide removal of sulfide heterotrophic bacterium Bacillus cereus deodorization identification
大气污染、恶臭、噪声、水质污染、振动、土壤污染、地基下沉是七大典型公害，恶臭物质居于第二，它包括挥发性无机物(Volatile inorganic compounds，VIC)和有机物(Volatile organic compounds，VOC)[1]。目前，以人类的嗅觉能够感知的恶臭物质有4 000多种，其中有50多种对人类的危害较大，主要是硫化氢[2]、氨、硫醇类[3]、二甲基硫醚[4]、三甲胺、醛类、苯类和酚类等[5]。硫化氢是硫系恶臭成分中最常见的恶臭气体，主要来自于污水处理设施、石油炼制、堆肥、畜禽屠宰、鱼粉饲料加工、制革和造纸等工农业生产排放的废气[5-9]，其臭阈值很低，约为0.001 43 mg/m3[10]，微量浓度的H2S就具有强烈的恶臭气味。H2S气体无色，对人体有剧毒，低浓度中毒对眼睛和呼吸系统有强烈的刺激和腐蚀作用，重度中毒造成中枢神经系统、心脏、肺细胞损害，出现呼吸、心跳骤停，发生闪电型死亡[2]。它会引起金属和设备腐蚀，在空气中容易被氧化成SO2，对生态环境产生酸雨和致毒效应。
恶臭污染物治理难度较大，物理法、化学法对于此种污染的处理存在效率低、能耗高的缺点，废气达标排放较难。目前在国内外生物法脱臭已成为主流方法，具有除臭率高、无二次污染、所需设备简单、运转成本低及废气经过处理可以达标排放等优点[1, 11-12]。其原理是利用微生物的生理代谢活动来降解恶臭物质，将其转化为无异味、对环境无害的产物，从而达到除臭目的。
无机硫和其化合物在自然界中分布范围很广，能以30多种不同的离子或分子形式存在，仅有5种无机硫化物在室温和一个大气压下在溶液中具有稳定性，它们是SO42–、HSO4–、S0、H2S、HS–。其他形式的硫例如多硫化合物、硫代硫酸盐和连多硫酸盐则是不稳定的。自然界中能氧化无机硫化物的细菌种类很多，大部分是光合硫细菌和化能自养型细菌[2]，目前工业上用于脱除硫化氢的微生物主要是自养型硫杆菌属细菌Thiobacillus sp.[13-15]，此类细菌对硫化氢的转化途径较简单，普遍是利用还原态的硫化物作为能源，将硫转化为单质硫、硫酸或者硫酸盐等物质，其催化的硫素转化途径为：S2–→S0→SO32–→SO42–。王帆等[16]在有臭味的污泥中筛选到一株氧化亚铁硫杆菌，降解硫化物的最大量为1 290.3 mg/L。伍永钢等以自养菌[17]应用到生物滴滤床净化H2S气体，去除率稳定在95%以上。钱东升等[10]用板式生物滴滤塔净化硫化氢的研究表明净化也主要由自养菌完成。然而自养型硫氧化细菌进行硫化物的去除存在一些缺点：1)有些菌种在氧化硫化物的同时产生硫酸，会抑制菌体活性，大量产酸还会导致菌体自溶，降低除硫速率；2)有些需要加入碱进行中和，增加了处理成本。
本研究团队承担了鱼粉饲料加工、畜禽屠宰加工恶臭废气生物法处理工程的科研项目，鱼粉加工废气除含有硫化氢、氨气无机污染物，还含有高浓度三甲胺[18]、甲硫醇、甲硫醚、二甲二硫等有机恶臭污染物。屠宰加工废气除含有硫化氢、氨气，还含有反复回用融化食品级脱毛石蜡和松香的高温挥发有机成分，自养菌难以在含有机成分混合废气的环境中生长。此外，将废气与车间中的空气引入工业生物滴滤塔的离心机风量高达4×104 m3/h，反应器内需要使用好氧的异养型微生物，因此筛选具有脱除硫化氢气体功能的异养菌具有重要意义。
目前国内外关于能够高效去除无机硫化物的异养型脱硫微生物的降解特性基础研究鲜有报道。本团队在前期工作中已经筛选出一株具有高效脱硫功能的异养型真核微生物热带假丝酵母菌ZJY-7[19]。为实现以异养型细菌脱除硫化氢气体之目的，本研究又选育出一株比较容易培养、在自然环境下能够高效脱硫的异养型细菌蜡状芽胞杆菌，对其降解硫化物的生理特性进行了考察，并采用响应面法优化菌株的脱硫工艺参数，为今后将该细菌应用到工业生物滴滤塔反应器脱除H2S废气奠定小试研究基础。
1 材料与方法1.1 出发菌株本实验室保存的脱硫菌Bacillus cereus XJ-2菌株，分离自宁波市某鱼粉加工厂污水沉淀池的污泥，脱硫率达87.1%[20]。
1.2 培养基营养肉汤培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉浸出粉3.0 g，氯化钠5.0 g (杭州微生物试剂有限公司)，加热溶于1 000 mL蒸馏水，根据不同需要调pH后，121 ℃灭菌20 min。
分离筛选培养基：营养琼脂培养基(杭州微生物试剂有限公司)。
1.3 诱变试剂将脱硫XJ-2菌株在新鲜斜面上活化，30 ℃培养24 h，共活化2次。将菌苔转移到装有玻璃珠的磷酸缓冲溶液(pH 7.0)三角瓶中，置于30 ℃、180 r/min下摇瓶30 min，制成菌悬液，细胞浓度约1.2×108–1.5×108 CFU/mL。取10 mL菌悬液于培养皿中，将皿盖打开，在超净台紫外灯下照射20 s，30 ℃恒温避光培养48 h，然后涂布在营养琼脂固体平板上，在30 ℃培养48 h，挑取生长的单菌落进行平板划线、分离，纯化后的15个菌株，编号分别为ZJNB-B1，ZJNB-B2，……，ZJNB-B15，保藏在斜面培养基上。
1.4 高效脱硫菌株筛选1.4.1 初筛取上述15个菌株，分别接种到初始pH 7.0、100 mL营养肉汤锥形瓶中，置于30 ℃、150 r/min下培养18 h的种子液。在850 mL容量的气体研究用密封瓶(以下简称反应瓶)中加入初始pH 7.0、小于150 mL的营养肉汤，灭菌后先加入浓Na2S水溶液使得初始S2–浓度为200 mg/L，加5%种子液使反应初始的液体总体积为150 mL，瓶口用橡胶塞密封，在30 ℃、150 r/min下培养48 h，每种处理做4个重复试验。检测48 h各瓶中硫酸盐的浓度，以评定菌株对S2–的氧化脱除能力，最终确定4株生成硫酸盐浓度较高的菌株为脱硫能力比较好的初筛菌株。
1.4.2 复筛取上述初筛4株菌株，按照初筛方法进行复筛，每种处理做4个重复试验。检测48 h残余S2–浓度和硫酸盐浓度，选择出累积硫酸盐浓度最高的、同时脱硫率较高的复筛菌株，即为高效脱硫菌株。
1.5 菌株鉴定形态学鉴定：采用光学显微镜(日本Olympus，BX51)和扫描电子显微镜(日本Hitachi，SU-70)。生理生化鉴定：采用API 50 CHB试剂条，购自上海梅里埃生物工程有限公司。分子生物学鉴定：采用生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式SK8255细菌基因组DNA抽提试剂盒进行DNA提取和纯化，对菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增，细菌通用引物序列为27F: 5′-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增反应参数如下：94 ℃预变性4 min；循环数35次(95 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s)；72 ℃终延伸10 min，4 ℃保温10 min以上。取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，用SanPrep SK8131 DNA凝胶回收试剂盒回收，产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序(ABI 3730-XL, Applied Biosystems, USA)。测序结果与NCBI的GenBank中的已知序列进行同源性比较分析，选取1 500 bp左右长度进行比对，采用邻位连接法(Neighbor-joining)进行系统发育分析(MEGA 6.06)，以确定菌株的属名和种名。
1.6 菌株生长曲线测定将脱硫菌株接种于种子培养基，在30 ℃、150 r/min下培养18 h，接种5%到400 mL的营养肉汤中，在30 ℃、150 r/min下培养，测定该菌株的生长曲线。
1.7 单因素对菌株降解硫化物效果的影响调反应瓶内培养液初始pH为7.0，灭菌后加入初始S2–浓度分别为100、200、250、300、400 mg/L，最后加5%种子液使反应初始的液体总体积为150 mL，置于30 ℃、150 r/min下培养48 h，每隔12 h取液体分析硫化物、硫酸盐含量、pH值、OD变化，测定出菌株氧化无机硫化物的最适初始S2–浓度。然后，在最适初始S2–浓度下考察菌株将S2–氧化产生硫酸盐的最适初始pH值、最适培养温度的生理代谢条件。上述每种处理都设置3个平行样，并做空白对照。
1.8 多因素降解硫化物效果的优化运用响应面法考察初始S2–浓度、初始pH值和接种量3个环境因素在最适培养温度下对菌株降解硫化物的影响。响应面参数设计见表 1。
表 1 Box-Behnken响应面实验设计因素及水平Table 1 Factors and levels of the Box-Behnken experimental design
| Factor | Code | Level | ||
| –1 | 0 | 1 | ||
| Initial S2– (mg/L) | A | 100 | 250 | 400 |
| Initial pH | B | 5 | 6 | 7 |
| Inoculum volume (%) | C | 3 | 5 | 7 |
表选项
1.9 检测和分析方法细胞数量表征采用吸光值(OD)法，使用分光光度计在600 nm处进行直接分析(UV-1800, 美析(中国)仪器公司，上海)。采用戴安公司(DIONEX) ICS 2000离子色谱仪检测液体中的S2–、SO42–浓度。
2 结果与分析2.1 高效脱硫异养型细菌的筛选初筛：王惠祥等报道根瘤菌属[21]异养菌氧化无机硫化物的转化途径与引言中所述的自养菌基本相同。微生物将S2–氧化成最稳定的氧化物形式是硫酸盐，其无异味、对环境无害，从而能达到降毒除臭目的。因此，本研究通过检测反应结束硫酸盐的浓度高低，来评定菌株对无机S2–的氧化脱除能力的大小。每一种处理做4个重复试验，最终确定ZJNB-B2、ZJNB-B3、ZJNB-B5、ZJNB-B8共4株在48 h生成硫酸盐浓度较高的菌株为氧化脱硫效果比较好的初筛菌株，结果见图 1各处理左柱所示。
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| 图 1 四个菌株生成硫酸盐的能力和脱硫率 Figure 1 The sulfate generation and removal efficiency of sulfide of four strains. |
| 图选项 |
复筛：对初筛出的4株菌株进行复筛，检测初始0 h S2–浓度和48 h S2–的浓度，以计算脱硫率，结果如图 1各处理的右柱所示；并检测48 h各处理的硫酸盐浓度，其结果均与初筛平均值相同，因此在图 1中不重复表示。由图 1结果可以得出ZJNB-B3菌株累积硫酸盐浓度最高，同时其脱硫率也为最高，达97.2%。将其接种于斜面上，在30 ℃下培养24 h，置于4 ℃冰箱中保存。
2.2 菌株鉴定2.2.1 形态学研究光学显微镜观察到ZJNB-B3菌体为革兰氏阳性杆菌，产中生芽胞，具有运动性。扫描电镜(SEM)观察到的菌株形态见图 2，菌体细胞大小为(1.0?1.2) μm×(3.0?5.0) μm。
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| 图 2 扫描电镜观察到的ZJNB-B3菌株形态 Figure 2 Morphology of ZJNB-B3 examined under a scanning electron microscope. |
| 图选项 |
2.2.2 生理生化鉴定碳源利用试验：采用法国bioMérieux公司生产的API 50CHB试剂条，这是一种用于研究芽胞杆菌对49种糖发酵作用的快速测定试剂条。将结果(表 2)输入API芽胞杆菌鉴定数据库中进行对比。补充生理生化试验：菌株的氧化酶试验阴性；接触酶试验阳性；精氨酸双水解酶阴性。鉴定结果表明，ZJNB-B3为芽胞杆菌属的蜡状芽胞杆菌Bacillus cereus。
表 2 API 50CHB的试验项目及结果Table 2 Results of API 50CHB test
| Test | Result | Test | Result | Test | Result | Test | Result | Test | Result |
| 0 | – | GAL | – | MDM | – | MEL | – | TUR | – |
| GLY | + | GLU | + | MDG | – | SAC | + | LYX | – |
| ERY | – | FRU | + | NAG | + | TRE | + | TAG | – |
| DARA | – | MNE | – | AMY | – | INU | – | DFUC | – |
| LARA | – | SBE | – | ARB | + | MLZ | – | LFUC | – |
| RIB | + | RHA | – | ESC | + | RAF | – | DARL | – |
| DXYL | – | DUL | – | SAL | + | AMD | – | LARL | – |
| LXYL | – | INO | – | CEL | + | GLYG | + | GNT | – |
| ADO | – | MAN | – | MAL | + | XLT | + | 2KG | – |
| MDX | – | SOR | – | LAC | – | GEN | – | 5KG | – |
| Results: positive “+”, negative“–”. | |||||||||
表选项
2.2.3 分子生物学鉴定采用16S rRNA基因通用引物，对细菌的16S rRNA基因进行PCR扩增，并进行DNA测序，将得到的序列与The National Center for Biotechnology Information (NCBI)的GenBank中公开的已知序列通过Blastn软件进行比对，目标菌株与已知的Bacillus cereus LN890259.1相似性达到了100%。菌株与Bacillus sp.中其他相近的模式菌株比对的结果见图 3系统发育树。根据分子生物学鉴定结果，将菌株命名为B. cereus ZJNB-B3 (蜡状芽胞杆菌ZJNB-B3)。此菌株于2016年6月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC No. M 2016337。2017年8月将菌株的基因序列提交GenBank，申请登录号为MF679650。
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| 图 3 菌株ZJNB-B3与Bacillus sp.中模式菌株的系统发育树 Figure 3 The phylogenetic tree of the strain ZJNB-B3 with other strains of Bacillus sp.. |
| 图选项 |
2.3 菌株生长曲线测定测30 ℃培养菌液在波长600 nm处的吸光值(OD600)，该波长下细胞数量与OD值呈正比，可用OD值变化表征细菌数量的变化，以未接种液体培养基作为空白，绘制生长曲线。由图 4可见，菌液在0?2 h吸光值较小，小于0.5，这是细菌生长的延迟期，是菌体对所处环境的适应期；在2?22 h时，菌液的吸光值呈直线快速上升，这是细菌生长对数期，细菌在适宜的环境条件下不断吸收营养物质细胞繁殖速度最快；在22?85 h时，吸光值的变化幅度较小，基本上保持稳定，为细菌生长的稳定期，此阶段，细胞代谢产物的积累速度达到高峰，显微镜还观察到此阶段菌体开始形成芽胞；在85?100 h时，吸光值明显呈现下降趋势，为细菌生长的衰亡期。
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| 图 4 菌株ZJNB-B3的生长曲线 Figure 4 The growth curve of ZJNB-B3 strain. |
| 图选项 |
2.4 单因素下菌株降解硫化物生理特性研究由图 4可知菌株在不含S2–环境下在48?72 h都处于菌体生长的稳定期。向营养肉汤中加入200 mg/L初始S2–底物，然后接种5%种子液，每隔12 h检测0?72 h各瓶中硫酸盐浓度，发现反应48 h后累计的硫酸盐浓度变化不大，在72 h瓶中硫酸盐的浓度很接近在48 h硫酸盐的值，因此之后在含有S2–环境因素下的菌株生理特性研究都在48 h结束。
2.4.1 菌株最高耐受有毒硫化物的浓度硫化物对好氧生物是一种高度有毒的物质[22]，毒性作用主要包括有氧呼吸毒性和神经毒性。硫化物特别是H2S渗透进入生物体内的能力很强，如在较小型底栖生物组织中其扩散系数约为5×10–6 cm2/s[23]。硫化物很容易穿过生物体的体表，进而对其生理代谢产生毒性效应。因此，硫化物对微生物细胞也具有一定的毒性。
肉汤初始pH值为7、初始S2–为100?400 mg/L，接种5%的种子液，置于30 ℃、150 r/min下培养48 h硫酸盐的含量变化见图 5，反应期间的pH值、OD变化分别见图 6、7。由图 5可知，当初始S2–浓度从100、200 mg/L不断上升到250 mg/L时，由于添加的Na2S水溶液碱性很强，反应初始0 h的pH从8.09不断增大到8.66 (图 6)，但是48 h的代谢产物硫酸盐的浓度不断增长，分别为22.2、47.7、57.5 mg/L，柱子上面的字母a、b、c、d表示结果有显著差异(P < 0.05)。
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| 图 5 菌株在不同初始S2–浓度下累计硫酸盐浓度 Figure 5 The maximum accumulation of concentration of sulfate subjected to different initial sulfide treatments P < 0.05. |
| 图选项 |
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| 图 6 菌株在不同初始S2–浓度时的pH值变化 Figure 6 pH value at different initial S2– concentrations of the strain. |
| 图选项 |
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| 图 7 菌株在不同初始S2–浓度时的OD变化 Figure 7 OD value at different initial S2– concentrations of the strain. |
| 图选项 |
当添加S2–为300 mg/L时，0 h的pH值为8.90，48 h的硫酸盐浓度略微下降到43.9 mg/L，其对硫化物的脱除能力仍然显著。而当初始S2–浓度为400 mg/L时，反应初始0 h的pH值高达9.14，12 h的OD值比0 h的OD值下降，说明反应开始阶段处于强碱性条件下，接种的细菌被部分杀死而且生长受到抑制，培养24 h后pH值才下降到7.53，OD值增大到1.34，菌体开始繁殖，48 h时pH值降为7.17，但产生的硫酸盐仅为1.90 mg/L，细菌的脱硫效果显著变差。从上述的结果和分析可知，菌株对有毒的硫化物有较高耐受性，耐受上限高达300 mg/L，菌株氧化无机硫化物的最适初始S2–浓度是250 mg/L，此条件下氧化S2–产生的硫酸盐浓度最大，达57.5 mg/L。
2.4.2 菌株氧化S2–产生硫酸盐的最适初始pH值在预备试验中，将营养肉汤初始pH值先调到5、6、7、8、9，然后添加浓Na2S水溶液，S2–浓度为15 000 mg/L (pH值为13.6)，培养液摇匀使初始S2–浓度为250 mg/L。在肉汤初始pH值为8和9的处理组，加入S2–为250 mg/L后，再测定培养液的pH值，都大于9.2，由图 6、7的研究结果已知0 h的pH大于9.14的溶液如果接种后，菌株细胞难以生长，因此最适初始pH值的研究，肉汤初始pH值定为5、6、7。加入最适初始S2–为250 mg/L，接种5%种子液，置于30 ℃下培养，考察0–48 h的硫酸盐浓度，由图 8可知，菌株氧化S2–产生硫酸盐的最适初始pH值为7。
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| 图 8 菌株产生硫酸盐的最适初始pH值 Figure 8 The optimal initial pH value for sulfate generation of the strain. |
| 图选项 |
2.4.3 菌株氧化S2–产生硫酸盐的最适培养温度调肉汤最适初始pH值为7、加入250 mg/L S2–和5%种子液，置于25 ℃、30 ℃、35 ℃下培养，检测0–48 h硫酸盐浓度。由图 9可知菌株氧化S2–产生硫酸盐的最适培养温度为30 ℃。
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| 图 9 菌株产生硫酸盐的最适培养温度 Figure 9 The optimal temperature for sulfate generation of the strain. |
| 图选项 |
2.5 响应面法优化菌株降解硫化物的工艺参数响应面法(Response surface methodology，RSM)是利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，解决多变量问题的一种统计方法。它可以在整个响应面区域内寻求最优实验点，是降低成本、优化加工条件的一种有效方法，在食品[24-25]、生物技术[26-27]、环境生物技术[28-30]等研究领域有广泛的应用。
本研究通过响应面法考察3个环境因素对菌株降解无机硫化物效率的影响。利用Design-expert软件，以初始S2–浓度、初始pH值、接种量%作为变量A、B、C，以48 h时的硫酸盐浓度作为响应值，按照表 1的Box-Behnken响应面实验设计进行试验。各因素试验结果和模型预测值如表 3所示。
表 3 响应面法试验的实际值与预测值Table 3 Actual and predicted values of RSM test
| Run | Factor | Actual SO42– (mg/L) | Predicted SO42– (mg/L) | ||
| A | B | C | |||
| 1 | 100.00 | 5.00 | 5.00 | 36.9 | 36.56 |
| 2 | 400.00 | 5.00 | 5.00 | 0.8 | 0.54 |
| 3 | 100.00 | 7.00 | 5.00 | 39.8 | 40.06 |
| 4 | 400.00 | 7.00 | 5.00 | 2.1 | 2.44 |
| 5 | 100.00 | 6.00 | 3.00 | 37.7 | 37.40 |
| 6 | 400.00 | 6.00 | 3.00 | 1.2 | 0.82 |
| 7 | 100.00 | 6.00 | 7.00 | 37.5 | 37.87 |
| 8 | 400.00 | 6.00 | 7.00 | 0.5 | 0.80 |
| 9 | 250.00 | 5.00 | 3.00 | 48.2 | 48.84 |
| 10 | 250.00 | 7.00 | 3.00 | 50.1 | 50.14 |
| 11 | 250.00 | 5.00 | 7.00 | 47.7 | 47.66 |
| 12 | 250.00 | 7.00 | 7.00 | 52.4 | 51.76 |
| 13 | 250.00 | 6.00 | 5.00 | 59.0 | 62.08 |
| 14 | 250.00 | 6.00 | 5.00 | 59.1 | 62.08 |
| 15 | 250.00 | 6.00 | 5.00 | 66.0 | 62.08 |
| 16 | 250.00 | 6.00 | 5.00 | 64.7 | 62.08 |
| 17 | 250.00 | 6.00 | 5.00 | 61.6 | 62.08 |
表选项
对表 3中的硫酸盐浓度的试验数据进行多元回归，得到回归方程式(1)：
 | (1) |
对本试验所拟合的回归方程模型进行方差分析，结果见表 4，模型的显著系数P < 0.000 1，说明回归方程极显著；模型的相关系数R2=0.995 2，说明该模型能较准确地预测响应值的变化。
表 4 响应面试验菌株产生硫酸盐结果的方差分析Table 4 Analysis of variance for response of sulfate concentration
| Source | Sum of squares | df | Mean square | F value | P value | Significant |
| Model | 8 865.50 | 9 | 985.06 | 162.40 | < 0.000 1 | ** |
| A | 2 712.20 | 1 | 2 712.20 | 447.00 | < 0.000 1 | ** |
| B | 14.58 | 1 | 14.58 | 2.40 | 0.165 | |
| C | 0.10 | 1 | 0.10 | 0.017 | 0.900 8 | |
| AB | 0.64 | 1 | 0.64 | 0.11 | 0.755 | |
| AC | 0.063 | 1 | 0.063 | 0.01 | 0.922 | |
| BC | 1.96 | 1 | 1.96 | 0.32 | 0.588 | |
| A2 | 5 541.30 | 1 | 5 541.30 | 913.30 | < 0.000 1 | ** |
| B2 | 146.70 | 1 | 146.70 | 24.18 | 0.0017 | ** |
| C2 | 182.20 | 1 | 182.20 | 30.02 | 0.000 9 | ** |
| Residual | 42.47 | 7 | 6.07 | |||
| Lack of fit | 1.64 | 3 | 0.55 | 0.054 | 0.981 4 | |
| Pure error | 40.83 | 4 | 10.21 | |||
| Cor total | 8 908.00 | 16 | ||||
| R2=0.995 2; *: P < 0.05, significant; **: P < 0.001, more significant. | ||||||
表选项
用该多元回归方程式得到各个因素对响应值的响应曲面图，投影在X轴的等高线可以直观地看出两个因素之间的相互影响作用，等高线形状越接近于椭圆则表示两个因素之间交互作用越强，越圆表示这两个因素的交互作用不显著。从图 10可知，初始底物S2–浓度和初始pH值对菌株的氧化脱硫效果有显著的影响。
 |
| 图 10 环境因素对菌株产生硫酸盐影响的响应面 Figure 10 Three-dimensional surface figure of the influence of environmental factors on sulfate concentration of the strain. |
| 图选项 |
经过Design-expert软件的分析，对得到的回归方程式求一阶偏导，令其等于0后，可以得到菌株最优的降解硫化物条件，即ZJNB-B3菌株在最适初始底物S2–浓度为211.8 mg/L、初始pH值为6.72、接种量为5.04%时，菌株的氧化脱硫效果最显著，此时的硫酸盐浓度应为64.4 mg/L。
2.6 最优降解硫化物工艺参数的验证为验证响应面法得到的模型的准确性，对菌株在上述最优的降解硫化物工艺参数下进行了3次验证试验，测定了0?48 h的S2–和SO42–的浓度变化(图 11)，以及pH值和OD变化(图 12)。这3次试验平均实际测得菌株在48 h能够将液体中S2–浓度降为6.32 mg/L，脱硫率达97.0%，脱硫产生的SO42–的浓度为63.8 mg/L，与预测值64.4 mg/L较为接近，预测值与实际测定值两者的相对误差为0.94%，可见响应面法所拟合的多元回归方程能够比较准确地预测不同环境因素下菌株氧化降解S2–产生的稳定氧化物SO42–的值。
 |
| 图 11 菌株在最适条件下硫化物和硫酸盐浓度变化 Figure 11 The concentrations of sulfide and sulfate at the optimal desulfurization condition of the strain. |
| 图选项 |
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| 图 12 菌株在最适脱硫条件下pH值和OD的变化 Figure 12 The pH and OD values at the optimal desulfurization condition of the strain. |
| 图选项 |
对比不含有毒物S2–时菌株的生长曲线(图 4)，由含有毒物S2–时图 12中的OD值变化曲线可知，细菌的生长延迟期明显比图 4中的0–2 h变长到0–12 h左右，12–30 h的对数生长期的增长速率也比图 4变慢，不含有毒物S2–时细菌在22 h后已经达到稳定期，而含有毒物S2–时在30 h后才出现稳定期，证明211.8 mg/L的高浓度有毒物S2–的存在，对菌体的生理代谢产生了不利的影响，使蜡状芽胞杆菌ZJNB-B3细胞的生长繁殖速度变慢。
邱丽娜等从污泥中筛选出一种革兰氏阴性硫氧化菌(是自养型SOB，但未鉴定是什么菌属)，将其接种到不含碳源、加有硫粉的无机盐培养基中，调节起始pH为6置于30 ℃下培养，到第3天pH下降到1左右，培养到第7天pH可下降到0.6，推断该菌能氧化硫粉生成硫酸[31]，可以作为生物浸出法的菌种用于浸矿或去除污泥中的重金属。
在我们的研究中，图 12中ZJNB-B3菌株在0–48 h的pH值变化范围是8.20–7.04，在图 6中，当初始S2–浓度为100–300 mg/L时，菌株在0–48 h的pH值变化范围也均在8.90–7.10，各处理组在反应结束累积硫酸盐达最高时pH值均从碱性降到中性，证明了ZJNB-B3菌株在氧化硫化物时不会产生硫酸抑制菌体的生长，此菌株可以在pH值温和的环境条件下脱硫。其在小试研究脱硫过程中表现出pH值的稳定，表明该菌有较高的工业应用价值，可以将此菌应用于禽畜屠宰加工、鱼粉饲料加工等工业生产排放的恶臭硫化氢气体的脱除处理，使用此异养菌的工业反应器如生物滴滤塔，将具有以下优点：其循环营养液不需要加入碱进行中和，降低了处理的成本；脱硫过程中pH值的稳定，可以使反应器保持稳定的脱除效率，容易操作管理，对于反应器的稳定运行具有重要的意义。本课题组正在进行此菌应用于生物滴滤塔处理禽畜屠宰加工污水处理站生产的硫化氢恶臭废气的研究，相关研究结果将另文发表。
3 结论通过对出发菌株诱变得到一株生长快速且脱硫率高达97%的异养型脱硫细菌，基于形态学研究、生理生化鉴定、16S rRNA基因序列分析，鉴定菌株为蜡状芽胞杆菌，命名为Bacillus cereus ZJNB-B3，GenBank登录号为MF679650。运用响应面法优化环境因素对菌株降解无机硫化物效率的影响，得到在最适培养温度30 ℃下，初始S2–浓度为211.8 mg/L、初始pH为6.72、接种量为5.04%时，菌株氧化脱硫效果最显著，实验测定硫酸盐浓度为63.8 mg/L。
脱硫菌蜡状芽胞杆菌ZJNB-B3在氧化硫化物时不会产生硫酸抑制菌体的生长，可以在pH值温和的环境条件下实现高效脱硫效果，相较于一些在氧化硫化物时会产生硫酸抑制菌体活性的自养型细菌，该菌在硫化氢气体脱除方面有更高的工业应用价值。
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