, 倪川1 1 北京师范大学第二附属中学，北京 100192;
2 清华大学 生命科学学院与生命科学联合中心，北京 100084
收稿日期：2018-07-01;接收日期：2018-09-29
摘要：利用工程改造过的肠道微生物进行无创、便宜便捷的肠道炎症检测、治疗可有效应用于医药行业。肠道炎症通常伴随着肠道中硫代硫酸盐和连四硫酸盐的增加，双组分系统ThsSR和TtrSR是两套分别检测这两种小分子的生物感受器系统。采用荧光蛋白作为指示剂需要复杂的测试仪器，不适用于家用检测环境，而肉眼可见的色素蛋白和有色小分子作为指示剂将可能扩大ThsSR和TtrSR的应用前景。两套系统分别被转入大肠杆菌Escherichia coli Top10和益生菌E. coli Nissle 1917中，sfGFP信号表达效果证明了这两套系统可用。考虑实际应用，sfGFP被一系列色素蛋白和显色小分子替换，在E. coli Top10中，一系列色素蛋白和紫色杆菌素前体protoviolaceinic acid的显色效果明显，表明了该系统具有用于实际肠道炎症检测的可行性。结果表明，改进后的ThsSR和TtrSR系统能够针对不同浓度的肠道炎症标记物作出相应程度的反应，具备用于家庭环境人体肠道炎症检测的潜力。
关键词：炎症性肠病硫代硫酸盐连四硫酸盐生物检测器色素蛋白紫色杆菌素前体
Construction and characterization of a bio-detector for inflammatory bowel disease
Guo Weihang1*, Li Boxuan1*, Zhou Haoyu1*, Zhang Chen1, Wang Xuan2
, Ni Chuan1 1 Second High School Attached to Beijing Normal University, Beijing 100192, China;
2 School of Life Sciences, Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China
Received: July 1, 2018; Accepted: September 29, 2018
Corresponding author:Xuan Wang. Tel: +86-10-62772676; E-mail: xuan-wan16@mails.tsinghua.edu.cn
Chuan Ni. Tel: +86-10-82738787-3186; Fax: +86-10-82738787-3199; E-mail: nichuan@shsbnu.cn
*These authors contributed equally to this study
Abstract: Genetically engineered intestinal microbes could be powerful tools to detect and treat intestine inflammation due to their non-invasive character, low costs, and convenience. Intestinal inflammation is usually detected along with an increasing concentration of thiosulfate and tetrathionate molecules in the intestines. ThsSR and TtrSR are two-component biosensors to detect the presence of thiosulfate and tetrathionate molecules, respectively. In real-life intestinal inflammation detection, sophisticated instruments are needed if using fluorescent proteins as reporters. However, chromoproteins and other colored small molecules, which can be seen by the unaided eye, could extend the use of ThsSR and TtrSR biosensors to detect intestine inflammation. The feasibility of ThsSR and TtrSR systems was tested by monitoring the fluorescence intensity of sfGFP in response to the concentration of thiosulfate and tetrathionate, followed by the incorporation of the two systems into Escherichia coli Top10 and E. coli Nissle 1917. The potential for the real-life application of the two systems was further corroborated by substituting sfGFP with a series of chromoproteins and a protoviolaceinic acid synthesis cassette as reporter genes. The results indicated that signal expression of the new systems had a positive correlation with the concentration of tetrathionate and thiosulfate molecules. Thus, the modified ThsSR and TtrSR system may potentially be applied in the human body for the detection of intestinal inflammation.
Keywords: inflammatory bowel diseasethiosulfatetetrathionatebio-detectorchromoproteinprotoviolaceinic acid
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease)包括克罗恩氏症(Crohn’s disease，CD)和溃疡性肠炎(Ulcerative colitis，UC)，是一种慢性特发性肠道疾病。随着炎症性肠病的发病率日益增长，我国对肠道炎症的检测效果仍面临挑战[1]。
在肠道炎症中，存在于结肠中的硫酸盐还原细菌将饮食和宿主的氧化硫物质转化为H2S分子。然而，由于生物体内的H2S分子难以测量，试图将H2S含量和肠道炎症状况直接联系起来几乎不可行[2]。而人的肠道黏膜会将过多的H2S转化为硫代硫酸盐[3]而去除毒性，从而使得硫代硫酸盐成为肠道炎症的一种潜在标记物。而Winter等[4]发现，宿主体内特定的生物过程还会产生氮氧自由基，将硫代硫酸盐转化为连四硫酸盐，从而促进某些肠道炎症细菌如鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium的生长。因此硫代硫酸盐和连四硫酸盐的水平可能均与肠道炎症程度相关。
近来，Daeffler和Galley等[5]在海洋中的希瓦氏菌属Schwanella sp内发现了ThsSR和TtrSR两套双组分检测系统，该系统能感应硫代硫酸盐和连四硫酸盐这两种分子，并激活后续基因的表达。Daeffler和Galley等将这两套双组分系统连接上报告基因绿色荧光蛋白，转入大肠杆菌E. coli Nissele 1917中，灌喂肠道炎症小鼠模型[6]，之后在收集到的小鼠粪便分离出细菌，利用流式细胞仪来检测细菌的荧光强度，从而判断小鼠的炎症发生。由于绿色荧光蛋白需要氧气成熟才能发出荧光，并且需要大型仪器，应用于实际生活中会有所不便，因此我们选用色素蛋白或者其他有颜色的分子作为指示剂，便于使用者在家庭环境下就能够通过观察粪便颜色来判断自身肠道炎症状况。
1 材料与方法1.1 菌株与质粒大肠杆菌E. coli Top10购自北京全式金生物技术有限公司。大肠杆菌E. coli Nissle 1917由Mr. Kai Sheng Hee、NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI)实验室惠赠。表达质粒pSB4K5、pSB1C3从iGEM Foundation获得。表达质粒pSEVA321由Victor DeLorenzo实验室惠赠，含绿色荧光蛋白基因、色素蛋白基因、紫色杆菌素前体基因的质粒从iGEM Foundation获得。使用了如下基因(基因展示规则为iGEM生物砖编号及该基因编码的蛋白名称)：
1. BBa_K1033910 “fwYellow yellow chromoprotein”
2. BBa_K1033916 “amajLime yellow-green chromoprotein”
3. BBa_K592010 “amilGFP yellow chromoprotein”
4. BBa_K1033919 “gfasPurple purple chromoprotein”
5. BBa_K1033932 “spisPink pink chromoprotein”
6. BBa_K592009 “amilCP blue chromoprotein”
7. BBa_K274003 "Vio operon ABDE”
8. BBa_I746916 "superfolder GFP”。
1.2 方法1.2.1 ThsSR和TtrSR目的基因的获得ThsS、ThsR、TtrS、TtrR序列信息见iGEM parts registry[7-10]。通过苏州泓迅生物科技股份有限公司合成，合成序列为大肠杆菌σ70依赖型持续表达启动子-核糖体结合位点-ThsS/TtrS-终止子(下称ThsS/TtrS)，常表达启动子-核糖体结合位点-ThsR/TtrR-终止子- ThsR/TtrR调节启动子-核糖体结合位点(下称ThsR/TtrR)。根据iGEM竞赛要求和后续Golden Gate拼装，优化DNA序列，删除序列内部EcoRⅠ、XbaⅠ、SpeⅠ、PstⅠ和BsaⅠ限制性内切酶酶切位点；为了后续质粒构建，在两端分别加上BsaⅠ酶切位点，对应的黏性末端分别是：ThsS、TtrS上下游(5′–3′) ggag，agcg；ThsR、TtrR上下游(5′–3′) ggag，ctag。
1.2.2 ThsS/TtrS、ThsR-sfgfp/TtrR-sfgfp质粒构建利用Golden Gate基因拼接方式构建质粒。首先通过PCR给每个片段加上BsaⅠ酶切位点，表 1方框中表示BsaⅠ酶切位点，下划线表示粘性末端。利用引物P1和P2扩增pSB4K5，引物P3和P4扩增pSB1C3，引物P5和P6扩增sfgfp。反应条件如下：98 ℃变性5 min；98 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min 15 s (pSB4K5, pSB1C3)，30 s (sfgfp)，进行35个循环；72 ℃延伸5 min。将含有BsaⅠ酶切位点的扩增片段pSB4K5和ThsS/TtrS质粒(1:1摩尔体积，总量不超过100 ng)放入Golden Gate反应体系中：1 μL T4 ligase，1 μL BsaⅠ, 2 μL 10×T4裂解缓冲液，质粒骨架和片段，补齐ddH2O至20 μL。反应条件如下：37 ℃ 5 min，16 ℃ 10 min，进行10个循环；然后37 ℃ 15 min，50 ℃ 5 min，80 ℃ 5 min。用同样的方法，将含有BsaⅠ酶切位点的扩增片段pSB1C3、sfgfp和ThsR/TtrR质粒(1:1:1摩尔体积，总量不超过100 ng)放入Golden Gate反应体系中进行反应。转化大肠杆菌E. coli Top10感受态细胞，涂布卡那霉素(pSB4K5)/氯霉素(pSB1C3)抗性LB固体平板，挑取3个单克隆，用小量质粒提取试剂盒抽提质粒，送往苏州泓迅生物科技股份有限公司测序。
表 1 引物序列Table 1 Primer used in this study
| Primer name | Primer sequence (5′–3′) | Size (bp) |
| P1 | AAAATT | 36 |
| P2 | ATAT | 35 |
| P3 | ATAT | 35 |
| P4 | AATT | 36 |
| P5 | GAGA | 35 |
| P6 | CACG | 44 |
| BsaⅠrestriction sites in frame. | ||
表选项
利用同样的方法，我们将sfgfp替换为粉色(spispink, Part: BBa_K1033932)、蓝色(amilblue, Part: BBa_K592009)和紫色(gfaspurple, Part: BBa_ K1033919)色素蛋白编码基因。
1.2.3 ThsR/TtrR-色素蛋白目的基因质粒构建利用Gibson Assembly基因拼接方式构建质粒。选用带有持续表达启动子和强RBS的pSEVA321质粒骨架，将质粒骨架与sfgfp和编码色素蛋白基因(基因展示规则为iGEM生物砖编号及该基因编码的蛋白名称)：
1. BBa_K1033910 “fwYellow yellow chromoprotein”
2. BBa_K1033916 “amajLime yellow-green chromoprotein”
3. BBa_K592010 “amilGFP yellow chromoprotein”
4. BBa_K1033919 “gfasPurple purple chromoprotein”
5. BBa_K1033932 “spisPink pink chromoprotein”
6. BBa_K592009 “amilCP blue chromoprotein”
7. BBa_K274003 “Vio operon ABDE”
8. BBa_I746916 “superfolder GFP”。
分别PCR带上20 bp同源臂，将扩增片段按照1:1摩尔比，总量小于100 ng转入Gibson Assembly体系中：Gibson Assembly 2×Mix 5 μL，骨架和sfgfp/色素蛋白编码基因片段，补至10 μL。反应条件如下：50 ℃ 60 min, 80 ℃ 5 min。转化E. coli Top10感受态细胞，涂布氯霉素抗性LB固体平板，挑取3个单克隆，用小量质粒提取试剂盒抽提质粒，送苏州泓迅生物科技股份有限公司测序。
1.2.4 流式细胞仪表征将构建成功的质粒按照ThsS+ThsR、TtrS+TtrR的组合分别转入大肠杆菌E. coli Top10和大肠杆菌E. coli Nissle 1917感受态中，平板培养24 h。分别挑取3个单克隆加入含有25 μg/mL氯霉素、50 μg/mL卡那霉素的LB培养液中，37 ℃、200 r/min培养过夜，然后稀释过夜的菌液200倍，使用200 μL 96孔板盖上呼吸膜在微孔振荡器中，含有抗生素的M9培养基37 ℃、1 000 r/min生长3 h，然后再将该菌液稀释700倍，使用200 μL孔板盖上呼吸膜在微孔振荡器中，含有抗生素以及不同浓度硫代硫酸钠(0、0.01 mmol/L、0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.7 mmol/L；针对含ThsS+ThsR的菌)、连四硫酸钠(0、0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L；针对含TtrS+TtrR的菌)的M9培养基37 ℃、1 000 r/min生长6 h。从中取15 μL菌液至185 μL 1×PBS溶液(含2 mg/mL卡那霉素)中，做流式细胞仪测试)。本实验使用不含sfgfp质粒的大肠杆菌E. coli作为阴性对照。流式细胞仪使用清华大学生物医学测试中心BD LSRFortessa FITC通道观测sfGFP荧光强度。
1.2.5 模拟粪便颜色观察将构建成功的pSEVA321-sfgfp/色素蛋白编码基因质粒转入大肠杆菌E. coli Top10中，平板培养24 h。分别挑取1个单克隆加入含有25 μg/mL氯霉素的20 mL LB培养液中37 ℃、200 r/min培养过夜，在50 mL离心管中离心后加入1 g “模拟粪便”咖喱和500 μL水混匀，观察混合颜色。
2 结果与分析2.1 检测器的构建我们首先按照图 1基因线路图搭建了检测器。选用实验室常用的分子克隆菌株大肠杆菌E. coli Top10和大肠杆菌E. coli Nissle 1917作为底盘生物，使用流式细胞仪定量测试硫代硫酸盐检测系统对硫代硫酸盐浓度梯度的响应结果如图 2所示。图 2A显示含有ThsSR系统的大肠杆菌E. coli Top10和E. coli Nissle 1917的荧光强度(x±s，n=3)随着硫代硫酸盐浓度增高而增高。图 2B显示含有TtrSR系统的大肠杆菌E. coli Top10和E. coli Nissle 1917的荧光强度(x±s，n=3)随着连四硫酸盐浓度增高而没有变化。意味着ThsSR系统有潜力作为肠道炎症生物检测器。
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| 图 1 生物传感器A (ThsSR)和B (TtrSR)的基因线路图 Figure 1 Gene circuits of ThsSR (A) and TtrSR (B) bio-sensor. (A) ThsS expresses constitutively, and the expressed sensor protein will be incorporated into cell membrane of engineered E. coli strain. When signal molecule thiosulfate exists, regulatory protein ThsR will be phosphorylated. The promoter PphsA will be activated, starting the expression of reporter gene (e.g. sfgfp), producing sfGFP. (B) TtrS expresses constitutively, and the expressed sensor protein will be incorporated into cell membrane of engineered E. coli strain. When signal molecule tetrathionate exists, regulatory protein TtrR will be phosphorylated. The promoter PttrB185-269 will be activated, starting the expression of reporter gene (e.g. sfgfp), producing sfGFP. |
| 图选项 |
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| 图 2 以sfgfp为报告基因A ThsSR和B TtrSR分别在E. coli Top 10和E. coli Nissle 1917中，对硫代硫酸盐A和连四硫酸盐B浓度梯度的响应曲线 Figure 2 Response curve of A ThsSR and B TtrSR to thiosulfate A and tetrathionate B concentration gradient in E. coli Top10 and E. coli Nissle 1917, while using sfgfp as reporter gene. |
| 图选项 |
2.2 报告基因的改进考虑到实际应用中需要观察粪便的颜色来判断肠道健康情况，而肠道的无氧环境不利于GFP蛋白成熟和发出荧光[11]。此外，观察GFP的颜色需要用紫外线激发，实际应用中需要额外的设备可能带来不便。我们决定使用可以直接肉眼观测颜色的色素蛋白基因来替换sfgfp，作为肠道炎症的报告基因。为了选出使粪便变色最显著的色素蛋白，我们使用有着类似于粪便颜色的咖喱模拟粪便与色素蛋白混合，将表达色素蛋白的大肠杆菌(LB培养基20 mL，200 r/min、37 ℃培养过夜)混入1 g模拟粪便和500 μL水并搅拌均匀后的结果如图 3所示。可以看到，粉色色素蛋白(spisPink, Part: BBa_K1033932[12])、蓝色色素蛋白(amilBlue, Part: BBa_K592009[13])以及紫色色素蛋白(gfasPurple，Part: BBa_K1033919[14])，在肉眼看来能够最明显地改变模拟粪便的颜色。这3种蛋白被进一步选用，作为后续实验的报告基因。
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| 图 3 色素蛋白与模拟粪便混合带来颜色变化的定性结果 Figure 3 Qualitative results for color change of simulated feces mixed with chromoproteins. (A) The color of genetically engineered (pSEVA321 plasmid skeleton + strong promoter + strong RBS + corresponding chromoprotein genes) E. coli Top10 pellets collected through centrifugation. The control group bacteria were also transformed by pSEVA321 plasmid. (B) The E. coli Top10 pellets collected in Fig. 3 (A) were then mixed with mimic feces. |
| 图选项 |
取其中表达粉色色素蛋白的大肠杆菌稀释涂板，计算得到图 3A中的20 mL离心菌含有7.6×1010个菌落，加入模拟粪便2.5 g还能分辨出颜色。
2.3 新系统的构建测试过这些色素蛋白在模拟大便中的变色效果后，我们将变色最明显的3种色素蛋白基因片段gfasPurple、spisPink、amilCP分别转入到了ThsSR和TtrSR系统中。此外，我们还测试了另一种墨绿色的色素分子紫色杆菌素前体(Proviolaceinic acid，BBa_K274003[15])作为报告基因的可能性。该色素分子也呈现出非常明显的颜色，并且可以经由微生物进一步加工后变为紫色杆菌素，对肠道炎症有潜在的治疗效果[16]。
图 4展现了上述色素蛋白与紫色杆菌素前体作为报告基因时，ThsSR和TtrSR系统对诱导化学物的响应。可以看到，使用ThsSR系统时，紫色色素蛋白(图 4A)和粉色色素蛋白(图 4B)随着诱导物浓度的增加，有肉眼可以分辨的响应程度。蓝色色素蛋白(图 4C)以及紫色杆菌素前体(图 4D)则存在严重的泄露，使得结果难以被肉眼区分。实验结果表明，ThsSR系统与紫色和粉色色素蛋白搭配是可用的组合。
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| 图 4 以不同的色素蛋白或其他有色化学物质作为报告基因时，ThsSR和TtrSR系统对诱导化学物的响应 Figure 4 Response of ThsSR or TtrSR system to the inducing chemicals, featuring different chromoproteins or other colored chemicals as reporter gene. (A–D) Response to thiosulfate (Na2S2O3) of the ThsSR system, in each image, from left to right, the concentration of thiosulfate is 1.0 mmol/L, 0.1 mmol/L, 0.01 mmol/L, 0 mmol/L. (E–H) Response to tetrathionate (Na4S4O6·2H2O) of TtrSR system, in each image, from left to right, the concentration of tetrathionate is 2.5 mmol/L, 1.0 mmol/L, 0.1 mmol/L, 0 mmol/L. |
| 图选项 |
使用TtrSR系统时，紫色色素蛋白(图 4E)、粉色色素蛋白(图 4F)、蓝色色素蛋白(图 4G)均未随诱导物浓度增加而呈现出肉眼能分辨的表达量差异。不过使用紫色杆菌素前体(图 4F)作为报告基因时，响应程度的差异则清晰可见。结果表明，使用TtrSR系统时紫色杆菌素前体是更合适的报告物。
3 讨论根据Daeffler和Galley等的研究，过多的TtrR可能会导致TtrSR系统失效。Daeffler等针对TtrS和TtrR选取了一系列的启动子在大肠杆菌E. coli Nissle 1917中进行表征，其中部分弱启动子体现出比较好的效果，有17–40倍的响应范围，然而当TtrS的启动子强度过大时，一部分组合生长受到影响；当TtrR的启动子强度过大时，虽然生长没有受到影响，但是响应却消失了。在本文的TtrSR系统中，虽然TtrR的启动子和Daeffler等的一致，但是质粒使用了高拷贝复制子pMB1 (500–700拷贝)远远高于原文中的拷贝数p15A10–15拷贝)，因此也出现了过多TtrR。
而猜测导致该现象的原因是，双组分TtrSR系统中，TtrS不仅能够磷酸化，也能够去磷酸化TtrR[17]。过多的磷酸化TtrR可能会间接促进自身的去磷酸化，从而无法激活其下游对应启动子PttrB。
肠道炎症检测器是用改造过的大肠杆菌检测肠道中的特定小分子并进行色素蛋白的表达，色素蛋白可在人体肠道中降解，对人体无害；且相比于荧光蛋白，色素蛋白不需要紫外线照射就可辨认，适用于家庭环境下的应用。使用紫色杆菌素前体作为报告基因会带来更多潜在的好处，例如该分子经过加工将形成紫色杆菌素并具有抗细菌、抗肿瘤、抗氧化等功能[16]，是一种潜在的肠道炎症治疗药物，这可能使生物检测器同时具备一定的治疗功能。
实验表明，ThsSR、TtrSR这两种生物检测器系统在益生大肠杆菌E. coli Nissle 1917中亦可工作，这意味着将来可以考虑把含有这两种生物检测器的益生菌制成胶囊给人服用，从而发挥检测和治疗的效果。在此基础上，利用基因工程改造过的生物检测器可以与低功耗的无线电子设备结合，实时监测人体内的生物信号[18]。
上文提到，7.6×1010个表达粉红色素蛋白的大肠杆菌加入模拟粪便2.5 g还能分辨出颜色。如果假设一个成年人每天排便1 kg，经计算，需要使用表达粉红色素蛋白的大肠杆菌约3×1013个。
考虑到测试者在家庭环境中实际应用生物检测器诊断肠道炎症的场景，接下来可能还有很多困难需要克服。例如，真实粪便的颜色可能与模拟粪便的颜色有区别，可能还需要进一步实验，以建立不同的比色标准。再如，不同饮食习惯下的粪便颜色亦会有所不同，很难保证在任何条件下色素蛋白和色素分子都清晰可见，因此可能需要建议使用者在服用生物检测器胶囊前后的一段时间内饮食尽量清淡，或者与生物检测器配套提供某种标准化的餐食。
此外，实验过程中发现紫色杆菌素前体分子易溶于水，且产量较大，变色效果非常明显(图 5)。因此推断，使用紫色杆菌素前体作为报告基因时，粪便在厕所中静置一小段时间后，厕所中水的颜色可能会为测试者提供更有效的判断依据。
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| 图 5 紫色杆菌素前体对培养基的变色效果(左图)，及其对照组(spisPink, Part: BBa_K1033932[7])效果(右图) Figure 5 Color change to culture medium caused by proto-violaceinic acid (tube on left), whereas chromoprotein (spisPink, Part: BBa_K1033932[7]) stayed in E. coli cell and did not change the color of culture medium (tube on right). We thus infer that, while using protoviocaceinic acid as reporter, people could leave their feces in toilet for a while and get the testing results by reading toilet water. |
| 图选项 |
团队简介：
SHSBNU_China北京师范大学第二附属中学国际部iGEM队伍成立于2017年，全员共有10人，包括队员6人、2名指导指导研究生和2位指导老师。虽然这是北师大二附中队伍的第一次参赛，但在全员的努力下，北师大二附中队伍以“炎症性肠病生物检测器的构建与调试”项目取得了1项金牌和3个单项奖提名的优异成绩。在即将到来的2018 iGEM中，北师大二附中队伍将致力于用细菌生产漆酶从而降解对环境有危害的靛蓝染料。
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