, 于秉治11 中国医科大学 生物化学与分子生物学教研室, 辽宁 沈阳 110001
2 沈阳市第五人民医院, 辽宁 沈阳 110001
基金项目：国家自然科学基金(Nos. 31501162，81270654，31570819)资助
摘要: 通过研究PKB/Akt与Girdin蛋白之间的关系，目的在于揭示Girdin蛋白在PKB/Akt调控小鼠受精卵微丝聚集中的作用。研究中首先结合软件(http://scansite.mit.edu//)预测了PKB/Akt对Girdin蛋白的磷酸化位点，并制定特定位点磷酸化抗体，通过蛋白免疫印迹检测经PKB/Akt mRNA或PKB/Akt siRNA处理后的小鼠受精卵中Girdin蛋白磷酸化改变情况。同时检测了磷酸化的Girdin蛋白亚细胞定位及同微丝骨架的定位关系。进一步通过显微注射PKB/Akt mRNA再注射Girdin siRNA检测小鼠受精卵微丝骨架的聚集。结果显示经持续激活型PKB/Akt mRNA、野生型PKB/Akt mRNA处理后的小鼠受精卵中p-Girdin-1 417分布位置更加集中在2-细胞分裂沟处。经野生型和持续激活型PKB/AktmRNA注射组p-Girdin-1 417表达增强，但是并不影响Girdin蛋白的总的表达。说明siRNA介导的PKB/Akt表达敲低非常明显地降低了Girdin蛋白的磷酸化。激光共聚焦研究显示在Akt mRNA和Girdin siRNA共注射组微丝骨架分布明显散乱。本研究结果充分说明Girdin蛋白在小鼠受精卵中受到PKB/Akt的调节，PKB/Akt通过磷酸化Girdin蛋白改变微丝骨架的聚集。
关键词: PKB/Akt Girdin蛋白 F-actin 小鼠受精卵
PKB/Akt regulates the aggregation of actin by girdin in mouse fertilized eggs
Didi Wu1, Panpan Zhang2, Ying Liu1
, Bingzhi Yu1 1 Department of Biochemical and Molecular Biology, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning, China;
2 The Fifth People's Hospital of Shenyang, Shenyang 110001, Liaoning, China
Received: January 12, 2016; Accepted: April 27, 2016
Supported by:National Nature Science Foundation of China (Nos. 31501162, 81270654, 31570819)
Corresponding authors:Ying Liu. E-mail: yliu@mail.cmu.edu.cn
Bingzhi Yu. E-mail: ybzbiochem@yeah.net
Abstract: The purpose of this study is to reveal the role of Girdin in regulating the aggregation of actin filaments by studying the relationship between PKB/Akt and Girdin.First we used Scansite software (http://scansite.mit.edu//) to predict relevant target sites of PKB/Akt on mouse Girdin.To gain insight into the role of phosphorylation of Girdin by PKB/Akt, we assessed the location of phosphorylated Girdin in fertilized eggs by staining with anti-P-Girdin 1 417 Ab.We detected a distinct increase in the fluorescence signal of F-actin and P-Girdin 1 417 after microinjection of Akt WT and myr-Akt.The addition of myr-Akt induced phosphorylation of Girdin in mouse fertilized eggs.In addition, siRNA-mediated Akt-knockdown blocked phosphorylation of Girdin.The distribution of actin filaments was obviously scattered.These results strongly suggest that PKB/Akt could directly phosphorylate Girdin on Ser1 417 and promote its function in mouse fertilized eggs.
Key words: PKB/Akt Girdin F-actin mouse fertilized eggs
微丝骨架(Microf ilament cytoskeleton)在受精卵早期分裂及发育中对精卵融合、纺锤体旋转、分裂沟形成及胞质分裂等事件的完成发挥重要作用[1]。但在哺乳动物尤其在小鼠受精卵细胞的分裂及早期发育过程中，微丝骨架形成和变化的调控因子及信号调控机制尚不清楚。
蛋白激酶B (Protein kinase B，PKB)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，与v-akt基因编码的Akt蛋白同源，又被称为Akt。PKB/Akt主要通过PI3K途径调节细胞多种生理功能，并被确定为参与肿瘤侵袭和转移的重要信号途径[2-4]。研究报道显示敲低PKB/Akt表达能够抑制神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭。进一步研究发现PKB/Akt参与乳腺癌细胞迁移同微丝骨架的重新构建密切相关[5-7]。而我们的前期研究发现PKB/Akt在小鼠卵母细胞及早期受精卵中存在且能够促进受精卵的分裂[8-9]。并进一步发现PKB/Akt在小鼠卵母细胞及受精卵一、二细胞期中同微丝骨架存在着共定位。同时我们也已证明PKB/Akt可影响小鼠受精卵细胞微丝骨架的正确聚集及分布[10-11]。
上述研究虽然初步证明了PKB/Akt可以影响小鼠受精卵微丝骨架的聚集，但是其作用途径还很不明确。多项研究显示微丝骨架可受到多种微丝交联/成束蛋白调控，包括fimbrin、villin、scruin、fascin、families和Girdin蛋白等的影响。其中Girdin (Girders of actin filaments)是一个新近发现参与微丝交联的PKB/Akt底物蛋白，也被称为APE (Akt phosphorylation enhancer)、GIV (Gα-interacting vesicle associated protein)。其在多种类型癌细胞及未成熟的血管内皮细胞中表达，参与多种细胞进程，包括重新构建微丝骨架、内吞作用，最终导致癌症的侵袭和血管的再生[12-13]。Girdin蛋白最早是通过酵母双杂交方法作为PKB/Akt连接蛋白而被发现的。研究显示在多种类型的生长因子刺激下，PKB/Akt能够磷酸化Girdin蛋白C-末端区域的ser-1416位点，使其在细胞迁移过程中细胞骨架的重构扮演重要角色。Girdin蛋白仅同Akt的C末端连接但是不能同其他AGC家族成员包括蛋白激酶C和SGKs相结合。表明Girdin仅参与了PKB/Akt信号途径[14]。最新研究发现，PKB/Akt依赖的Girdin磷酸化过程调节了急性心肌梗死的修复[15]。在小鼠中PKB/Akt介导的磷酸化Girdin蛋白对肿瘤相关的成纤维细胞(CAF)的侵袭和肿瘤细胞的生长也起很重要的作用[16]。然而，关于Girdin蛋白在小鼠受精卵早期分裂中同PKB/Akt的相互关系，国内、外文献却未见报道。我们根据Scansite软件(http://scansite.mit.edu)预测了PKB/Akt和鼠Girdin蛋白的相关位点。结果发现鼠在1 417位有一个丝氨酸残基，而这一位点恰恰和人Girdin蛋白丝氨酸1 416位点相一致。结合Girdin蛋白在小鼠受精卵中的研究空白及其在肿瘤细胞中的作用，进而提出假设：即PKB/Akt通过磷酸化Girdin蛋白参与调节小鼠受精卵早期发育微丝骨架的形成和分布，从而调节小鼠受精卵早期的发育。我们大胆推测PKB/Akt蛋白能够使Girdin蛋白磷酸化，磷酸化的Girdin蛋白从质膜上分离，牵引着微丝聚集在受精卵分裂处，参与形成溢缩环，并且磷酸化的Girdin蛋白同PKB/Akt结合促进PKB/Akt锚定于细胞质膜上，进而维持PKB/Akt蛋白高催化活性，促进受精卵的分裂。但是具体机制需要相应实验进行验证。因此，我们认为十分有必要对Girdin蛋白同PKB/Akt的关系进行更深一步的研究。
本研究中，在预测了小鼠受精卵中PKB/Akt和鼠Girdin蛋白的相关位点的基础上，通过实验证明了过表达PKB/Akt蛋白能够促进Girdin蛋白的磷酸化，而敲低PKB/Akt蛋白表达则抑制Girdin蛋白磷酸化。更进一步，通过共注射激活型PKB/Akt及Girdin siRNA检测小鼠受精卵发育及微丝聚集变化情况，进一步明确Girdin在PKB/Akt调控小鼠受精卵微丝聚集中的作用。为深入探讨小鼠受精卵早期发育中PKB/Akt与Girdin及微丝之间的关系、阐明小鼠受精卵早期发育的分子机理有十分重要的意义。
1 材料与试剂中国医科大学实验动物部提供昆明系SPF级雌(4-5周，16-18 g)、雄(8周，30-35 g)小白鼠(许可证号：SCXK (辽宁) 2008-0005) Girdin抗体(Santa cruz)；Girdin siRNA (Santa cruz)；Akt siRNA (m) sc-19169 (Santa cruz)；pcDNA-Akt-WT、pcDNA-Akt-KD、pcDNA-myr-Akt由本研究室构建并保存；TRITC-phalloidin (Invitrogen公司)；mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit体外转录试剂盒(Ambion公司)；小鼠Girdin-S1 417磷酸化抗体和非磷酸化抗体由中国南京川博生物技术有限公司合成；辣根过氧化酶二抗、FITC/TRITC荧光二抗(北京中山金桥)；蛋白裂解液、ECL发光试剂盒(碧云天公司)；快速微量mRNA提取纯化试剂盒(GE healthcare公司)；反转录酶、RNA酶抑制剂(Promega公司)；Hoechst33258、透明质酸酶、M2培养液、M16培养液、BSA (Sigma公司)；LB培养基(invitrogen公司)；大肠杆菌DH5α感受态细菌、限制性内切酶(Takara公司)；去内毒素质粒中量提取试剂盒(OMEGA公司)；孕马血清促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素(宁波第二激素厂)；其他试剂为国产分析纯。
2 方法2.1 小鼠超排卵及受精卵的采集昆明系SPF级4-5周龄性成熟雌鼠(18-22 g)，腹腔注射PMSG 10 IU/只，46-48 h后腹腔注射hCG 10 IU/只，当晚与8周龄以上性成熟雄性昆明系SPF级小鼠(30-35 g)合笼过夜。次日检测阴栓，有阴栓者视为交配成功。脱颈椎法处死雌鼠，取双侧输卵管，剪下置于M2培养液中，在实体镜下撕开壶腹部，让细胞团自然流出，透明质酸酶(300 μg/mL，溶于M2培养液中) 5-10 min去除颗粒细胞，在M2培养液中洗3次，加入200 μL预先在培养箱中平衡的M16培养液，上覆矿物油，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱内培养至指定时间点进行收集或进行实验。受精卵培养及收集时间按照冷泉港-小鼠胚胎实验操作手册进行。
2.2 小鼠蛋白的PKB/Akt作用靶位点的确定将小鼠Girdin蛋白序列(Q5SNZ0) (GenBank Accession No.AB087827)输入Scansite分析软件中，分析并预测Girdin蛋白中的ser1 417位点为可能的磷酸化位点，并且这个位点符合PKB/Akt作用的一致序列RXRXX (S/T)。根据预测的位点进行特异位点磷酸化抗体的制备。
2.3 体外转录将已有的野生型、激酶激活型和失活型PKB/Akt的pcDNA3.1/myc-his表达载体进行体外转录，制备野生型、磷酸化位点突变型激酶激活型和失活型PKB/Akt的mRNA，纯化mRNA并进行浓度测定(Myr-Akt代表激酶激活型、KD-Akt是激酶失活型、WT-Akt为野生型)。体外转录应用的是Ambion公司的mMESSAGE mMACH INE体外转录试剂盒，方法参照试剂盒说明书。
2.4 显微注射显微注射应用Eppendorf Transferman显微操作系统，OlympusIX-70倒置显微镜，DIC调制相差观察。显微注射在M2液滴中进行。为尽量减少显微注射对受精卵的影响，一般注入到受精卵内的样品体积为10 pl (相当于其总体积的5%)。mRNA溶解于无核酸酶污染的5 mmol/L Tris和0.5 mmol/L EDTA (pH 7.4)中，稀释成不同浓度，对照组为非注射组及注射TE缓冲液组。用DEPC处理水溶解Girdin siRNA，稀释成不同浓度。
2.5 Western印迹法检测蛋白表达分别收集经各种处理后的小鼠受精卵250个；在蛋白裂解液(20 μL)中经反复冻融3次后，加入蛋白上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min，瞬时离心后上样，以12%或10% SDS-PAGE电泳分离，转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别与Girdin-Ser1417磷酸化或非磷酸化抗体、PKB/Akt抗体及β-actin抗体(1:1 000) 4 ℃结合过夜。TBST洗涤3次后，分别与相应的HRP偶联二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，用ECL化学发光法显影。UVP凝胶成像系统扫描成像图像分析软件分析灰度值。以目标蛋白与α-tublin的灰度值比值计算各组相对表达量。每组实验重复3次。
2.6 微丝的免疫荧光化学收集经各种处理后的小鼠受精卵移入4%多聚甲醛中37 ℃固定40 min或4 ℃固定过夜。将固定后的样品移入清洗液(含0.1% BSA的DPBS)中清洗3次，每次5 min。将清洗后的样品移入透膜液(清洗液中加入0.2% TritonX-100)，在37 ℃温箱中温育40 min，增加细胞膜的通透性，以利于抗体进入。透膜处理后的样品移入清洗液中洗3次，每次5 min；每毫升清洗液中添加0.125 g甘氨酸和10 mg BSA作为封闭液，37 ℃温育l h。样品放入l:100封闭液稀释的小鼠抗girdin或Akt抗体中，37 ℃温育l h。清洗液清洗3次，每次5 min。样品与1:100清洗液稀释的FITC标记的抗兔二抗37 ℃温育40 min，未经一抗处理、只做二抗结合的样品作为阴性对照。在含有300 U/mL罗丹明标记的鬼笔环肽(TRITC-phalloidin)的DPBS溶液中，37 ℃共同温育40 min，进行微丝F-actin染色，用清洗液清洗3次，每次5 min。将经过微丝染色的样品清洗后，在含有(Hoechst33258)的清洗液中室温下温育5-10 min。在洁净的载玻片上加一滴防荧光淬灭剂DABCO，将处理好的卵转移其中，封片后置于暗盒，低温保存，尽快用激光共聚焦显微镜观察、照相。每组实验重复3次，每次至少观察30个样品。
2.7 激光共聚焦显微镜成像分析TRITC 545 nm，Hoechst33258所用激发波长为352 nm，在图象分析系统中选择目标区域取图，并做Z轴方向的光切片合成。
3 结果与分析3.1 小鼠Girdin蛋白的PKB/Akt作用靶位点的确定将小鼠Girdin蛋白序列(Q5SNZ0)输入Scansite分析软件中，根据评分(0.481 2)及序列(INRERQKSLTLTPTR)分析并预测PKB/Akt的作用位点。结合已有的文献，最后确定小鼠Girdin蛋白中的ser1 417位点为可能的磷酸化位点，并且这个位点符合PKB/Akt作用的一致序列RXRXX (S/T)。
3.2 PKB/Akt影响Girdin蛋白的磷酸化取小鼠G1期受精卵显微注射野生型和持续激活型PKB/Akt的mRNA或利用siRNA沉默PKB/Akt蛋白编码基因，通过激光共聚焦显微镜观察经持续激活型PKB/Akt mRNA、野生型PKB/Akt mRNA、激酶失活型PKB/Akt mRNA及PKB/Akt siRNA处理后小鼠受精卵中p-Girdin-1 417及F-actin的定位状态。结果显示，对照组中p-Girdin-1 417弥散分布在胞浆中，而经持续激活型PKB/Akt mRNA、野生型PKB/Akt mRNA处理后的小鼠受精卵中FITC标记的p-Girdin-1 417荧光信号较对照组及PKB/Akt siRNA处理组明显增强，并且分布位置更加集中在2-细胞分裂沟处，进一步观察发现微丝的荧光信号也在分裂沟处增强，这也说明磷酸化的Girdin蛋白可能参与了微丝的聚集(图 1)。
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| 图 1 PKB/Akt影响磷酸化Girdin蛋白定位 Figure 1 PKB/Akt affects the localization of phosphorylated Girdin protein.A distinct increase in the fluorescence signal of F-actin and P-Girdin after microinjected of Akt1-WT and myr-Akt1.Bar=20 μm. |
| 图选项 |
进一步通过免疫印迹检测Girdin的1 417位磷酸化及Girdin蛋白的总表达情况。结果显示野生型和持续激活型PKB/Akt的mRNA注射组Girdin的ser1 417位磷酸化增强但是并不影响Girdin蛋白的总的表达。siRNA介导的PKB/Akt表达敲除非常明显地降低了Girdin的磷酸化水平(图 2)。结果说明PKB/Akt可磷酸化小鼠受精卵中Girdin蛋白的1 417位丝氨酸。
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| 图 2 PKB/Akt影响Girdin蛋白磷酸化 Figure 2 PKB/Akt affects the phosphorylation of Girdin protein.Treatment with myr-Akt1 caused significant increases in phosphorylation of Girdin 1 417.In addition, treatment with KD-Akt1 mRNA or siRNA-mediated Akt1 knockdown blocked phosphorylation of Girdin. |
| 图选项 |
3.3 小鼠受精卵中微丝重构及分布与PKB/Akt、Girdin之间的关系在进一步的研究中我们首先用myr-Akt mRNA处理小鼠G1期受精卵，随后再注射Girdin siRNA。M16培养液中37 ℃、5% CO2培养箱中培养，20 h后取出进行微丝染色。通过激光共聚集荧光显微镜观察每一组卵细胞的微丝聚集状态。正如我们所预期，在Akt mRNA和Girdin siRNA共注射组微丝荧光信号出现了明显的降低，并且干扰了微丝的正确聚集(图 3)。说明PKB/Akt可通过作用Girdin蛋白影响微丝聚集。
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| 图 3 PKB/Akt通过Girdin蛋白调控小鼠受精卵微丝聚集 Figure 3 PKB/Akt regulation of the aggregation of actin filaments by the action of Girdin protein in mouse fertilized eggs.A distinct decrease in the fluorescence signal of F-actin and the disrupted microfilament aggregation after microinjected of Akt1 mRNA and Girdin siRNA.Bar=20 μm. |
| 图选项 |
4 讨论Girdin蛋白最早是通过酵母双杂交方法作为PKB/Akt连接蛋白而被发现的。有文献研究表明PKB/Akt可磷酸化Girdin的serine1 416位，磷酸化的Girdin使微丝从质膜上分离，随后聚集在迁移细胞边缘，导致微丝骨架的重新排列影响细胞的运动[14]。多项研究表明Girdin在肿瘤细胞的迁移、侵润和转移中都扮演重要角色[17-20]。新近研究发现，Girdin蛋白通过PI3K-Akt途径调控胶质瘤细胞的迁移及侵袭[21]。也有研究小组提出Girdin蛋白可增强PKB/Akt活性调控DNA合成[22]。而Cenni等则提出PKB/Akt可直接作用于微丝[23]。然而，关于PKB/Akt调控小鼠受精卵微丝的聚集过程是否通过Girdin蛋白的作用还未见报道。
本实验研究结果显示PKB/Akt能够磷酸化Girdin蛋白的Ser-1 417位点，用phospho-Ser-1 417抗体检测发现在野生型Akt mRNA及激活型Akt mRNA处理后的小鼠受精卵中Girdin蛋白呈磷酸化状态，而Akt siRNA处理后阻止了Girdin的磷酸化。激光共聚焦观测显示，同非磷酸化的Girdin蛋白相比较，磷酸化的Girdin蛋白突出显现在受精卵卵裂沟处。上述结果说明PKB/Akt能通过调控Girdin蛋白的磷酸化，通过亚细胞定位发现能够促进小鼠受精卵细胞的分裂。我们分析磷酸化的Girdin蛋白从质膜上分离，牵引着微丝聚集在受精卵分裂处，参与形成溢缩环，进而促进受精卵的分裂。为了进一步明确PKB/Akt同Girdin蛋白的调控关系，我们采取激活型Akt mRNA和Girdin siRNA共注射的方法检测受精卵中微丝聚集改变情况。结果显示在Akt mRNA和Girdin siRNA共注射组微丝荧光信号在二细胞分裂沟处出现了明显的降低，显示微丝的正确聚集受到影响。综上结果，我们认为在小鼠受精卵中PKB/Akt通过磷酸化Girdin蛋白改变微丝的聚集进而影响受精卵早期的正常卵裂。
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