, 金坚 江南大学 药学院，江苏 无锡 214122
摘要：肝癌先天性多表达多药耐药基因，严重影响肝癌的化疗效果，筛选肝癌细胞中的耐药基因，研究其耐药机制有助于提高肝癌化疗效果，提高肝癌的治愈率。首先构建肝癌细胞逆转录病毒的cDNA文库，感染成纤维细胞，使得逆转录病毒基因整合进细胞，加药筛选，存活细胞中的基因再次包装成病毒，用于下一轮筛选。采用循环包装回收 (Cyclical packaging rescue，CPR) 技术进行肝癌细胞耐药基因的筛选即是通过病毒包装将基因从细胞中钓取出来，相比于常规筛选方法，仅通过一轮筛选可能会出现很多假阳性基因，采用CPR技术则是通过多轮筛选，很大程度减少了假阳性细胞的出现。通过该方法经过四轮筛选获得核糖体蛋白S11 (RPS11)、核糖体蛋白L6 (RPL6)、核糖体蛋白L11 (RPL11)、核糖体蛋白L24 (RPL24) 等几种基因，经初步检测，增加了细胞的耐药性。
关键词： 循环包装回收技术肝癌cDNA文库耐药基因
Screening of drug resistent gene by cyclical packaging rescue of hepatocellular carcinoma retroviral cDNA libraries
Wenyan Dai, Ruiyu Zhu
, Jian Jin School of Pharmaceutics, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
Received: March 17, 2015; Accepted:April 27, 2015
Corresponding authors: Ruiyu Zhu. E-mail: ry_zhu@sina.comJian Jin. Tel: +86-510-85918219; E-mail: jinjian31@hotmail.com;
Abstract: Multidrug resistant genes are highly expressed in hepatocellular carcinoma that seriously affects the effect of chemotherapy. Screening of resistant genes from HCC cells and studying its mechanism of drug resistance will be helpful to improve the effecacy of chemotherapy for hepatocellular carcinoma. Here we described an alternative method called cyclical packaging rescue (CPR). First we constructed a retrovirus cDNA library of hepatoma cells and used it to infect fibroblasts. Then we added drugs to screen survival cells. The survival cells, stably integrated helper-free retroviral libraries, were recovered rapidly after transfection with plasmids expressing retroviral gag-pol and env genes. Through this method, retroviral RNAs were directly repackaged into new infectious virions. Recovered retroviral supernatant was then used to reinfect fresh target cells. When performed in concert with selection using functional assays, cDNAs regulating functional responses could be identified by enrichment through multiple rounds of retroviral library recovery and retransmission. Using CPR, we obtained several cDNAs. After a preliminary detection, we found Ribosomal protein S11 (RPS11), Ribosomal protein L6 (RPL6), Ribosomal protein L11 (RPL11), Ribosomal protein L24 (RPL24) possibly had drug resistant function.
Keywords: cyclical packaging rescuehepatocellular carcinomacDNA librariesdrug resistant genes
近年来，随着功能基因研究的不断深入，高效快捷的功能基因筛选方法受到广泛关注。循环包装回收 (CPR) 技术是在2002年美国科学院院报 (PNAS) 的一篇文献上首次应用，并筛选出多个功能基因[1]。此后，对采用CPR技术筛选的功能基因iRhom2进行研究，其成果刊登在2012年美国Science杂志上[2]。CPR技术的成功运用显示了其在功能基因筛选领域的优越性，但是在国内还未曾有使用该技术进行功能基因筛选的相关报道。
CPR技术筛选的一个大致过程如下：首先用逆转录病毒的cDNA文库感染宿主细胞，使得逆转录病毒的cDNA文库中的基因整合到宿主细胞进行表达，再加药处理细胞，使得细胞90%死亡，存活的细胞用逆转录病毒的包装质粒pGP vector和pE-eco vector将细胞的中的基因重新包装成病毒，再用于下一轮感染宿主细胞。
CPR筛选的具体流程如图1所示。
 |
| 图1 CPR筛选流程图 Fig.1 The flow chart of CPR. |
| 图选项 |
采用CPR技术筛选逆转录病毒的cDNA文库中的功能基因在很大程度上减少了假阳性细胞的出现，更加高效地从逆转录病毒的cDNA文库分离获得功能基因[3, 4, 5, 6, 7, 8]。
在我国，肝癌被称为“癌症之王”，在恶性肿瘤死亡率中位居第二，仅次于肺癌[9, 10, 11]。肝癌先天性多表达多药耐药基因，严重影响化疗效果[12, 13, 14]。因此肝癌治疗过程中的耐药性受到了广泛的关注，促使科研工作者加强对肝癌耐药方面的研究。目前普遍认为肿瘤耐药机制的发生与多种耐药相关的酶和蛋白有关，采用CPR技术筛选肝癌细胞耐药基因，研究耐药机制，有助于缓解肝癌耐药，促进肝癌治疗技术的发展。
1 材料与方法 1.1 实验试剂、菌株、细胞株 RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司。SMARTTM cDNA Library Construction Kit购自Clontech (美国)。逆转录病毒包装试剂盒、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA marker均购自宝生物工程 (大连) 有限公司。Expand High Fidelity PCR System购自Roche公司。DMEM、1640细胞培养基和胎牛血清购自Gibco公司。胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自天根生化科技 (北京) 有限公司。Cell Titer-Blue® Cell Viability Assay购自Promega公司。293T细胞、NIH-3T3细胞、Bel-7402细胞均为本实验室保存。
1.2 肝癌细胞cDNA文库的构建 总RNA的提取：取对数生长期的肝癌细胞Bel-7402，加入适量的Trizol，按照说明书的步骤提取总RNA，电泳检测RNA的完整性，并测定OD值检测RNA的纯度。
cDNA文库的构建：根据Smart cDNA library 构建试剂盒(Clontech) 说明书进行肝癌细胞文库的构建。首先以提取的总RNA为模板，有SfiⅠ酶切位点的SMART IV Oligonucleotide和CDSⅢ/3′ PCR primer为引物，在反转录酶作用下转录合成cDNA第一链。根据PCR仪以及模板用量，确定最佳循环数后，合成cDNA第二链。双链cDNA经蛋白酶K消化以及SfiⅠ酶切及片段纯化后，进行DNA的分级，连接到pLIB载体上，转化，提取质粒，获得cDNA文库。
cDNA文库丰度的检测：以cDNA文库为模板，载体两端序列为引物进行PCR扩增，检测文库的丰度。
1.3 逆转录病毒的包装 逆转录病毒表达系统通常是由逆转录病毒载体、两个包膜蛋白载体和包装细胞系组成。本研究选用293T细胞作为包装细胞，用连逆转录病毒载体cDNA文库、pGP vector和pE-eco vector质粒共转染，分别收集转染24、48和72 h的病毒，并测定逆转录病毒的滴度。
1.4 耐药基因的筛选 CPR技术是一种循环病毒包装技术。CPR筛选过程中，首先选择一株比较敏感的成纤维细胞NIH-3T3作为宿主细胞，这样就减少了由于宿主细胞耐药产生的假阳性现象。首先NIH-3T3细胞铺六孔板，12 h后细胞汇合度大概在80%左右，采用稀释适当倍数的逆转录病毒进行感染，48 h后，撤去病毒上清，将细胞消化到两个直径10 cm的细胞培养皿中继续培养24 h，然后加阿霉素处理细胞48 h，使得细胞死亡率达到90%。再次更换新鲜的培养基培养使细胞状态得到恢复，然后转染pGP vector和pE-eco vector将细胞里面的基因包装成病毒，用于下一轮筛选。转染过的细胞提取细胞基因组，以基因组作为模板，使用载体两端的引物进行PCR，检测细胞中目的基因的情况。
1.5 耐药基因功能的初步验证 PCR产物中出现特异性条带的部分割胶回收，然后酶切再次连接到逆转录病毒的载体pLIB上，转化挑取单菌落，进行测序。然后提取质粒转染宿主细胞，转染24 h后，加入不同浓度的阿霉素，48 h后，采用Promega公司试剂盒CellTiter-Blue® Cell Viability Assay测定宿主细胞耐药指数。
2 结果与分析 2.1 肝癌细胞cDNA文库的构建 2.1.1 总RNA提取和双链DNA的合成 在cDNA文库构建过程中，RNA的提取是第一步，这一步骤直接关系到构建的cDNA文库的质量，RNA如果降解将会降低文库的丰度。图2A是提取的RNA的凝胶电泳图，泳道M为1 kb的Marker，泳道1为细胞Bel-7402的RNA，显示28S和18S的条带较亮，28S条带的亮度 约为18S亮度的2倍，且5S的条带几乎看不到，说明RNA在提取过程中几乎没有降解。检测RNA的OD280和OD260，比值为1.83。从RNA的电泳图以及RNA的OD280和OD260分析所得，RNA提取质量符合文库构建的要求。在合成cDNA双链的过程中实际上就直接关系到最终连接到载体上的DNA片段的大小，所以在这一实验过程中必须保持双链DNA的弥散程度，此外不应该有特异性条带出现，特异性条带的出现会导致构建的cDNA文库中相同基因的量增加，使得库容量降低。图2B中泳道M为1 kb plus Marker，泳道1为细胞Bel-7402的dsDNA，由图可知dsDNA的条带主要集中在0.4-2 kb之间，且没有特异性的条带。
 |
| 图2 细胞Bel-7402的RNA和dsDNA电泳图 Fig.2 Electrophoresis analysis of total RNA and dsDNA of Bel-7402. |
| 图选项 |
2.1.2 cDNA文库丰度的检测 cDNA连接到载体上转化之后进行克隆数计数，本实验中Bel-7402细胞转化后共涂40个直径15 cm的培养皿，为了计算涂布之后的克隆数，选择涂布前的菌液取2 μL稀释至100 μL，然后涂板计算克隆数，最终乘以稀释倍数，计算总克隆数。此外还计算了空载率大概在2.7%左右。除去空载，计算所得Bel-7402克隆数大概为1.3×106个。
采用pLIB载体SfiⅠ酶切位点附近的序列作为引物，检测文库的丰度，电泳结果如图3所示，泳道M为1 kb plus的Marker，泳道1为Bel-7402的cDNA文库PCR的结果，cDNA片段大小基本在0.4-2 kb之间，与SMART法构建的cDNA文库所要求的片段大小一致。
 |
| 图3 Bel-7402细胞cDNA文库PCR电泳图 Fig.3 Electrophoresis analysis of PCR of cDNA libraries of Bel-7402. |
| 图选项 |
2.2 逆转录病毒滴度测定 病毒包装完成之后必须要对病毒的滴度进行测定，从而确定下一步感染细胞时稀释的倍数。在本实验中采用了荧光定量PCR的方法进行病毒滴度的测定。图4为荧光定量PCR测定模板RNA的标准曲线。
 |
| 图4 RNA模板标准曲线 Fig.4 A standard cure by using RNA control template. |
| 图选项 |
依据标准曲线，根据所测样品的Ct算所测病毒的滴度分别为：
24 h收集的病毒：2.22×106 ivp/mL；
48 h收集的病毒：4.19×107 ivp/mL；
72 h收集的病毒：3.00×107 ivp/mL。
2.3 耐药基因筛选 采用CPR技术进行耐药基因筛选后，每一轮筛选后的细胞包装过病毒之后提取细胞基因组，进行基因组PCR，电泳结果如图5-8所示 (其中M为DL2 000的Marker，标号1、2、3、4……均代表六孔板中同一批次不同孔的细胞所提的基因组)。从结果可以看出，第一轮 (图5) 和第二轮 (图6) 筛选的条带比较弥散，没有特异性的条带，而第三轮 (图7) 和第四轮 (图8) 筛选之后可以发现条带仍比较弥散，但是已经有一些特异性的条带出现，这些特异性的条带中可能就存在具有耐药功能的基因。
 |
| 图5 CPR第一轮筛选细胞基因组PCR Fig.5 The first selection round of CPR. |
| 图选项 |
 |
| 图6 CPR第二轮筛选细胞基因组PCR Fig.6 The second selection round of CPR. |
| 图选项 |
 |
| 图7 CPR第三轮筛选细胞基因组PCR Fig.7 The third selection round of CPR. |
| 图选项 |
 |
| 图8 CPR第四轮筛选细胞基因组PCR Fig.8 The fourth selection round of CPR. |
| 图选项 |
2.4 耐药基因耐药性的初步检验 将第四轮筛选中特异性条带的部分割胶回收，连接到pLIB载体上，转化挑单克隆送去测序。经测序出现频率比较高的有核糖体蛋白S11 (RPS11)、核糖体蛋白L6 (RPL6)、核糖体蛋白 L11 (RPL11)、核糖体蛋白L24 (RPL24)、细胞色素氧化酶亚基Ⅱ (COX2) 等几种基因。提取这几种基因的质粒，转染进NIH-3T3细胞测定NIH-3T3细胞的耐药指数 (图9)，从实验结果分析所得，有RPS11、RPL6、RPL11、RPL24几种基因的耐药指数有所上升，但其具体耐药功能还有待进一步验证。
 |
| 图9 选出的基因的耐药性的测定 Fig.9 The determination of drug resistent index of the screening genes. |
| 图选项 |
3 讨论 本研究构建了肝癌细胞逆转录病毒的全长cDNA文库，采用CPR技术进行肝癌细胞中耐药基因的筛选。该技术最大的优势在于多轮循环筛选，很大程度减少了假阳性细胞的出现，增加筛选出的耐药基因的可信度。CPR技术实现了以哺乳动物细胞为宿主的功能基因筛选，此外这种方法通过循环病毒包装回收技术也可以实现功能基因在哺乳动物细胞间的传递，使基因功能的鉴定更加快速方便。
本研究筛选获得RPS11、RPL6、COX2、RPL11、RPL24等几种基因，经初步检测RPS11、RPL6、RPL11、RPL24增加了细胞的耐药性。通过查阅文献发现这几种基因在细胞的调控过程中都发挥着重要的作用[15, 16, 17, 18]。例如RPL6基因属于核糖体L6蛋白，有相关文献显示，在p53调控通路中发挥着重要作用，且在耐药细胞中蛋白表达量增加[19, 20, 21, 22]。RPS11与蛋白泛素化过程密切相关，而这一过程又关系到细胞的癌变[23]。关于RPL11在恶性肿瘤中的研究尚不是很多，但是RPL11与mTOR通路和p53因子间相关，RPL11能够保持p53稳定，但雷帕霉素抑制剂能够下调RPL11的表达，从而破坏RPL11与p53之间的稳定[16]。此外已有研究表明RPL24的过表达会引起肝癌细胞的耐药[24, 25]。但是这些因子具体如何在肝癌细胞的耐药通路中发挥作用还有待后续进一步研究。
在耐药基因功能的初步鉴定中发现筛选获得的细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ (COX2) 不能发挥耐药功能。COX2是细胞色素氧化酶的一个亚基，必须要通过与其他亚基和辅助因子组装才能发挥酶活性。这一因子单独转染细胞可能无法发挥其功能，但是与其他因子相互作用是否能发挥耐药功能也有待进一步研究。
对筛选出的耐药基因进行功能研究，有助于进一步研究肝癌的耐药机制，为肝癌患者提供个性化的治疗方案，且促进抗肝癌药物新靶点的发现。
参考文献
| [1] | Bhattacharya D, Logue EC, Bakkour S, et al. Identification of gene function by cyclical packaging rescue of retroviral cDNA libraries. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(13): 8838-8843. |
| [2] | McIlwain DR, Lang PA, Maretzky T, et al. iRhom2 regulation of TACE controls TNF-mediated protection against Listeria and responses to LPS. Science, 2012, 335(6065): 229-232. |
| [3] | Whitehead I, Kirk H, Kay R. Expression cloning of oncogenes by retroviral transfer of cDNA libraries. Mol Cell Biol, 1995, 15(2): 704-710. |
| [4] | Kitamura T, Onishi M, Kinoshita S, et al. Efficient screening of retroviral cDNA expression libraries. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92(20): 9146-9150. |
| [5] | Duan Y, Naruse T, Nakamura M, et al. Expression and functional analysis of a hemopoietic progenitor antigen, NJ-1 (114/A10), in the megakaryocytic lineage. Biochem Biophys Res Commun, 1998, 253(2): 401-406. |
| [6] | He YW, Deftos ML, Ojala EW, et al. RORgamma t, a novel isoform of an orphan receptor, negatively regulates Fas ligand expression and IL-2 production in T cells. Immunity, 1998, 9(6): 797-806. |
| [7] | Hitoshi Y, Lorens J, Kitada SI, et al. Toso, a cell surface, specific regulator of Fas-induced apoptosis in T cells. Immunity, 1998, 8(4): 461-471. |
| [8] | Whitehead I, Kirk H, Kay R. Retroviral transduction and oncogenic selection of a cDNA encoding Dbs, a homolog of the Dbl guanine nucleotide exchange factor. Oncogene, 1995, 10(4): 713-721. |
| [9] | Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin, 2005, 55(2): 74-108. |
| [10] | Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69-90. |
| [11] | Torre L A, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2): 87-108. |
| [12] | Chang XB. Molecular mechanism of ATP-dependent solute transport by multidrug resistance-associated protein 1. Methods Mol Biol, 2010, 596: 223-249. |
| [13] | Sodani K, Patel A, Kathawala RJ, et al. Multidrug resistance associated proteins in multidrug resistance. Chin J Cancer, 2012, 31(2): 58-72. |
| [14] | Chen KG, Sikic BI. Molecular pathways: regulation and therapeutic implications of multidrug resistance. Clin Cancer Res, 2012, 18(7): 1863-1869. |
| [15] | Zhou F, Roy B, von Arnim AG. Translation reinitiation and development are compromised in similar ways by mutations in translation initiation factor eIF3h and the ribosomal protein RPL24. BMC Plant Biol, 2010, 10(1): 193. |
| [16] | Goudarzi KM, Nistér M, Lindstrém MS. mTOR inhibitors blunt the p53 response to nucleolar stress by regulating RPL11 and MDM2 levels. Cancer Biol Ther, 2014, 15(11): 1499-1514. |
| [17] | Morgado-Palacin L, Llanos S, Urbano-Cuadrado M, et al. Non-genotoxic activation of p53 through the RPL11-dependent ribosomal stress pathway. Carcinogenesis 2014, 35(12): 2822-2830. |
| [18] | Yajima S, Ishii M, Matsushita H, et al. Expression profiling of fecal colonocytes for RNA-based screening of colorectal cancer. Int J Oncol, 2007, 31(5): 1029-1037. |
| [19] | Wang X, Lan M, Shi YQ, et al. Differential display of vincristine-resistance-related genes in gastric cancer SGC7901 cells. World J Gastroenterol, 2002, 8(1): 54-59. |
| [20] | Du J, Shi Y, Pan Y, et al. Regulation of multidrug resistance by ribosomal protein L6 in gastric cancer cells. Cancer Biol Ther, 2005, 4(2): 250-255. |
| [21] | Wu Q, Gou Y, Wang Q, et al. Downregulation of RPL6 by siRNA inhibits proliferation and cell cycle progression of human gastric cancer cell lines. PLoS ONE, 2011, 6(10): e26401. |
| [22] | Kubo N, Fujimoto M, Arimura S, et al. Transfer of rice mitochondrial ribosomal protein L6 gene to the nucleus: acquisition of the 5'-untranslated region via a transposable element. BMC Evol Biol, 2008, 8: 314. |
| [23] | Bengsc F, Tu Z, Tang HY, et al. Comprehensive analysis of the ubiquitinome during oncogene-induced senescence in human fibroblasts. Cell Cycle, 2015, 14(10): 1540-1547. |
| [24] | Guo YL, Kong QS, Liu HS, et al. Drug resistance effects of ribosomal protein L24 overexpression in hepatocellular carcinoma HepG2 cells. Asian Pac J Cancer Prev, 2014, 15(22): 9853-9857. |
| [25] | Barkic M, Crnomarkovic S, Grabusic K, et al. The p53 tumor suppressor causes congenital malformations in Rpl24-deficient mice and promotes their survival. Mol Cell Biol, 2009, 29(10): 2489-2504. |
