, 孟德梅1,2,31 天津科技大学 食品工程与生物技术学院 教育部食品营养与安全重点实验室，天津 300457
2 天津市食品营养与安全和药物化学联合实验室，天津 300457
3 天津科技大学 新农村发展研究院，天津 300457
基金项目：天津市应用基础与前沿技术研究计划 (No. 13JCYBJC41900)，天津科技大学引进人才科研启动费 (No. 20130420)，联合国国际遗传工程与生物技术中心 (ICGEB) 研究项目 (No. CRP/CHN15-01) 资助
摘要: IFT46是纤毛内运输蛋白IFT复合物B (IFT-B) 的一个重要组分，对于纤毛的组装、运动和感知发挥着重要作用。为深入研究IFT46的作用机制，利用ift46基因全序列分别构建了带有GST和MBP标签的原核表达载体pGEX-2T-ift46和pMAL-C2X-ift46，并转入大肠杆菌BL21 (DE3) 诱导表达，以15% SDS-PAGE鉴定，分别获得了分子量为70、86 kDa的重组GST/MBP-IFT46融合蛋白。将亲和纯化的GST-IFT46融合蛋白 (纯度95%以上) 免疫新西兰大白兔，采集第5次免疫后血清用ELISA测定效价为1∶256 000。抗血清依次经Protein A和固定在MBP-IFT46纯化后，用Western blotting 和免疫荧光检测抗体特异性，结果表明制备的多克隆抗体能很好地识别莱茵衣藻中的IFT46，而且发现IFT46绝大部分定位在纤毛基体，极少部分沿纤毛呈点状分布，为继续开展 IFT46在肥胖症、糖尿病、多囊肾病等纤毛相关疾病中作用机制的研究奠定了重要基础。
关键词: 莱茵衣藻 纤毛 IFT46 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体
Prokaryotic expression and purification of Chlamydomonas reinhardtii intraflagellar transport protein 46(IFT46) and preparation of polyclonal antibody
Ren Haiyue1, Dong Bin1, Fan Zhenchuan1,2,3
, Meng Demei1,2,3 1 Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education,College of Food Science and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;
2 International Research Center of Tianjin for Food Nutrition and Safety and Medicinal Chemical,Tianjin 300457,China;
3 The new rural development research institute of Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China
Received: November 10, 2015; Accepted: January 19, 2016
Supported by:Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology (No. 13JCYBJC41900), Tianjin University of Science & Technology Foundation for Returned Scholars (No. 20130420), ICGEB Research Grants 2015 (No. CRP/CHN15-01)
Corresponding authors:Zhenchuan Fan. Tel/Fax: +86-22-60912419; E-mail: fanzhen@tust.edu.cn
Demei Meng. Tel: +86-22-60912418; Fax: +86-22-60602419; E-mail: mengdm@tust.edu.cn
Abstract: IFT46 is one of the important components of intraflagellar transport complex B inChlamydomonas reinhardtii,and plays important roles in the assembly,movement and perception of ciliary. To study its functional mechanism,a GST-tagged and an MBP-tagged prokaryotic expression plasmid,pGEX-2T-ift46 and pMAL-C2X-ift46 were constructed,respectively,by inserting ift46 into the pGEX-2T and pMAL-C2X vector,and then transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) for protein expression. SDS-PAGE (15%) analysis results showed that the molecular weights of the fusion protein GST-IFT46 and MBP-IFT46 were 70 kDa and 86 kDa,respectively. We used the fusion protein GST-IFT46 purified by affinity adsorption purification (more than 95% purity) for immunity to New Zealand white rabbits. The 5th immune serum was collected and the antibody titer was determined to be 256 000 by ELISA. The antiserum was purified by Protein A affinity adsorption purification and immobilized MBP-IFT46 purification,and the specificity of polyclonal antibodies was evaluated by Western blotting and immunofluorescence. Results showed that the polyclonal antibody prepared could specifically and precisely bind IFT46 in C. reinhardtii,and IFT46 was mainly concentrated at basal body regions and few localized along the entire length of the flagellum as punctuated dots,which will make a foundation to further study the mechanism of IFT46 in cilia related diseases such as obesity,diabetes and polycystic kidney disease.
Key words: Chlamydomonas reinhardtii flagellar IFT46,prokaryotic expression protein affinity purification polyclonal antibody
莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii是一种单细胞真核藻类，其细胞一侧两条等长的纤毛赋予了其游动的能力[1-2]。纤毛是一种细胞表面突起的亚细胞结构，主要组成部分为细胞微管，是一种从原生生物到脊椎动物都存在的保守细胞器[3]。纤毛不仅在脊椎动物胚胎发育过程中起着重要作用[4-5]，而且在信号传导方面也起着重要作用，如脊椎动物的视觉、听觉和嗅觉都依赖于纤毛的调控[6-7]。多项研究报道，纤毛的结构或功能障碍会导致许多疾病[8-9]，如多囊肾病、视网膜变性、脑积水和不孕等。然而，纤毛的组装与功能的发挥依赖于纤毛内运输机制。
纤毛内运输 (intraflagellar transport，IFT) 是发生在纤毛膜和纤毛轴丝之间，从纤毛基部到顶部的一种蛋白质复合体双向运输过程[10-11]，主要由IFT颗粒、顺行的马达蛋白和逆行的马达蛋白[12] 3个部分完成。其中，IFT颗粒由IFT-A和IFT-B两个蛋白复合物组成[13]。研究发现[14-15]，IFT-A和IFT-B蛋白组分突变均可引发纤毛相关疾病，如Bardet-Biedl综合症、Joubert综合症等[16]。IFT46是IFT-B的一个重要组分，在有纤毛的生物中是高度保守的，也是纤毛组装所必需的成分。多项研究报道，IFT46不仅在脊椎动物发育过程中发挥重要作用[17]，而且无脊椎动物中ift46基因的突变或缺失也会导致纤毛组装缺陷[18-19]。因此，利用莱茵衣藻这种模式生物来研究ift46在纤毛组装中的作用机制，将对于其他生物中纤毛组装机制的阐明奠定重要理论基础。
制备高特异性和灵敏性的莱茵衣藻IFT46抗体，是顺利完成IFT46在纤毛组装中发挥功能和发挥部位的确定及作用机制阐明的重要前提。因此，本实验室采用简单和经济的原核表达方法制备了高特异性的IFT46抗体，并运用多种方法对抗体纯化以提高抗体特异性。此外，利用Western blotting、免疫荧光等方法检测了抗体的特异性，从而为全面鉴定IFT46在纤毛装配中的作用机制，并为最终理解纤毛病的致病机理奠定了重要基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株和质粒大肠杆菌Escherichia coli XL1-blue、BL21 (DE3) 感受态细胞和pGAD-ift46质粒均为本实验室保存。
1.1.2 主要试剂限制性内切酶、DNA连接酶、DNA分子量Marker和蛋白Marker等均购自美国Thermo公司；Glutathione SepharoseTM 4B和Dextrin SepharoseTM High Performance蛋白纯化介质以及Protein A SepharoseTM CL-4B抗体纯化介质均购自美国GE Healthcare 公司；NC膜购自北京索来宝公司；弗式完全佐剂和不完全佐剂均购自美国Sigma公司；HRP标记的羊抗兔抗体及荧光标记 (Alexa Fluor 488) 的羊抗兔抗体均购自美国Cell Signaling公司；AP标记的羊抗兔抗体购自北京康为世纪公司。其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.1.3 试验动物新西兰大白兔2只，体重1.5-2.0 kg，由天津欧阳实验种兔场提供。
1.2 方法1.2.1 pGEX-2T-ift46和pMAL-C2X-ift46原核表达载体的构建以pGAD-ift46质粒为模板，用上游引物5′-ATGGATCCATGGATGACTCTATGG-3′ (斜体部分为BamHⅠ限制性酶切位点)、下游引物5′-CTAAGCTTTCACAAGCCCAGCACA-3′ (斜体部分为Hind Ⅲ限制性酶切位点) 进行ift46基 因扩增。然后再用BamHⅠ和Hind Ⅲ将回收的目的基因、pGEX-2T和pMAL-C2X载体进行双酶切，然后将目的基因分别与两个载体用T4 DNA连接酶连接后，转化入E. coli XL1-blue感受态细胞，挑取阳性菌落过夜培养，提取质粒，酶切和测序验证。
1.2.2 GST-IFT46融合蛋白的诱导表达及鉴定将正确的重组质粒pGEX-2T-ift46转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，挑取单菌落于LB液体培养基中 (含120 μg/mL氨苄青霉素) 过夜培养，再以1∶20的比例放大培养至OD为0.6-0.8，加入0.2 mmol/L IPTG，28 ℃下诱导6 h使蛋白大量表达，同时设置对照组即不加IPTG诱导组。离心收集菌体并超声裂解获得全蛋白，全蛋白经4 ℃离心 (12 000 r/min，15 min) 收集上清和沉淀。取全蛋白、上清和沉淀分别与2×蛋白上样缓冲液混合后进行15% SDS-PAGE电泳检测。
1.2.3 GST-IFT46融合蛋白的纯化将诱导表达后的菌体进行超声波破碎后，离心 (4 ℃、12 000 r/min 15 min)，取上清用 0.45 μm滤膜过滤后加入到预先平衡好的Glutathione SepharoseTM 4B纯化柱中，37 ℃结合1 h后使样品流经纯化柱，用洗涤缓冲液 (50 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，pH 7.4) 洗去杂蛋白，再用洗脱缓冲液 (50 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，10 mmol/L还原型谷胱甘肽，pH 7.4) 洗脱并收集目的蛋白。将洗脱出的目的蛋白进行15%的SDS-PAGE分析。
1.2.4 多克隆抗体的制备取2 mg纯化后的GST-IFT46融合蛋白与 2 mL弗氏佐剂混合后乳化完全，免疫新西兰大白兔，采用颈背部多点注射法，初次免疫使用弗氏完全佐剂且免疫前耳动脉采血[20]作为阴性对照血清。后每10天进行加强免疫，使用弗氏不完全佐剂，一共加强免疫4次，最后一次加强免疫后耳动脉采血，利用间接ELISA法测定抗血清的效价，效价合格后，股动脉采血，4 ℃静置过夜后收集血清，分装冻存。
1.2.5 多克隆抗体效价的检测本实验采用间接ELISA法测定抗血清的效价，以MBP-IFT46融合蛋白作为包被抗原，用5%的脱脂乳粉封闭后，以所得的抗血清为一抗，辣根过氧化物酶 (HPR) 标记的羊抗兔抗体为二抗，然后经过TMB (3′,3′,5′,5′-四甲基联苯胺) 显色，利用酶标仪测定OD450处的吸光值，并计算出抗血清的效价，实验组血清OD450/阴性对照血清OD450≥2.0为阳性，其最高稀释度即为抗血清的效价。
1.2.6 多克隆抗体的纯化分离完的抗血清首先使用Protein A SepharoseTM CL-4B亲和纯化专一性吸附IgG，去除IgG之外的其他抗体分子，纯化条件为：结合缓冲液C (12 mmol/L Na2HPO4，8 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0)，洗脱缓冲液C (0.1 mol/L甘氨酸，pH 2.7)，流速0.5 mL/min。收集吸收峰对应的洗脱液，用1 mol/L Tris-HCl (ph 9.0) 将洗脱液pH值调至中性。然后将Protein A SepharoseTM纯化完的抗体采用MBP-IFT46免疫亲和纯化法进一步纯化[21]：首先将MBP-IFT46融合蛋白固定到琼脂糖凝胶树脂上，使其专一性吸附IFT46的抗体，随后再将抗体洗脱下来，Western blotting检测显示还会有一些非特异性吸附的抗体，因此本实验又采用了将MBP-IFT46融合蛋白固定在硝酸纤维素膜亲和纯化法[22]进一步纯化，经Western blotting检测多克隆抗体的特异性。
1.2.7 免疫印迹及免疫荧光法检测多克隆抗体的特异性免疫印迹：取6 μL处理后的莱茵衣藻上清[23]，加入1.5 μL 5×上样缓冲液混匀，进行SDS-PAGE和电转印后，衣藻蛋白转移到PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭；多克隆抗体稀释度1∶1 000，二抗分别为碱性磷酸酶 (AP) 和辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的羊抗兔IgG，稀释度为1∶5 000，然后加入显色液使底物显色 (即AP法) 或曝光压片显影 (即ECL法)[24]。免疫荧光法：首先收集状态良好的莱茵衣藻细胞，经处理后固定到载玻片上并加入甲醇通透[23]，然后加入5%的BSA封闭，之后依次用制备的多克隆抗体和荧光标记的二抗 (Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 稀释度1∶400) 孵育，最后经封片干燥后用显微镜拍照[25]。
2 结果与分析2.1 pGEX-2T-ift46和pMAL-C2X-ift46原核表达载体的构建PCR扩增获得约1 035 bp的片段 (图 1A)，与ift46预期大小一致。将构建的 pGEX-2T-ift46和pMAL-C2X-ift46重组表达载体进行BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切验证如图 1B所示，均获得条带大小约为1 035 bp的目的片段，并经测序验证序列完全正确，说明表达载体构建成功。
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| 图 1 ift46的PCR扩增和重组表达质粒的双酶切验证 Figure 1 PCR amplication of ift46 and the identification of recombinant expression plasmid by restriction enzyme digestion. (A) PCR verification of ift46 gene. 1: PCR product of ift46 gene; M: 1 kb marker. (B) Restriction digestion analysis of pGEX-2T-ift46 and pMAL-C2X-ift46. M: 1 kb marker; 1: pGEX-2T-ift46 digested with BamHⅠand Hind Ⅲ; 2: pMAL-C2X-ift46 digested with BamHⅠand Hind Ⅲ |
| 图选项 |
2.2 GST-IFT46和MBP-IFT46融合蛋白的诱导表达在IPTG的诱导下，含有pGEX-2T-ift46和pMAL-C2X-ift46质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)菌株会大量表达目的蛋白，菌体经超声破碎后获得全蛋白，所得全蛋白经低温高速离心分离上清和沉淀，然后经电泳、染色、脱色后分别在约70 kDa和86 kDa处可以看到目的蛋白大量表达，且蛋白的表达主要在上清中，其表达结果如图 2所示，其中图 2A为GST-IFT46融合蛋白的表达，图 2B为MBP-IFT46融合蛋白的表达。
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| 图 2 SDS-PAGE检测重组蛋白在E. coli BL21 (DE3) 中的表达 Figure 2 SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant protein in E. coli BL21 (DE3). (A) Expression of the recombinant protein GST-IFT46. 1: the total protein of BL21 lysates with GST-IFT46 before induced; 2: the supernatant of BL21 lysates with GST-IFT46 before induced; 3: the sediment of BL21 lysates with GST-IFT46 before induced; 4: the total protein of BL21 lysates with GST-IFT46 induced with IPTG; 5: the supernatant of BL21 lysates with GST-IFT46 induced with IPTG; 6: the sediment of BL21 lysates with GST-IFT46 induced with IPTG; M: protein marker. (B) Expression of the recombinant protein MBP-IFT46. 1: the total protein of BL21 lysates with MBP-IFT46 before induced; 2: the supernatant of BL21 lysates with MBP-IFT46 before induced; 3: the sediment of BL21 lysates with MBP-IFT46 before induced; 4: the total protein of BL21 lysates with MBP-IFT46 induced with IPTG; 5: the supernatant of BL21 lysates with MBP-IFT46 induced with IPTG; 6: the sediment of BL21 lysates with MBP-IFT46 induced with IPTG; M: protein marker. |
| 图选项 |
2.3 GST-IFT46融合蛋白的纯化由上述可知GST-IFT46融合蛋白的表达主要在上清中，因此将诱导表达后的菌体经超声破碎以及高速离心后取上清，于含有Glutathione SepharoseTM 4B填料的重力柱中进行亲和纯化，由于融合蛋白所含有的GST标签能够特异性与上述填料结合，因此经过洗涤、洗脱等步骤即得到纯度达95%以上的目的蛋白 (图 3)，可作为免疫动物所用抗原。
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| 图 3 SDS-PAGE检测亲和纯化后GST-IFT46重组蛋白 Figure 3 SDS-PAGE analysis of the purified GST-IFT46 recombinant protein by affinity adsorption purification. 1: the flow-through fraction contains most of the non-target proteins from BL21; 2-4: the fraction of the first,second and third time washed by washing buffer,respectively; 5-9: the fraction of the first,second,third,fourth and fifth time eluted by elution buffer,respectively; M: protein marker. |
| 图选项 |
2.4 抗血清效价的检测用纯化得到的GST-IFT46融合蛋白免疫新西兰大白兔，经耳缘静脉少量采血，室温静置2 h或4 ℃过夜后获得析出血清，以间接ELISA法测定抗血清的效价，利用酶标仪测定OD450处的吸光值后计算出抗血清的效价，结果如图 4所示，以实验组血清OD450与阴性对照血清OD450的比值大于2即为阳性，其最高稀释度即为抗血清的效价，由图 4可知1号兔抗血清的效价大于128 000，2号兔抗血清效价大于256 000，满足实验要求。
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| 图 4 间接ELISA法测定抗血清的效价 Figure 4 ELISA test of anti-IFT46 polyclonal antiserum. |
| 图选项 |
2.5 抗血清灵敏度和特异性检测所得的抗血清由于含有多种抗体分子因此需要进行纯化，本研究首先进行Protein A纯化，结果如图 5所示。然后利用免疫亲和纯化通过MBP-IFT46融合蛋白作为抗原，将其偶联到对应的基质上使其特异性吸附抗体，再经过洗涤、洗脱等步骤即可得到纯度较高的抗体。但是仍可存在少量杂带，因此又采用MBP-IFT46固定到硝酸纤维素膜亲和法进一步纯化。AP显色结果 (图 6A) 和ECL曝光法 (图 6B) 均显示，抗血清能够正确的与46 kDa大小的IFT46蛋白特异结合，证明所制备的多克隆抗体具有很好的特异性，可与免疫原专一性结合。
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| 图 5 IFT46的抗体经Protein A纯化 Figure 5 The anti-IFT46 was purified by Protein A. The first peak represents other antibodies besides IgG; the second peak represents IgG antibodies. |
| 图选项 |
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| 图 6 Western blotting验证抗体特异性-AP显色法 (A) 和ECL曝光法 (B Figure 6 The antibody specificity was detected by Western blotting through AP method (A) and ECL method (B). (A) AP method. M is protein marker,the wild-type flagella extract was probed with the affinity-purified anti-IFT46 antibody with a single band detected and theift46 mutant flagella extract was probed with the affinity-purified anti-IFT46 antibody with no band detected. (B) ECL method. The wild-type flagella extract was probed with the affinity-purified anti-IFT46 antibody with a single band detected and in contrast the wild-type flagella extract was probed with pre-immune serum with no specific band. |
| 图选项 |
2.6 免疫荧光法检测IFT46的定位及抗体的活性免疫荧光技术即以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术，基于抗原抗体反应的高度特异性，将不影响抗体活性的荧光色素标记在抗体上，与其相应的抗原结合后在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应，本实验采用的是间接法即将荧光色素标记在第二抗体上，来研究IFT46在莱茵衣藻中的定位，结果如图 7所示，由图可以看到IFT46的抗体能够与莱茵衣藻IFT46蛋白特异性结合，且结合处主要位于纤毛的基体，表明IFT46蛋白主要定位在纤毛基体，少部分沿纤毛呈点状分布，与IFT复合物B组分的定位结果相一致。由于IFT是一种双向运输机制，包括纤毛基部到顶端的正向运输和顶端到基部的逆向运输，而IFT复合物B主要在正向运输中发挥作用，且其定位在基体，因此它的缺失或突变会引起复合物B的不稳定，进而影响纤毛的组装使纤毛形成缺陷，从而使纤毛的运动存在缺陷。
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| 图 7 免疫荧光检测IFT46蛋白在莱茵衣藻纤毛中的定位 Figure 7 Immunofluorescence analysis the flagella localization of IFT46. It showed that IFT46 is concentrated at basal body regions and is localized along the entire length of the flagellum as punctuated dots. The insets show enlargements of the basal body region and the flagella. |
| 图选项 |
3 结论与讨论纤毛是真核细胞表面的重要结构，尽管近年来人们对纤毛的研究逐渐加深，无论从其结构的研究到其组装与解聚，从其功能到其各组分间的相互作用研究都取得了一定进展，但纤毛在多种生命活动中都发挥重要功能，其复杂而保守的调控机制还未完全清楚，尤其是纤毛相关基因的变异会造成其结构缺陷，进而导致纤毛相关疾病的发生[26-27]，因此纤毛研究的必要性和紧迫性已成为科学界的共识，纤毛的研究将对人类认知生命的过程和健康事业的发展做出巨大贡献。
本文研究的ift46基因的变异也会导致纤毛的形成缺陷[19]，为了在蛋白水平和细胞水平研究其作用机制，我们制备了高特异性和高灵敏度的IFT46抗体。首先在大肠杆菌中经IPTG诱导大量表达IFT46，然后用多步纯化获得高纯度 (95%以上) 的GST-IFT46融合蛋白，并作为抗原免疫新西兰大白兔获得抗血清。由于本研究使用的是ift46基因的全序列，包含所有抗原表位，因此所制备的抗体用途广泛。且经过亲和纯化后抗体的特异性和灵敏度极高，尤其是通过ECL曝光的方法更加肯定了所制备多克隆抗体的特异性和灵敏度。不仅如此，本实验所制备的IFT46抗体可以很好地用于免疫荧光实验，实验结果显示IFT46抗体能够专一性地与莱茵衣藻IFT46蛋白结合，且发现IFT46蛋白绝大部分定位在纤毛基体，极少部分沿纤毛呈点状分布，与相关研究结果一致[18]。该部分结果表明IFT46是IFT复合物B的一个组分，它的缺失或突变会引起复合物B的不稳定，进而影响纤毛的组装使纤毛形成缺陷，导致莱茵衣藻运动存在缺陷。该抗体对进一步研究IFT46蛋白在纤毛的组装和解聚机制、与其他IFT蛋白的相互作用以及纤毛病的发病机理都具有重要的意义。
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