刘薇1, 李啸宇1, 何环1
, 陈子豪1, 陈凡1, 王江泽2, 刘健2, 陈林勇2, 黄再兴1 1. 中国矿业大学化工学院, 煤炭加工与清洁利用教育部重点实验室, 江苏 徐州 221116;
2. 煤与煤层气共采国家重点实验室, 山西 晋城 048000
收稿日期：2021-04-26；修回日期：2021-05-18；网络出版日期：2021-05-19
基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金（2017XKQY037）；山西省晋煤集团煤与煤层气共采国家重点实验室开放基金（2018KF12）
作者简介：何环，博士，中国矿业大学生物工程系副教授，硕士生导师。2009年毕业于中南大学获微生物学博士学位。研究方向：煤炭清洁利用、矿区生态修复，在煤炭生物液化和气化、煤矿瓦斯的微生物降解、煤炭生物脱硫、煤矿区重金属污染治理方面取得系列研究成果。先后主持了国家自然科学基金，江苏省自然科学基金等研究课题，已在Fuel、Fuel Processing Technology、Energy & Fuel、Bioresource等期刊上发表论文40余篇.
*通信作者：何环, Tel: +86-516-83591059;E-mail: hehuan6819@cumt.edu.cn.
摘要：[目的] 以云南昭通褐煤为研究对象，从矿井水富集产物中分离得到SRB菌株Desulfotomaculum reducens ZTS1厌氧降解褐煤，分析研究SRB菌株处理褐煤前后的物化性质变化。[方法] 采用工业和元素分析、XRD、FT-IR、SEM和低温液氮吸附法比较研究SRB厌氧降解褐煤前后矿物组成、有机官能团、表面形貌和孔隙结构变化。[结果] D.reducens ZTS1厌氧降解褐煤后灰分和挥发分略有降低，碳、氮和硫元素的含量降低，氧的含量增加，煤中硫代硫酸钠消失，FT-IR结果表明褐煤长链烃上的甲基和亚甲基团增多，游离羟基减少。煤表面粗糙度增加，小孔径的孔隙增多，孔径比表面积增大。[结论] D.reducens ZTS1可以厌氧降解昭通褐煤，厌氧降解后煤的物化性质发生变化。
关键词：生物煤层气硫酸盐还原菌褐煤厌氧降解孔隙
Anaerobic degradation of Zhaotong lignite by sulfate reducing bacterium Desulfotomaculum reducens ZTS1
Liu Wei1, Li Xiaoyu1, He Huan1
, Chen Zihao1, Chen Fan1, Wang Jiangze2, Liu Jian2, Chen Linyong2, Huang Zaixing1 1. Key Laboratory of Coal Processing and Clean Utilization of Ministry of Education, School of Chemical Engineering, China University of Mining and Technology, Xuzhou 221116, Jiangsu Province, China;
2. State Key Laboratory of Coal and Coal-bed Methane Stimultaneous Extraction, Jincheng 048000, Shanxi Province, China
Received: 26 April 2021; Revised: 18 May 2021; Published online: 19 May 2021
*Corresponding author: Huan He, Tel: +86-516-83591059;E-mail: hehuan6819@cumt.edu.cn.
Foundation item: Supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities (2017XKQY037); and by the State Key Laboratory of Coal and Coalbed Methane Co-extraction of Shanxi Jinmei Group (2018KF12)
Abstract: [Objective] A SRB strain Desulfotomaculum reducens ZTS1 isolated from enrichment from coal mine water was used to anaerobically degrade Yunnan Zhaotong lignite, and the physicochemical properties of which before and after degradation with SRB strain were analyzed. [Methods] Mineral components, organic functional groups, surface morphology, pore structure changes of lignite minerals before and after anaerobic degradation with SRB were studied by proximate and ultimate analysis, X-ray diffraction, Fourier transform infared spectromotry, Scanning electron microscopy and low temperature liquid nitrogen adsorption method. [Results] After anaerobic degradation by D. reducens ZTS1, the ash and volatiles of lignite decreased slightly, the contents of carbon, nitrogen and sulfur decreased, while the content of oxygen increased. The sodium thiosulfate disappeared in the residual coal. FT-IR results showed that the methyl and methylene groups on the long chain hydrocarbon of lignite increased, while the free hydroxyl group decreased. With the increase of coal surface roughness, the pore size of small pore and the specific surface area of pore size Increases. [Conclusion] D. reducens ZTS1 can anaerobically degrade Zhaotong lignite, and change the physicochemical properties of the coal.
Keywords: biogenic coal bed methanesulfate reducing bacterialigniteanaerobic degradationpores
产甲烷菌等微生物在厌氧条件下降解煤中有机质形成甲烷的过程称为煤的生物成气，该过程常出现在未成熟的煤层中[1-2]。褐煤含有较多有机质，而且只经历过弱煤化作用，煤结构中官能团/侧链与小分子物质较多，这使得它较易被微生物利用转化成生物气。因此，有关褐煤的生物产气成为当前煤生物产气领域的研究热点[3-4]。我国已探明的褐煤储量约为1311.42亿t，约占煤炭保有储量的13%，主要分布在华北和西南，其中西南地区的云南省储量亿吨以上的褐煤田有12个，总储量约占褐煤总量1/8，且前期有研究人员报道云南昭通褐煤具有较好的生物产气潜力[5-6]。随着碳达峰和碳中和的临近，煤炭资源的清洁高效利用势在必行，因此褐煤资源的利用也越来越受到研究人员的重视，对该地区的褐煤展开生物产气研究也可为其清洁利用提供一条备选途径。
SRB是一类以有机/无机化合物为电子供体，还原硫酸盐产生硫化物的微生物功能群总称，已有研究表明SRB在土壤、沉积物、油藏、废水处理等环境有机质的厌氧降解过程中扮演重要角色[7-8]，且在生物煤层气环境中也有分布。Beckmann等[9]发现Desulfovibrio spp.和Desulfobacteraceae是原位增采煤层气井中两种主要的SRB细菌，而Archaeoglobus sp.是主要的SRB古菌。Li等[10]发现沁水盆地柿庄南煤矿煤层气井排采水中SRB主要为Desulfarculales、Desulfovibrionales和Desulfuromonadales，并且在不同高度的水头样品中SRB与产甲烷菌种群呈相反的分布规律。He等[11]在褐煤生物模拟产气体系中也发现Desulfovibrio和Desulfotomaculum丰度较高，且在褐煤表面和溶液中产气不同阶段，SRB分布存在差异。
煤的生物产气过程中有机质的厌氧降解是甲烷形成的重要环节[4]，研究表明SRB在煤中有机质的厌氧降解中扮演重要角色。Beckmann等[9]发现在高硫酸盐和低养分的地层水中，土著微生物群落可能与碳氢化合物氧化和硫酸盐还原有关，且SRB等微生物被认为是BTEX(苯、甲苯、乙苯、二甲苯)和多环芳烃(PAH)降解的关键微生物。葛晓光等[12]从煤层水中分离出SRB菌Desulfovibrio sp.可利用苯甲酸酯、甲酸酯、醋酸、2, 6-二叔丁基对甲酚和2-己基-1-癸醇等。An和Picardal等[13]从美国印第安纳州的煤层水中分离出了一种SRB菌Desulfocarbo indianensis，该菌株能以氢为电子供体自养生长或以苯甲酸、甲酸、乙酸、丙酮酸、丁酸、富马酸、琥珀酸和棕榈酸酯异养生长。煤经微生物厌氧降解产气后其物化性质会发生变化。郭红玉等[14]研究表明生物产气后煤表面和煤内部的结构包括其裂隙、孔隙等均发生变化。张攀攀等[15]研究厌氧代谢产物对煤纳米孔隙发育的影响，发现经过厌氧降解后煤孔隙表面粗糙程度、孔隙结构复杂程度均出现增加，但是其孔隙发育却降低。Zhang等[16]报道煤经生物转化后，煤炭孔表面积和孔体积随着平均孔径的增大而减小，而微孔表面积随着孔体积的减小而增大。Pandey等[17]研究表明煤层注入微生物产气后，其渗透性和储层对气体的吸附特性都发生改变。
综上所述，SRB在煤炭的生物产气体系中普遍存在，且在煤的厌氧降解中发挥重要作用。煤经生物产气后其物化性质会发生变化，但有关SRB厌氧降解褐煤前后煤的物化性质变化的研究较少。因此，本研究以云南昭通褐煤为研究底物，利用实验室分离鉴定的SRB菌株厌氧降解褐煤，采用X射线衍射(X-ray diffraction，XRD)、傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectrometry，FT-IR)和扫描式电子显微镜(scanning electron microscopy，SEM)等方法分析SRB菌株处理煤前后的物化性质变化，通过这些研究为阐明SRB在褐煤的生物产气机理提供实验依据，也为后期该地区褐煤的生物产气积累经验。
1 材料和方法 1.1 SRB菌种和煤样 采用的SRB菌株Desulfotomaculum reducens ZTS1为实验前期分离保存。SRB菌株培养基如下：KH2PO4 (0.5 g/L)，NH4Cl (1 g/L)，乳酸钠(60%，5 mL)，CaCl2 (0.076 g/L)，Na2SO4 (0.5 g/L)，MgSO4·7H2O (2 g/L)，半胱氨酸盐酸盐(0.5 g/L)，刃天青(0.1%，1 mL)。菌株活化后，按10%接种量接种到灭菌培养基中，在35 ℃下恒温培养7 d至对数生长期后，10000 r/min高速离心10 min，收集细胞样品，将无菌水重悬细胞后用振荡器混匀成SRB菌液备用，保证悬浮液中细胞初始浓度为107个/mL。研究所用的褐煤采自云南昭通，新鲜褐煤样品70 ℃烘干后破碎，用标准筛分别筛选出粒度为小于0.045 mm、0.045–0.074 mm和0.25–0.5 mm褐煤样品备用。
1.2 SRB菌株对褐煤的厌氧降解实验 为了避免培养基中有机碳源干扰SRB菌利用煤中有机质，将150 mL去除乳酸钠的新鲜培养基装入250 mL厌氧培养瓶内，每瓶加入粒度0.25–0.5 mm的煤样15 g后高压蒸汽灭菌，静置到室温。通高纯氮(99.999%)进行除氧后，于厌氧手套箱中接种15 mL制备好的SRB菌悬液，放入35 ℃的恒温摇床中培养15 d，每瓶设置3组平行。厌氧降解试验完成后，真空过滤培养液(定量滤纸，孔径80–120 μm)，从滤纸上取出褐煤，去离子水冲洗5遍后70 ℃烘干备用。
1.3 SRB厌氧降解褐煤前后物化性质分析 (1)煤样的工业分析、元素分析和XRD物相组成分析
煤样制备后，送往徐州地质矿产设计研究院对褐煤原煤和残煤样品进行工业和元素分析，同时采用XRD (德国Bruker，D8 ADVANCE)分析SRB降解前后褐煤矿物的物相组成变化，并使用MDIJade5.0对衍射谱结果进行解谱分析。
(2) FT-IR分析样品有机官能团组成
取制备好的原煤和处理后残煤按照1:100的比例与KBr充分混合，磨细、混匀、装模，将样品粉末置于压片机上压制成0.1–1.0 mm厚的透明薄片并置于准备好的样品架上，采用FT-IR光谱仪(德国Bruker，VERTEX 80V)分析煤样中有机官能团变化[18]。对3750–3000 cm–1、3000–2800 cm–1和1800–1000 cm–1三个波段采用PeakFit软件进行分峰拟合和分析。
(3) SEM观察矿物表面形貌
褐煤原煤样品用无菌水冲洗烘干后直接用离子溅射仪(中国，ETD-2000C)喷金，采用SEM(德国，ZEISS EVOMA15)观察其表面形貌，SRB厌氧降解后的残煤先使用2.5% (V/W)戊二醛在pH 7.2的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液固定2.5 h，然后对样品进行乙醇逐级脱水，并在空气干燥24至48 h后，喷金观察煤厌氧降解后的形貌特征。
(4) 低温液氮吸附法分析煤的孔隙结构
取粒度为0.25–0.5 mm的褐煤原煤和处理后残煤样品各2 g，置于105 ℃恒温烘箱中干燥2 h。具体操作过程参照国标(GB/T 21650.2-2008)，液氮吸附实验前选用真空加热抽气方法除净样品中吸附的杂质分子，用液氮(77 K)作为吸附介质，在0.01–0.995的相对压力下采用低温液氮吸附仪(美国Micromerities，TriStarII3020)进行吸附实验，分析煤的孔隙结构。
2 结果和讨论 2.1 褐煤的工业分析、元素分析和物相组成变化 原煤和残煤的工业分析和元素分析结果如表 1所示，经SRB厌氧降解后煤中灰分和挥发分略有下降，碳、氢、氮和硫元素含量均下降，其中硫含量下降0.74% (脱除率达到46.8%)，而氧元素含量稍微上升。我国煤矿硫化氢主要成因类型有微生物硫酸盐还原作用(bacterial sulfate reduction，BSR)、热化学硫酸盐还原(thermal sulfate reduction，TSR)、含硫化合物的热裂解(thermal decomposition of sulfide，TDS)和岩浆活动(火山喷发)[19]，BSR是SRB在无氧条件下还原硫酸盐、氧化有机质获取能量并生成硫化氢的过程。SRB厌氧降解实验中，培养基中去除了外部碳源，微生物只能利用煤中有机质进行生长代谢，因此残煤中挥发分及碳、氢和氮元素的下降与煤中有机质的利用相关，而硫元素的下降可能与硫被微生物利用产生硫化氢释放出来有关。
表 1. 原煤和残煤的工业分析和元素分析 Table 1. Proximate and ultimate analysis of raw coal and residual coal
| Coal | Proximate analysis (ad*/%) | Ultimate analysis (daf*/%) | ||||||||
| Moisture | Ash | Volatiles | Fixed carbon | C | O | H | N | S | ||
| Raw | 3.92 | 28.27 | 52.93 | 33.76 | 67.15 | 24.29 | 5.27 | 1.09 | 1.58 | |
| Residual | 3.87 | 27.23 | 51.86 | 33.43 | 63.13 | 25.21 | 5.02 | 0.92 | 0.84 | |
| * ad is short for air dried basis, and daf is short for dry ash free basis. | ||||||||||
表选项
原煤和残煤的XRD分析结果如图 1所示，原煤中的主要矿物为石英和磷铝矿，另有少量的硫代硫酸钠和地开石，经SRB厌氧降解后，原煤硫代硫酸钠对应的衍射峰消失。根据SRB的代谢特点，推测煤中硫代硫酸钠可能被SRB消耗。郭红玉等[14]对不同煤样进行生物甲烷模拟实验可知，微生物可以使煤的大分子结构排列发生改变，即SRB可以利用煤中有机质作为碳源合成生物甲烷，加剧煤的大分子结构无定向排列程度，从而改变褐煤的表面，增加褐煤表面的粗糙度甚至产生孔隙。
 |
| 图 1 原煤(A)和残煤(B)的XRD分析 Figure 1 X-ray diffraction of raw (A) and residual (B) coal. |
| 图选项 |
2.2 SRB厌氧处理褐煤前后的FT-IR分析 褐煤厌氧降解前后FT-IR光谱图的变化如图 2所示，FT-IR对应的3个吸收谱带3750–3000 cm–1、3000–2800 cm–1和1800–1000 cm–1分别是羟基、脂肪结构和含氧官能团[20]。经过比较可以发现两组谱图在出峰位置和强度上有一定变化，对3750– 3000 cm–1、3000–2800 cm–1和1800–1000 cm–1这3个波段进行了Peakfit分峰拟合和分析，结果如图 3所示。
 |
| 图 2 原煤和残煤的FT-IR谱图 Figure 2 FT-IR spectra of raw coal and residual coal. |
| 图选项 |
 |
| 图 3 原煤(A)和残煤(B)的谱峰拟合结果 Figure 3 Spectral peak fitting results of raw coal (A) and residual coal (B). |
| 图选项 |
观察SRB处理前后褐煤在1800–1000 cm–1波段分峰拟合图 3-A1和3-B1，可知1377 cm–1、1458 cm–1和1300–1000 cm–1附近的分峰曲线波段存在差别。比较SRB处理前后褐煤在3000–2800 cm–1波段分峰拟合谱图 3-A2和3-B2，得知SRB处理后的褐煤于2850 cm–1和2950 cm–1波长附近的吸收峰明显大于原煤。根据SRB处理前后的褐煤在3800– 3000 cm–1波段的分峰拟合结果图 3-A3和3-B3，发现残煤在这一波段内形成的吸收峰均增强，而3600 cm–1附近的吸收峰有所减弱。由吸收峰的变化可知，经SRB作用后褐煤的官能团发生了变化，主要体现为长链烃上的甲基和亚甲基团等部分官能团增多(3000–2800 cm–1)、游离羟基减少而其他形态羟基增多(3800–3000 cm–1)。另外，-C-O-键的吸收峰峰强变化较小，但是对应官能团结构如酚、醚、羧、醇和酯均有变化，因此推断经SRB厌氧降解后，煤中以-C-O-存在的官能团发生转换(1800–1000 cm–1)。进一步比较降解前后褐煤的红外光谱图，推测褐煤内闭环结构等化学键出现断裂，进而开环形成长链烃，致使长链烃上的甲基和亚甲基增多和特定位置C原子的手性结构的改变[21]。其中，-C=O-键和-C-O-键的改变是由某些特定位置的连接键断裂造成，进而改变FT-IR中各波段的分峰。Sun等[22]发现酸可以造成褐煤内的多环结构断裂成单环结构，或者一些闭环结构转变成甲基或亚甲基。因此，推测SRB对褐煤的厌氧降解同样会使局部环境酸化，因此会破坏煤的环状结构。
2.3 褐煤表面形貌和孔隙结构的改变 图 4为褐煤经SRB降解后表面的SEM照片，其中原煤(图 4-A)相对平整光滑，经SRB处理7 d (图 4-B)和15 d (图 4-C)，褐煤表面粗糙程度增加，且出现了微孔隙和裂隙。其不仅有利于微生物在褐煤表面吸附，且益于褐煤的生物成气[23]，由此推测褐煤的结构变化与微生物对褐煤的厌氧降解有关[24]。
 |
| 图 4 SRB处理前后褐煤的SEM照片 Figure 4 SEM of the coal sample treated before and after with SRB. A: raw coal; B: SRB treatment for 7 days; C: SRB treatment for 15 days; D: SEM of the ZTS1 under 20000 times. |
| 图选项 |
2.4 褐煤孔隙结构变化 煤层气主要吸附在煤的孔隙中，煤孔隙结构的划分多种多样。本研究对煤孔隙类型的划分参考国际纯粹和应用化学联合会(IUAPC)对孔隙的分类，微孔直径小于2 nm，介孔直径2–50 nm，宏孔直径大于50 nm[25]。
观察表 2中SRB厌氧降解前后煤的孔隙结构变化，发现褐煤孔比表面积和比孔容经SRB作用后明显变大，且吸附及解吸过程中的褐煤比孔容增至2倍左右。经SRB处理后，褐煤在解吸过程中的比表面积从0.4530 m2/g增至1.1790 m2/g，平均孔径由12.884 nm减至8.511 nm，推断SRB作用后褐煤的孔隙变多，孔隙结构更复杂，且新增孔隙以小孔径为主。
表 2. 原煤和残煤的比孔容和孔比表面积 Table 2. Specific pore volume and specific pore surface area of raw and residual coal
| Element | Name | Raw coal | Residual coal |
| Pore surface area | Adsorption specific surface area (m2/g) | 0.295 m2/g | 0.694 m2/g |
| Desorption specific surface area (m2/g) | 0.453 m2/g | 1.179 m2/g | |
| Specific pore volume | Adsorption pore volume (cm3/g) | 0.002 cm3/g | 0.004 cm3/g |
| Desorption pore volume (cm3/g) | 0.002 cm3/g | 0.005 cm3/g | |
| Bore diameter | Adsorption average pore size (nm) | 18.995 nm | 13.725 nm |
| Average desorption aperture (nm) | 12.884 nm | 8.511 nm |
表选项
按照IUPAC的分类，图 5中原煤的N2吸附-脱附等温线a1与SRB处理褐煤后的的N2吸附-脱附等温线b1均形成H1型滞后环，可得知此煤样由近似均匀球体的团块组成，且具有以圆筒孔为主的孔径分布[26]。由原煤氮气脱附-吸附等温线a1的滞后环比处理后的b1小得多，可知SRB作用褐煤后孔隙结构变得更加复杂，且结构复杂更利于吸附时发生毛细孔凝聚。结合比孔容和孔比表面积结果，SRB作用后的煤样平均孔径减小，而比表面积和孔隙容积增大，证实SRB具有增加褐煤中的微孔孔隙的作用。
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| 图 5 N2吸附-脱附等温线 Figure 5 N2 adsorption – desorption isotherms. A: raw coal; B: residual coal. |
| 图选项 |
图 6-A2与图 6-B2中，经SRB处理后褐煤的孔容积比图 6-A1和图 6-B1中原煤的孔容积大若干倍，表明褐煤的孔隙度受SRB的作用影响，并可致使孔隙率增大，煤孔隙易于形成更复杂的结构。其中，0–2 nm粒径下脱附曲线中的最大粒径则从1.6×10–4 cm3/(g·nm)增至9×10–4 cm3/(g·nm)，吸附曲线中的平均孔径由5×10–6 cm3/(g·nm)增至5×10–5 cm3/(g·nm)，即孔体积增加10倍左右，证明褐煤的微孔数量在SRB作用后大大提高。此外，根据IUAPC对孔隙的分类，直径小于2 nm微孔的变化大于介孔，微孔孔隙的影响显著大于宏孔，说明SRB对褐煤的孔隙变化影响以微孔孔隙为主。
 |
| 图 6 原煤(A)和残煤(B)孔容孔径分析图 Figure 6 Pore volume and aperture analysis diagram of raw coal (A) and residual coal (B). |
| 图选项 |
结合图 4-d中ZTS1的SEM结果与图 6中原煤的孔容孔径，ZTS1直径为0.3–0.4 μm，而原煤中2 nm以内孔隙结构增加最多，可以推断出SRB不是直接通过菌体作用于褐煤，而是利用菌体的分泌物或者鞭毛上的特殊结构作用于褐煤的特殊位点形成新的孔隙结构或者使原孔隙结构扩大[27]。由图 6-a1与图 6-a2均存在最大值可知，褐煤的孔隙结构不能被SRB无限改变。因褐煤孔隙变化以微孔为主，介孔及宏孔孔隙变化不大，可进一步推断在褐煤原结构的基础框架内，SRB会对褐煤进行作用，而超过某一范围，其将不会对褐煤内部结构进行作用。因此，褐煤中新增孔隙以小孔径孔隙为主，孔径越大的孔隙结构反而变化越小[21]。
3 结论 本文采用云南昭通褐煤作为对象，利用前期分离得到SRB-ZTS1厌氧降解褐煤，观察褐煤厌氧降解前后的物化性质的变化，得到结论如下。
(1)褐煤经SRB厌氧降解后煤中灰分和挥发分略有下降，碳、氢、氮和硫元素含量均下降，尤其是硫的脱除率达到46.8%，而氧元素含量稍微上升，煤中硫代硫酸钠在SRB降解后基本消失。FT-IR结果显示长链烃上的甲基和亚甲基团增多，游离的羟基明显减少，包含-C-O-键的羧、酚、醚、醇和酯等有机物的存在形态在SRB的作用下发生互换。
(2)褐煤经处理前后扫描电镜结果可知，褐煤表面粗糙度增加，孔隙增多，孔径比表面积增大，且以小孔径孔隙为主，证明了SRB主要是通过小孔径孔隙对褐煤造成影响。
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