有氧条件下污染禾谷镰刀菌的玉米品质变化规律和呕吐毒素的积累动态变化规律
闫珊珊, 刘光芒, 王建萍, 林燕, 白世平, 张克英, 吴彩梅
四川农业大学动物营养研究所, 四川省、农业部动物抗病营养与饲料重点实验室, 四川 成都 611130
收稿日期：2019-11-01；修回日期：2020-01-10；网络出版日期：2020-01-17
基金项目：校企合作项目(2017009H900)
_*通信作者：吴彩梅, E-mail:zhuomuniao278@163.com.

摘要：[目的] 试验旨在考察有氧条件下接种禾谷镰刀菌后玉米品质变化规律和呕吐毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇Deoxynivalenol，DON；15乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇15-acetyldeoxynivalenol，15AC-DON)的积累动态变化规律。[方法] 单因素试验设计，禾谷镰刀菌接种量分别为1×1⁰⁵、1×10⁶、1×10⁷个/g，玉米水分22%，三角瓶中培养，通氧量为1020 m²/m³，温度25±2℃，湿度75%±5%，时间60 d，测定不同时间点玉米培养物中的品质指标和二毒素含量。[结果] 结果表明，禾谷镰刀菌接种量对为禾谷镰刀菌提供N源的粗蛋白质含量无影响(P>0.05)，随着培养时间的延长，提供N源的氨基酸含量呈二次曲线变化(P < 0.01)，提供C源的粗脂肪、淀粉、粗纤维呈线性降低(P < 0.01)。酸价呈线性增加(P < 0.01)，蛋白质溶解度、能量呈线性降低(P < 0.01)，霉菌总数和毒素DON、15AC-DON呈二次曲线变化(P < 0.01)。禾谷镰刀菌产DON的动态规律为，0-15 d毒素产量范围为0.17-0.23 mg/kg，16-20 d毒素产量范围为0.14-0.41 mg/kg，21-60 d毒素产量范围为0.06-0.15 mg/kg；禾谷镰刀菌产15AC-DON的动态规律为，0-5 d毒素产量范围为1.11-5.28 mg/kg，6-15 d毒素产量范围为5.55-10.05 mg/kg，16-60 d毒素产量范围为4.68-12.06 mg/kg。[结论] 玉米品质随禾谷镰刀菌接种量增加和培养时间延长逐渐降低，DON和15AC-DON产量与禾谷镰刀菌接种量呈剂量依赖关系，60 d内二毒素积累存在前期、中期和后期的动态变化规律。
关键词：玉米禾谷镰刀菌品质DON15AC-DON
Quality variation and deoxynivalenol accumulation in corn inoculated with Fusarium graminearum under aerobic conditions
Shanshan Yan, Guangmang Liu, Jianping Wang, Yan Lin, Shiping Bai, Keying Zhang, Caimei Wu
Institute of Animal Nutrition, Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition and Feedstuffs of China Ministry of Agriculture and Rural Affairs and Sichuan Province. Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, Sichun Province, China
Received: 1 November 2019; Revised: 10 January 2020; Published online: 17 January 2020
_*Corresponding author: Caimei Wu, E-mail:zhuomuniao278@163.com.
Foundation item: Supported by the School-enterprise Cooperation Project (2017009H900)

Abstract: [Objective] The objective of this trial is to investigate the quality variation and the accumulation of deoxynivalenol and 15-acetyldeoxynivalenol in corn with different Fusarium graminearum inoculation under aerobic conditions. [Methods] Single factor experiment design was used, the inoculation amount of Fusarium graminearum was 1×10⁵, 1×10⁶, 1×10⁷ conidia/g, the corn moisture was 22%, cultured in a Erlenmeyer flask, and the oxygen flux was 1020 m²/m³. The temperature was 25±2℃, the humidity was 75%±5%, and the culture time was 60 d. The quality index and two toxins content in corn culture on different culture time were measured. [Results] The amino acid content had a quadratic curve variation (P < 0.01), the content of crude fat, starch and crude fiber decreased linearly (P < 0.01), the acid value increased linearly (P < 0.01), the protein solubility and energy decreased linearly (P < 0.01), the mold counting and content of deoxynivalenol, 15-acetyldeoxynivalenol showed a quadratic curve variation (P < 0.01). The accumulation dynamic of deoxynivalenol was that the toxin production ranged from 0.17 to 0.23 mg/kg between 0-15 d, from 0.14 to 0.41 mg/kg between 16-20 d, from 0.06 to 0.15 mg/kg between 21-60 d. The accumulation dynamic of 15-acetyldeoxynivalenol was that the toxin production ranged from 1.11 to 5.28 mg/kg between 0 to 5 d, from 5.55 to 10.05 mg/kg between 6-15 d, from 4.68 to 12.06 mg/kg between 16-60 d. [Conclusion] The corn quality decreased gradually with the increase of Fusarium graminearum inoculation amount and culture time. There was a dose-dependent relationship between content of deoxynivalenol, 15-acetyldeoxynivalenol and Fusarium graminearum inoculation amount. The accumulation dynamic of two toxins was found within 60 days.
Keywords: cornFusarium graminearumqualitydeoxynivalenol15-acetyldeoxynivalenol
玉米是畜禽的主要能量饲料，每年消费量约11000万t。呕吐毒素(Deoxynivalenol，DON；15乙酰基脱氧雪腐镰孢菌烯醇15-acetyldeoxynivalenol，15AC-DON)是禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)的次生代谢产物，可引起动物急性或慢性中毒^[1]。众多调研表明玉米中呕吐毒素污染严重，污染了毒素的玉米，品质不同程度下降，每年约有25%的玉米不能用于畜禽生产。而在中国产呕吐毒素的霉菌主要为禾谷镰刀菌，该菌为嗜冷菌，尤其我国北方在玉米收割和储存时，温度低，水分含量高，且收割和存储时存在有氧条件。因此，在玉米霉菌毒素污染严重的前提下，开展本研究为有氧条件下高水分含量玉米中呕吐毒素污染的防控及霉变玉米的利用提供理论依据。国内外****^[2-4]调研了中国以及世界不同区域玉米中DON含量，发现玉米中DON污染严重，检出率为79%-100%，超标率为47.7%-90.91%。产呕吐毒素的霉菌主要有禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)等，在中国主要为禾谷镰刀菌^[5]。禾谷镰刀菌作为需氧菌在低温高湿条件下适宜产毒^[6]。禾谷镰刀菌产DON的量主要受培养基种类、培养时间、水分、温湿度以及通氧量等因素影响。有研究表明禾谷镰刀菌在水分50%的玉米培养基，培养42 d，产毒量最大，最大值为5868.2 μg/kg。也有研究发现禾谷镰刀菌在水分30%的玉米培养基，培养25 d，产毒量最大，最大值为56.65 mg/kg^[7-8]。Ramirez等^[9]研究温度和水分活度对禾谷镰刀菌产DON的影响，发现温度在25 ℃、水分活度在0.98 aw时DON产毒量最高。张晓莉等^[5]将禾谷镰刀菌接种至基础培养基，温度分别为4、10、15、20、25、30和35 ℃，培养3 d，结果发现，禾谷镰刀菌产DON的量在温度为25 ℃时最高。综上所述，目前对使用量巨大的饲料原料玉米受禾谷镰刀菌污染后呕吐毒素的积累动态规律研究缺乏，而品质变化规律研究未见报道。GB 1353-2018^[10]规定玉米储藏期间水分含量≤14%，刚收割和存储时间较长的玉米水分含量较高(22%-30%)^[11]。GB 13078-2017^[12]规定饲料中霉菌总数限量标准为4×10⁴个/克，因此，在已明确产呕吐毒素的霉菌主要为禾谷镰刀菌，该菌最佳产毒温度为25 ℃，而玉米收割和存储时温度低，水分含量高、存在有氧条件的前提下，本研究围绕霉菌总数标准主要考察禾谷镰刀菌接种量对玉米品质和DON、15AC-DON变化的影响，明确低温、高水分含量玉米品质变化和DON、15AC-DON的积累动态。
1 材料和方法 1.1 试验材料
1.1.1 材料: DON产毒菌株：禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum) 14-62-1，由四川农业大学植物病理学教研室提供；玉米：产区为内蒙古西部。

1.1.2 试剂: DON标准对照品(上海源叶公司)、15AC-DON标准对照品(以色列FERMENTEK公司)，甲醇、乙腈(色谱纯，美国Sigma公司)。乙醚、氢氧化钾、盐酸、氢氧化钠、高氯酸、无水乙醇硼酸等均为分析纯(成都科龙公司)。

1.1.3 仪器: 液相色谱-串联质谱仪(Agilent 1200- 6430 Triple Quad，美国Agilent公司)，高效液相色谱仪(HPLC-e2695，美国Waters公司)，超高效液相色谱仪(UPLC H-Class，美国Waters公司)，半自动凯氏定氮仪(KjelFlex K-360型，瑞士BUCHI公司)，氨基酸自动分析仪(日立L8900型，日本日立公司)，全自动纤维测定仪(A2000220，美国Ankom公司)，紫外分光光度计(UV-300型，美国Thermo公司)，恒温恒湿培养箱(3913，美国Thermo公司)。
1.2 试验设计 本试验采用单因素设计，玉米中禾谷镰刀菌接种量设置3个处理，分别为1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷个/g，每个处理3个重复，每个重复20瓶，玉米水分22%，培养温度25±2 ℃，湿度75%±5%，时间60 d，采用三角瓶有氧培养，通氧量为1020 m²/m³，采样时间点为培养后的第0、5、10、15、20、30、60天，每个采样时间点每个重复采集样品后混合成3个平行样进行相关指标的测定和统计分析。
1.3 样品处理 将初始水分含量为11.85%的玉米采用强度10 kGy的⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌，并调制水分含量为22%。水分调制方法参照蔡静平等研究^[13]，根据已测定的玉米样品原始水分含量，计算所需加水量(公式1)。

公式(1)

其中，M：样品的重量(g)，C₀：样品的原始水分(%)，C₁：样品所需要的水分(%)。调制水分后的玉米采用无菌三角瓶分装，模拟玉米的有氧存储条件，每瓶40 g，用孔径0.2-0.22 μm，通氧量1020 m²/m³的透气膜封口。
将确定为产毒菌的禾谷镰刀菌14-62-1接种于PDA平板复壮培养5-7 d后，将菌丝接种于绿豆汤液体培养基(绿豆20 g，蒸馏水中煮沸10 min，纱布过滤，加蒸馏水定容至1 L)中，产生分生孢子后，把分生孢子的浓度调整制成1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸个/mL的孢子悬液，每瓶样品分别接种4 mL (此体积已纳入水分含量计算)，使样品的孢子数分别为1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷个/g，每个接种量样品20瓶，试验总瓶数为60瓶。将样品放置于温度25±2 ℃，湿度75%±5%的控温控湿培养箱中培养，每天定时混匀样品。
1.4 采样及样品测定方法 分别在培养的第0、5、10、15、20、30、60天无菌操作台采样，接种量间消毒后再采集，避免不同接种量间交叉污染，每瓶样品每次采集5 g，每个重复样品粉碎后平行测定3个数值。霉菌总数采样后立即测定，其余样品放置于-80 ℃保存，用于品质指标及DON含量测定。指标测定方法见表 1。
表 1. 玉米接种禾谷镰刀菌后品质指标及测定方法 Table 1. Quality index and determination method of corn inoculated with Fusarium graminearum

Items	Determination method
DON and 15AC-DON	GB/T 30956-2014[14]
Moulds	GB/T 13092-2006[15]
Amino acid	GB/T 18246-2000[16]
CP	GB/T 6432-2018[17]
EE	GB/T 6433-2006[18]
CF	GB/T 6434-2006[19]
Amylum	GB/T 5009.9-2016[20]
Acid value	GB/T 5009.229-2016[21]
Protein solubility	DB13/T 812-2006[22]
Energy	Zhang Liying[23]

表选项






1.5 统计分析 数据采用Excel 2013整理，采用SAS 9.4软件中PROC MIXED程序进行数据分析(公式2)。

公式(2)

其中，Y_ijkl为因变量，μ为变量的总体平均值，α_i为接种量水平(i=1×10⁵，1×10⁶，1×10⁷个/g)，γ_k为培养时间(k=0，5，10，15，20，30，60 d)，(αγ)_ik为影响因素之间的交互作用，t_l为对各样品指标的重复测量，ε_ikl为随机误差。方差分析显著者，用Tukey法进行多重比较，P < 0.05作为显著性水平检验标准。结果用平均值表示。
2 结果和分析 2.1 接种禾谷镰刀菌后玉米品质变化规律
2.1.1 为禾谷镰刀菌提供N源的营养素变化规律: 玉米各处理组培养期间氨基酸含量变化见表 2和表 3。不同禾谷镰刀菌接种量组粗蛋白质和氨基酸含量随着培养时间的延长无显著变化(P > 0.05)。玉米各处理组培养期间粗蛋白质含量平均为16.39%。必需氨基酸中Trp、Thr、His含量分别平均为0.60%、0.35%、0.22%，Lys、Ile、Phe、Met、Arg、Val、Leu含量随着培养时间的延长均呈二次曲线变化(P < 0.01)。非必需氨基酸中Ala、Gly、Ser、Asp含量分别平均为0.52%、0.32%、0.39%、0.55%，Cys、Tyr、Glu、Pro含量随着培养时间的延长均呈二次曲线变化(P < 0.01)。
表 2. 禾谷镰刀菌接种量对玉米中必需氨基酸含量变化的影响 Table 2. Effect of inoculum of Fusarium graminearum on essential amino acid in corn (DM)

Items	Inoculation/ (conidia/g)	t/d								SEM	P-value
		0	5	10	15	20	30	60	Inoculation		Time	Time× inoculation	Time ×time	Time×time ×inoculation
Phe/%	1×105	0.48a	0.39b	0.32cd	0.29d	0.30d	0.27d	0.37bc	0.02	0.080	< 0.001	0.051	< 0.001	0.468
	1×106
	1×107
Leu/%	1×105	1.05a	0.88b	0.87b	0.62c	0.66c	0.53d	0.87b	0.04	0.443	< 0.001	0.819	< 0.001	0.923
	1×106
	1×107
Met/%	1×105	0.31a	0.04c	0.06c	0.17b	0.22b	0.32a	0.06c	0.04	0.911	0.003	0.763	< 0.001	0.997
	1×106
	1×107
Arg/%	1×105	0.61a	0.36b	0.35b	0.30d	0.34bc	0.31cd	0.35b	0.02	0.706	< 0.001	0.740	< 0.001	0.965
	1×106
	1×107
Val/%	1×105	0.53a	0.34b	0.36b	0.31c	0.35b	0.35b	0.36b	0.02	0.150	0.001	0.860	< 0.001	0.886
	1×106
	1×107
Lys/%	1×105	0.33a	0.24b	0.22bc	0.21c	0.23bc	0.26b	0.23bc	0.02	0.897	< 0.001	0.773	< 0.001	0.770
	1×106
	1×107
Val/%	1×105	0.41a	0.25b	0.26b	0.22cd	0.25bc	0.22d	0.26b	0.02	0.235	< 0.001	0.814	< 0.001	0.815
	1×106
	1×107
In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P > 0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05). The same below. DM means dry matter, the same below.

表选项






表 3. 禾谷镰刀菌接种量对玉米中非必需氨基酸含量变化的影响 Table 3. Effect of inoculum of Fusarium graminearum on non-essential amino acid in corn (DM)

Items	Inoculation/ (conidia/g)	t/d							SEM	P-value
		0	5	10	15	20	30	60		Inoculation	Time	Time× inoculation	Time ×time	Time×time ×inoculation
Cys/%	1×105	0.20a	0.06d	0.07d	0.07d	0.11c	0.09cd	0.16a	0.02	0.347	< 0.001	0.740	< 0.001	0.904
	1×106
	1×107
Tyr/%	1×105	0.49a	0.27bc	0.28b	0.23cd	0.27bc	0.21d	0.28b	0.03	0.323	< 0.001	0.814	< 0.001	0.956
	1×106
	1×107
Glu/%	1×105	1.49a	1.27b	1.30b	0.99c	1.02c	1.06c	1.29b	0.07	0.054	0.015	0.448	< 0.001	0.523
	1×106
	1×107
Pro/%	1×105	0.77a	0.64b	0.60b	0.53c	0.63b	0.59bc	0.60b	0.04	0.407	< 0.001	0.797	< 0.001	0.694
	1×106
	1×107

表选项







2.1.2 为禾谷镰刀菌提供C源的营养素变化规律: 玉米各处理组培养期间粗脂肪、淀粉、粗纤维含量变化见表 4。禾谷镰刀菌接种量对粗脂肪、淀粉、粗纤维含量变化无显著影响(P > 0.05)。粗脂肪、淀粉、粗纤维含量随着培养时间的延长呈线性降低(P < 0.01)。
表 4. 禾谷镰刀菌接种量对玉米中粗脂肪、淀粉、粗纤维含量变化的影响 Table 4. Effect of inoculum of Fusarium graminearum on EE and Starch and CF in corn (DM)

Items	Inoculation/ (conidia/g)	t/d							SEM	P-value
		0	5	10	15	20	30	60		Inoculation	Time	Time× inoculation	Time ×time	Time×time ×inoculation
EE/%	1×105	3.03a	2.98a	2.69b	2.20c	1.86d	1.30e	0.89f	0.01	0.305	< 0.001	0.235	0.012	0.761
	1×106
	1×107
Starch/%	1×105	50.99a	48.37a	41.07b	36.76c	34.09c	24.80d	23.49d	2.19	0.374	< 0.001	0.077	< 0.001	0.990
	1×106
	1×107
CF/%	1×105	2.06a	2.10a	1.69b	1.61b	1.40c	1.25c	0.97d	0.09	0.148	< 0.001	0.414	0.132	0.889
	1×106
	1×107

表选项







2.1.3 其他玉米品质评价指标变化规律: 玉米各处理组培养期间蛋白质溶解度、酸价、能量、霉菌总数变化见表 5。培养期间禾谷镰刀菌接种量是霉菌总数变化的主要影响因素，对蛋白质溶解度、酸价、能量变化无显著影响(P > 0.05)。酸价随着培养时间的延长呈线性上升(P < 0.01)，蛋白质溶解度、能量随着培养时间的延长呈线性降低(P < 0.01)。不同禾谷镰刀菌接种量组霉菌总数随着培养时间的延长呈二次曲线变化(P < 0.01)。
表 5. 禾谷镰刀菌接种量对玉米中其他品质评价指标变化的影响 Table 5. Effect of inoculum of Fusarium graminearum on quality evaluation index in corn

Items	Inoculation/ (conidia/g)	t/d							SEM	P-value
		0	5	10	15	20	30	60		Inoculation	Time	Time× inoculation	Time ×time	Time×time ×inoculation
Protein solubility/ % (DM)	1×105	23.27a	22.86a	20.43b	17.32c	14.81d	13.11d	10.69e	1.01	0.238	< 0.001	0.150	0.031	0.892
	1×106
	1×107
Acid value/% (DM)	1×105	0.34g	0.63f	1.27e	1.61d	1.87c	2.35b	2.64a	0.13	0.258	< 0.001	0.630	0.087	0.983
	1×106
	1×107
Energy (kJ/g) (DM)	1×105	15.67a	13.32b	12.71c	12.32cd	12.029d	11.21e	10.60f	0.30	0.374	< 0.001	0.782	0.003	0.952
	1×106
	1×107
total mold (CFU/g FM)	1×105	7.00× 102d	5. 7× 103d	7.33× 103d	1.03× 104d	3.83× 104c	9.67× 104a	7.33× 104b	278.11	0.015	< 0.001	0.016	< 0.001	0.560
	1×106	8.60× 102d	6.00× 103d	8.00× 103d	5.67× 104cd	1.50× 105bc	8.00× 105a	2.33× 105b
	1×107	8.80× 102d	7.33× 103d	1.23× 104d	1.20× 105cd	8.00× 105b	2.03× 106a	7.00× 105bc
FM means fresh matter.

表选项






玉米接种禾谷镰刀菌孢子悬浮液后，其培养性状在试验前5 d未变化如图 1-A，从试验第10天开始长出白色絮状菌丝，如图 1-B，在试验第15天白色菌丝达到生长旺盛期，如图 1-C，到试验第20天玉米表面覆盖禾谷镰刀菌产生的红色分泌物，如图 1-D，至试验第30天和试验第60天玉米红色加深，如图 1-E。

图 1 有氧条件下接种禾谷镰刀菌后玉米的培养性状 Figure 1 Culture characteristics of Fusarium graminearum corn under oxygen supply. A: 1×105-1×107 conidia/g inoculation of 5 d; B: 1×105-1×107 conidia/g inoculation of 10 d; C: 1×105-1×107 conidia/g inoculation of 15 d; D: 1×105-1×107 conidia/g inoculation of 20 d; E: 1×105-1×107 conidia/g inoculation of 60 d.

图选项

2.2 DON和15AC-DON积累动态变化规律 玉米各处理组培养期间DON和15AC-DON含量变化见表 6。不同禾谷镰刀菌接种量组DON和15AC-DON含量随着培养时间的延长呈二次曲线变化(P < 0.01)，禾谷镰刀菌接种量为1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷个/g时，玉米中DON和15AC-DON有积累动态变化规律。禾谷镰刀菌产DON前期：0-15 d，DON的含量分别达到0.17、0.22、0.23 mg/kg；产DON中期：16-20 d，DON的含量分别达到0.41、0.54、0.14 mg/kg；产DON后期：21-60 d，DON的含量分别为0.06、0.09、0.15 mg/kg。禾谷镰刀菌产15AC-DON前期：0-5 d，15AC-DON的含量分别达到1.11、3.27、5.28 mg/kg；产15AC-DON中期：6-15 d，15AC-DON的含量分别达到5.55、8.45、10.05 mg/kg；产15AC-DON后期：16-60 d，15AC-DON的含量分别为4.68、5.38、12.06 mg/kg。产毒量从高到低依次为1×10⁷个/g > 1×10⁶个/g > 1×10⁵个/g。
表 6. 禾谷镰刀菌接种量对玉米中DON和15AC-DON含量变化的影响 Table 6. Effect of inoculum of Fusarium graminearum on DON and 15AC-DON in corn (DM)

Items	Inoculation/ (conidia/g)	t/d							SEM	P-value
		0	5	10	15	20	30	60		Inoculation	Time	Time×inoculation	Time×time	Time×time×inoculation
DON (mg/kg)	1×105	0.00d	0.00d	0.00d	0.17b	0.41a	0.16b	0.06c	0.03	< 0.001	< 0.001	< 0.001	0.017	0.021
	1×106	0.00e	0.00e	0.00e	0.22c	0.54a	0.24b	0.09d
	1×107	0.00d	0.00d	0.00d	0.23c	1.14a	0.53b	0.15c
15AC- DON (mg/kg)	1×105	0.00e	1.11d	2.80c	5.55a	4.87b	4.40b	4.68b	0.53	< 0.001	< 0.001	< 0.001	0.041	0.248
	1×106	0.00e	3.27d	6.07c	8.45b	10.07a	5.92c	5.38c
	1×107	0.00g	5.28f	6.37e	10.05d	22.24a	17.54b	12.06c

表选项






2.3 玉米中霉菌总数、毒素、品质三者之间的相关性 玉米培养期间毒素与品质之间的相关性见表 7。结果表明，DON与粗蛋白质、氨基酸无相关性，与蛋白质溶解度(r=-0.321，P=0.012，n=3)、粗脂肪(r=-0.537，P=0.006，n=3)、淀粉(r=-0.600，P=0.004，n=3)和粗纤维(r=-0.586，P=0.005，n=3)呈显著负相关，酸价(r=0.460，P=0.030，n=3)、霉菌总数(r=0.552，P=0.009，n=3)呈显著正相关。15AC-DON与粗蛋白质、氨基酸、粗脂肪、粗纤维、淀粉无相关性，与蛋白质溶解度(r=-0.340，P=0.025，n=3)呈显著负相关，与酸价(r=0.464，P=0.034，n=3)、霉菌总数(r=0.714，P= < 0.001，n=3)呈显著正相关。
表 7. 玉米中毒素与品质之间的相关性 Table 7. Correlation between quality and toxins in CGM

Quality index	Correlation/r			Significant/P
	DON	15AC-DON		DON	15AC-DON
CP	—	__		—	__
Amino acid	—	__		—	__
EE	-0.537	__		0.006	__
CF	-0.586	__		0.005	__
Starch	-0.600	__		0.004	__
Protein solubility	-0.321	-0.340		0.012	0.025
Acid value	0.623	0.460		0.003	0.036
Moulds	0.552	0.714		0.009	< 0.001
Note: “—” means no correlation between the two factors.

表选项






3 讨论 3.1 禾谷镰刀菌接种量对玉米品质变化规律的影响 本课题组前期研究结果发现，在缺氧存储条件下，玉米中DON和15AC-DON无规律性积累动态变化，分析可能原因为接种量少和禾谷镰刀菌是需氧菌，在供氧条件下较适宜生长，而在缺氧存储条件下延缓或抑制菌株生长和产毒^[24-25]。缺氧条件下，水分22%，1×10⁵个/g禾谷镰刀菌接种量组0、5、10、15、20、30、60 d霉菌总数分别为8.50×10²、6.67×10³、9.33×10³、2.33×10⁴、4.75×10⁴、8.17×10⁴、3.63×10⁴ CFU/g。有氧条件下，22%水分含量和1×10⁵个/g禾谷镰刀菌接种量组，与缺氧存储条件比总体霉菌总数增加，并且霉菌总数与禾谷镰刀菌接种量呈剂量依赖关系。通过绝对消耗率公式[(60 d的数据值-0 d的数据值)/60 d×100%]，计算出该剂量组，为玉米中禾谷镰刀菌提供C源的淀粉、粗纤维、粗脂肪绝对消耗率分别为49%、46%、68%，提供N源的粗蛋白质、氨基酸、非蛋白氮绝对消耗率分别为98%、0.71%、97.29%；缺氧条件下，该剂量组，为玉米中禾谷镰刀菌提供C源的淀粉、粗纤维、粗脂肪绝对消耗率分别为58%、52%、72%，提供N源的粗蛋白质、氨基酸、非蛋白氮绝对消耗率分别为96%、19.86%、76.14%，说明玉米作为能量饲料其C源较丰富，N源相对不足，禾谷镰刀菌在生长过程中粗蛋白、氨基酸、非蛋白氮为其提供N源，淀粉、粗纤维、粗脂肪为其提供C源，同时发现，禾谷镰刀菌在缺氧和有氧存储条件下，对C、N源的利用规律一致，蛋白氮为其提供主要N源，其次为非蛋白氮，粗脂肪为其提供主要C源，其次为淀粉、最后为粗纤维，有所不同的是，禾谷镰刀菌在有氧存储条件下，对C、N源的绝对消耗率比在缺氧存储条件下高。氨基酸中Lys、Ile、Phe、Met、Arg、Val、Leu、Cys、Tyr、Glu、Pro含量总体呈下降趋势，说明以上氨基酸作为蛋白氮为禾谷镰刀菌提供了N源。而Trp、Thr、His、Ala、Gly、Ser、Asp的含量，在整个培养过程中无变化，说明禾谷镰刀菌生长时未利用以上氨基酸，也未产生相应代谢物。在有氧存储条件下，禾谷镰刀菌对玉米中的C、N源消耗量均增加，且禾谷镰刀菌接种量对玉米中霉变的影响存在剂量依赖关系。因此本试验证实了禾谷镰刀菌在有氧条件下增加对营养素的需求，同时降低玉米的品质。
3.2 有氧存储条件下禾谷镰刀菌接种量对玉米毒素积累动态变化规律的影响 本试验发现接种禾谷镰刀菌的玉米中，DON和15AC-DON在有氧条件下有积累动态变化规律，并存在剂量依赖关系，说明氧气和接种量对
毒素产生的影响大。本试验中15AC-DON和DON在玉米培养基中的毒素积累动态变化规律不一致。周闯^[26]以玉米作为培养基研究发现接种禾谷镰刀菌孢子悬液培养15 d后开始产毒，试验第25天产毒量最大，25-40 d DON含量逐渐下降，该研究结果与本试验中玉米中DON积累动态变化规律相近。尹珺等^[27]在察氏液体培养基中接种禾谷镰刀菌发现在接种培养的第30天DON产毒达到最大值，其后至45 d DON含量开始下降，其DON的毒素积累动态变化规律与本试验结果不一致。基质不同，基质提供的C、N源的物质种类和量亦不同，可能是影响毒素积累动态变化规律不同的原因。
通过将玉米中15AC-DON和DON与主要营养素能量、淀粉、粗脂肪、粗纤维、酸价之间进行相关性分析，结果发现15AC-DON与能量、淀粉、粗脂肪、粗纤维呈显著负相关，与酸价之间呈正相关，DON仅与酸价呈正相关。总体结果表明，禾谷镰刀菌的次生代谢产物15AC-DON和DON与玉米品质呈正相关。15AC-DON和DON与玉米中营养素的相关性不一致。
3.3 有氧条件下毒素积累和霉变的联系 在缺氧存储条件下，发现霉变与毒素积累无相关性，而在有氧存储条件下玉米中15AC-DON和DON与霉菌总数呈正相关。Lopez-Berges等^[28]研究发现，禾谷镰刀菌中TOR信号途径可以响应外源的不同氮源来调控禾谷镰刀菌产毒能力。FgSch 9是TOR信号途径中编码蛋白的一种基因。顾沁^[29]研究发现，FgSch 9在禾谷镰刀菌生长中，可调控气生菌丝的生长，以及促进DON产生过程中色素的合成。前期研究结果表明，在缺氧存储条件下培养，发现玉米未出现红色分泌物，而在有氧存储条件下，玉米在培养期间在产毒后期第20天出现了红色分泌物，产毒初期和产毒中期并未出现。禾谷镰刀菌主要通过利用玉米中的C源和N源以维持自身生长需要。禾谷镰刀菌对C源和N源的利用是由蛋白CreA调控的^[30]。Kumar等^[31]研究发现，CreA蛋白与TRI基因簇的结合位点位于TRI4-TRI6基因的间隔区，可以与一个新的基因FGSG-09715.3结合，更有利于调控CreA蛋白影响DON的合成。Ronne^[32]研究表明，在以葡萄糖作为C源的条件下，CreA蛋白能够和次生代谢相关基因启动子区的保守序列G/CPyGGGG结合从而抑制相关基因的表达。因此，DON和15AC-DON在禾谷镰刀菌适宜生长条件下有积累动态变化规律，受霉变的影响，与霉变程度和霉变性状相关。
4 结论 ① 有氧条件下，玉米品质随禾谷镰刀菌接种量增加和培养时间延长逐渐降低。
② 有氧条件下，玉米在禾谷镰刀菌产毒后期出现红色分泌物，粗蛋白质、氨基酸、非蛋白氮为禾谷镰刀菌生长提供N源，粗脂肪、淀粉、粗纤维为其提供C源。
③ 有氧条件下，DON和15AC-DON产量与禾谷镰刀菌接种量呈剂量依赖关系，60 d内二毒素积累存在前期、中期和后期的动态变化规律。
致谢
感谢四川农业大学植物病理教研室陈华宝老师提供禾谷镰刀菌产毒菌株，感谢四川省饲料站程传民老师在毒素测定工作中给予的指导和帮助。

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