石遵计, 曹政, 胡科鑫, 彭鑫碧, 朱一帆, 谢波
华中师范大学生命科学学院, 湖北 武汉 430079
收稿日期：2018-07-10；修回日期：2018-08-02；网络出版日期：2018-08-19
基金项目：国家自然科学基金（31570098）；中国博士后科学基金（2015M582247）；湖北省自然科学基金（2017CFB164）；中央高校基本科研业务费（CCNU18ZDPY03，CCNU16GD014）
作者简介：谢波，1996–2006于华中农业大学获得学士和微生物学博士学位，2006–2013分别在美国爱达荷大学和爱荷华州立大学进行博士后研究，现任华中师范大学生命科学学院教授。团队主要方向为结合生物学、生物信息学、生态学等多学科领域中的技术与理论开展微生物种间相互作用的基础与应用研究。相关论文发表在ISME J、Plant J、Plant Biotechnol J、Chem Eng J等杂志，部分文章获得F1000 Faculty的推荐.
*通信作者：谢波, Tel:+86-27-67867827, E-mail:xiebo@mail.ccnu.edu.cn.
摘要：[背景] 水体微生物有着丰富的多样性，不同种类的微生物之间的相互作用对水体生态系统的组成结构与功能具有重要影响。水体内的藻类与某些微生物可以发生多种相互作用，然而人们对逆境条件下的菌藻有益相互作用尚缺乏深入研究。[目的] 为了研究镉对水体微生物群落的影响以及镉胁迫下菌藻之间可能的相互作用。[方法] 本研究运用了基于16S rRNA基因的高通量测序技术，分析在不同Cd2+条件下微生物群落结构的变化，利用微生物相互作用网络分析菌藻之间可能发生的相互作用。[结果] 通过分离培养筛选出了与集胞藻PCC6803互作抗Cd2+的关键细菌Y9菌株。[结论] 研究结果表明Y9菌株属于Phyllobacteriaceae科，与微生物群落组成和微生物互作网络的分析结果相符。本研究为探索水体环境中微生物种间相互作用、菌藻互作抗Cd2+的生态效应提供参考依据。
关键词：菌藻互作镉离子高通量测序微生物互作网络
Interactions between bacteria and phytoplankton in microbial communities under cadmium contamination conditions
Zunji Shi, Zheng Cao, Kexin Hu, Xinbi Peng, Yifan Zhu, Bo Xie
School of life sciences, Central China Normal University, Wuhan 430079, Hubei Province, China
*Corresponding author: Bo Xie, Tel: +86-27-67867827; E-mail:xiebo@mail.ccnu.edu.cn.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31570098), by the China Post-doctoral Science Foundation (2015M582247), by the Hubei Natural Science Foundation (2017CFB164) and by the Self-determined Research Funds of CCNU from the College's Basic Research and Operation of MOE (CCNU18ZDPY03, CCNU16GD014)
Abstract: [Background] Microorganisms in water are rich in diversity, and various interspecific relationships occur among different microorganisms, which have an important influence on the composition structure and function of water ecosystem. Phytoplankton (microalgae and cyanobacteria) and some microbes in aquatic environment can interact with each other in various formats. However, the beneficial interactions between bacteria and phytoplankton under stress conditions remain unclear. [Objective] Studying the effects of Cd2+ on the microbial community of water samples and possible interactions between bacteria and phytoplankton. [Methods] Based on the high throughput sequencing of 16S rRNA gene, we analyzed the changes of microbial community structure under Cd2+ stress. We used the microbial interaction network to analyze the possible interaction between bacteria and phytoplankton. [Results] By isolation and culture, we found that the strain Y9 could interact with Synechocystis sp. PCC6803 and help the algae to resist the toxicity of Cd2+. [Conclusion] The results showed that strain Y9 belonged to Phyllobacteriaceae family, which was consistent with the results of microbial community composition and microbial interaction network. This study will provide a new scientific basis for exploring the interactions between microorganisms in aquatic environment and the ecological effects of interactions between bacteria and phytoplankton for cadmium resistance.
Keywords: bacteria and phytoplankton interactionCd2+microbial communitymicrobial interaction network
在自然界中，无论是水体环境还是土壤环境，细菌与藻类之间都广泛存在着直接或间接的相互作用。菌藻相互作用主要包括以下几个方面：(1)藻类附生细菌具有一定的宿主专一性，例如，黄杆菌门和鞘脂杆菌门的细菌是圆海链藻和中肋骨条藻的主要附生细菌[1]。(2)藻类和细菌之间有着抑制和促进等关系，例如，藻类可分泌抗菌物质抑制特定细菌的生长[2]；细菌合成的一些植物激素对藻类的生长有一定的调控作用[3]；某些细菌还具有溶藻、诱导藻类形态发育或藻体聚集等能力[4-5]。(3)藻类与细菌之间可以识别和感应彼此的信号物质，例如，藻类可能会依赖NO或核黄素衍生物来调控细菌的行为[6]。
细菌对藻类提供的有利方面主要集中在营养改善、激素调节和协同保护[7-8]。对必需物质提供方面，细菌不仅可以为其他生物提供氮源，还可以对其他生物要素进行加工，例如，某些细菌的5′-核苷酶含量较高，因此可以通过酶促还原作用快速地对ATP类5′-核苷酸进行水解，产生大量藻类可以使用的无机磷[9]。在为藻类提供激素等方面，有研究表明浒苔共生菌具有将色氨酸转变为植物激素吲哚乙酸(IAA)的能力[10]。细菌能够对重金属、化学污染物等毒物进行吸附、分解和转化从而发挥协同保护的作用，降低毒物的侵害[11-12]。菌藻互作抗逆还包括抗热、耐盐等，如细菌产生的维生素B12可满足藻类生长需要从而显著增强衣藻耐热能力[13]，某些细菌可帮助藻类耐盐[14]。
尽管上述研究提供了一些例证，但人们对不同环境条件、时间尺度下藻类与细菌互作的形式、机理和变化趋势等重要问题的了解并不深入，其原因主要在于传统的研究方法难以评价环境中微生物的复杂相互作用关系、难培养微生物的大量存在等。另外，我国部分水体中的重金属Cd2+污染日益严重，现实环境中菌藻互作抵抗重金属Cd2+的相关研究甚少，相关种群还不清楚。有关在研究藻类与细菌相互作用时选择高通量测序方法的报道目前还很少。因此，选择高通量测序等技术研究镉离子胁迫下藻类与细菌相互作用是比较适合的方法。微生物种间相互作用研究中，目前的常用技术是利用各物种或OTU的同现性或相关性对相互作用进行评估[15]。在基于SPARCC相关性等算法获得物种共现性后，可在一定的阈值上筛选并构建出微生物种间互作的网络。我们认为不仅要注重利用高通量测序数据构建种间互作的网络，同时也要结合传统生物学实验予以验证和补充，使菌藻互作形式与机理研究更深入。
1 材料和方法 1.1 样品采集及富集方法 采集武汉南湖水样，以环境水样不加Cd2+ (CdCl2·2.5H2O)为对照，在Cd2+ (25 μmol/L)胁迫条件下，在无碳源BG11培养基中富集处理培养5 d后，取出1/2水样，用循环水式多用真空泵于0.22 μm孔径的聚碳酸酯滤膜上过滤，用于DNA提取及细菌群落结构分析。每个处理分3个实验组，培养5 d为一轮富集，如此富集5轮并收集样品，处理分组见表 1。
表 1. 实验样品处理表 Table 1. Experimental groups and treatments
| Enrichment cycles | Water samples | Water samples/Cd2+ treatment |
| Control | Water (1, 2, 3) | |
| First round | Water (1, 2, 3) | Cd2++Water (1, 2, 3) |
| Second round | Water (1, 2, 3) | Cd2++Water (1, 2, 3) |
| Third round | Water (1, 2, 3) | Cd2++Water (1, 2, 3) |
| Fourth round | Water (1, 2, 3) | Cd2++Water (1, 2, 3) |
| Fifth round | Water (1, 2, 3) | Cd2++Water (1, 2, 3) |
| 1, 2, 3 in Table 1 mean number of replication. | ||
表选项
1.2 群体水平高通量测序与数据分析 提取各处理组样品总DNA，按照Illumina公司16S rRNA基因测序建库方法，采用通用引物扩增16S rRNA基因序列V3-V4区，并利用标签化引物二次扩增构建16S rRNA基因高通量测序文库，最后在Illumina Miseq平台进行测序。随后分析细菌群落多样性，首先利用QIIME进行初步的质量筛选(去除接头污染的序列，同时去除引物序列与Barcode序列)。基于QIIME等，分选序列，以97%的序列相似性拣出OTU，去除嵌合体，进行Alpha diversity、Beta diversity、Taxonomic analysis等分析细菌群落结构。利用origin 2017、office 2017和SPSS Statistics 17.0软件进行统计分析。
1.3 菌藻互作中物种互作网络及菌藻互作抗Cd2+有益菌Y9菌株的分离鉴定 利用高通量测序OTU丰度结果，以SPARCC等算法实现的共现相关性为关键依据，构建微生物物种相互作用网络，并通过Cytoscape-3.3构建网络图形。以高通量测序所获得与菌藻互作抗Cd2+过程中细菌种类的有关信息为基础，挖掘互作网络中的有关信息如抗Cd2+微生物的种类等；同时以集胞藻PCC6803为材料，在48孔板中共接种藻类和分离的细菌，建立高通量菌藻互作研究平台，考察共培养物中藻类活细胞数量等指标，以增强藻类抵抗环境因子Cd2+的能力为标准，实际分离筛选保护藻类抵抗重金属Cd2+的菌株。
本实验所用到的藻种是集胞藻PCC6803 (Synechocystis sp. PCC6803)，来源于中国科学院水生生物研究所徐旭东研究员实验室。首先，用24孔板测定集胞藻PCC6803的抗Cd2+最小抑制浓度(MIC)。Cd2+浓度梯度为0、5、10、25、50、100、150、200 μmol/L。空白对照和每个浓度梯度都设3个重复，在温度为25 ℃、光照强度为2000 lux的养藻间静置培养5 d，期间定时观察藻的生长状况。其次，取富集第5轮的水样1 mL，将其稀释到10–1、10–2和10–3。然后取100 μL稀释液在含100 μmol/L Cd2+的R2A和LB固体平板培养基上稀释涂布，置于恒温培养箱进行28 ℃培养。48 h后，挑取各单克隆于平板培养基上划线培养，获得纯的单菌落。通过对分离的Cd2+抗性菌进行16S rRNA基因的扩增与测序，鉴定细菌的种属。然后在24孔板中进行菌藻共培养实验，筛选到了能增强PCC6803抗Cd2+的细菌Aminobacter sp. Y9。
1.4 Y9菌株与集胞藻PCC6803互作抗Cd2+过程中藻数的测定 实验于100 mL锥形瓶中，在无碳源BG11培养基中，按照(1) PCC6803、(2) PCC6803+Cd2+、(3) PCC6803+Cd2++Y9、(4) PCC6803+Y9进行分组实验，其中PCC 6803与Y9菌株按照不同的比例进行共培养，比例分别是1:0.1、1:1、1:10、1:100，每组设3个重复，放置在温度为25 ℃、光照强度为2000 lux的养藻间静置培养，每天摇动2次。其中Cd2+浓度为集胞藻PCC6803抗Cd2+ MIC (25 μmol/L)。在培养过程中，每隔24 h，利用显微镜直接计数法，取30 μL的培养液放在血球计数板中，于显微镜下直接计数，然后推算出总的藻数，再以时间为横轴，藻数为纵轴，制作集胞藻PCC6803的生长曲线。显微计数公式如下：每毫升原液所含藻数=每小格平均藻数×400×1000×稀释倍数。
2 结果和分析 2.1 水样富集过程中细菌多样性测序深度及α和β多样性指数分析 处理后的样品经利用Illumina Miseq测序平台测序。序列经质控、双端拼接后，在25个样品中(含1个技术重复)共获得206192条序列。OTU以序列相似性≥97%为标准。经技术重复数据可靠性检测，我们将各样品OTU的要求定为3个重复至少均检测出2次(3×2)，并以此进行数据过滤、去除嵌合体。过滤后的数据以样品最低序列数进行稀薄化Rarefaction处理，得到有效OTU 1162个，该OTU表用于后续多个分析。
各样品的rarefaction (稀释度曲线)见图 1-A，在测序序列达到7500条带之后，每个样品的OTUs含量趋于稳定，说明其可以满足样品的测序深度分析要求。如图显示，在5轮富集过程中，水样组及水样加Cd2+组的Simpson多样性指数变化不大并且无明显差异(图 1-B)。图 1-C显示，同一处理组聚集在一起，说明相同处理之间的群落多样性具有相似性。对照组、水样组和水样加Cd2+组的点离得都较远，表明Cd2+处理的细菌群落结构变化明显。
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| 图 1 水样富集过程中细菌多样性测序深度的rarefaction分析(A)，α多样性指数分析(Simpson) (B)和β多样性指数分析(Bray-Curtis) (C) Figure 1 Rarefaction curves, bacteria alpha diversity (Simpson) and β-diversity analysis of the sequencing data A: Rarefaction curve of the observed OTUs. B: Simpson index analysis. C: PCoA results based on Bray-Curtis distance. Bars in Figure 1-A represent the mean±SD of the biological replicates. 0, 1, 3, 5 in Figure 1-B mean the enrichment cycle. |
| 图选项 |
2.2 细菌群落结构的组成和变化 如图 2-A所示，对水样在Cd2+富集过程中细菌群落结构的组成和变化分析得出(丰度在前50的科)，其中占优势的科有Pseudomonadaceae、Moraxellaceae、Sphingomonadaceae、Strepttococcaceae、Bacillaceae等，可以看出，Rhodoccyclaceae、Chitinophagaceae、Phyllobacteriaceae等科的细菌丰度随Cd2+的富集逐渐增多。从图 2-B和图 2-C中得到Chitinophagaceae和Phyllobacteriaceae 2个科在富集前的细菌丰度接近为0，富集过程中2个科的菌都有明显增多，推测这2个科中的细菌可能具有抗Cd2+能力。
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| 图 2 水样在Cd2+富集过程中的细菌群落变化 Figure 2 The microbial communities of water sample during multi-cycle Cd2+ stress A: The abundance change of Top 50 Families. B: The abundance change of Chitinophagaceae. C: The abundance change of Phyllobacteriaceae. Bars in Figure 2-B and Figure 2-C represent the mean±SD of three biological replicates. |
| 图选项 |
2.3 水样富集过程中物种互作网络及菌藻互作抗Cd2+有益菌的分离鉴定 进一步基于共现性构建出微生物种间相互作用网络，首先根据OTU的相关性，将科水平的细菌物种建立了共现性网络(图 3-A)。SPARCC相关性r阈值为0.60或–0.60，P≤0.01以保证网络中仅保留相关性大于阈值的物种。微囊藻科(Microcystaceae)和束球藻科(Gomphosphaeriaceae)是本实验水样中检测到的主要蓝藻，由图 3-A所示，与微囊藻科(Microcystaceae)主要正相关菌有Comamonadaceae、Leuconostocaceae、Hyphomonadaceae、Bradyrhizobiaceae等11个类群，与束球藻科(Gomphosphaeriaceae)主要正相关菌有Comamonadaceae、Hyphomonadaceae、Bacillaceae、Phyllobacteriaceae等10个类群，这些细菌类群有可能在菌藻互作抗Cd2+中发挥着重要作用。
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| 图 3 微生物种间相互作用网络及实验验证 Figure 3 Microbial species interaction network and experimental verification A: Microbial species interaction network based on their co-occurrences at the family level. B: The growth curves of Synechocystis sp. PCC6803 with different ratios of strain Y9 under Cd2+ stress. In figure A, the blue and green circles in the figure represent cyanobacteria, and the bacteria that can positively interact with cyanobacteria, respectively. In figure B, Cd2+ indicates that the concentration of Cd2+ is 25 μmol/L, and 6803/0.1 Y9 indicates that the ratio of PCC6803 and bacteria is 1:0.1, 6803/Cd2+/0.1 Y9 indicates that the ratio of PCC6803 and bacteria is 1:0.1 under 25 μmol/L Cd2+ stress, and so on. |
| 图选项 |
为验证高通量测序所获得的菌藻互作抗Cd2+过程中微生物群落组成等信息，挖掘微生物互作网络中与蓝藻密切相关的细菌种类，获得与菌藻互作抗Cd2+过程密切相关的关键细菌，我们以集胞藻PCC6803为材料，在24孔板中共接种藻类和分离的细菌，筛选出能与集胞藻互作抗Cd2+的关键细菌。通过实验，藻PCC6803的抗Cd2+最小抑制浓度MIC为25 μmol/L。我们分离到了能与集胞藻PCC6803互作抗Cd2+的细菌Aminobacter sp. Y9，Y9菌株抗Cd2+最小抑制浓度MIC为200 μmol/L。在无碳源BG11培养基中，通过测定不同藻菌比例(1:0.1，1:1，1:10，1:100)的集胞藻PCC6803与Y9菌株在25 μmol/L Cd2+胁迫后的藻数，结果显示藻PCC6803的生长被Cd2+抑制，通过与不同比例的Y9菌株共培养后，即使在Cd2+胁迫下，藻PCC6803的生长逐渐恢复(图 3-B)，Y9菌株本身在无碳源BG11培养基中不能生长，但与藻PCC6803共培养后，Y9菌株具有了一定的生长趋势(结果未显示)，结果表明该菌确实可以与集胞藻PCC6803互作抗Cd2+。更为重要的是，该菌属于Phyllobacteriaceae科(图 3-A红色字体)，这与我们微生物互作网络中Phyllobacteriaceae科与Gomphosphaeriaceae (蓝藻)具有正相关结果相符。
3 讨论 本实验中，我们通过高通量测序分析了水样在Cd2+胁迫下富集过程中细菌群落结构的组成和变化。构建出微生物种间相互作用网络，发现了在菌藻互作抗Cd2+中与蓝藻正相关的细菌物种。并分离到了能与集胞藻PCC6803互作抗Cd2+的关键细菌Aminobacter sp. Y9，该分离菌株属Phyllobacteriaceae科，这与微生物群落组成和微生物互作网络的信息与结果相符。
本研究运用了基于16S rRNA基因的高通量测序技术，然而16S rRNA基因并不能用来完全表征某一微生物的种属，在高通量测序的数据中，某些微生物虽然可以精确到种的水平，但是我们也难以百分之百预测出具体微生物的信息。另外，由于共现性计算的局限性、实验室培养的难度和某些功能微生物并不依赖于数量的变化来发挥功能，也将造成组学数据和试验结果之间的差异。尽管Y9菌株能与集胞藻相互作用抵抗Cd2+胁迫，而在组学数据中并没有观察到明显的一致性。在探究Y9菌株与集胞藻PCC6803互作抗Cd2+机制过程中，我们推测菌藻互作过程Y9菌株分泌某种代谢物与镉离子相结合或胞外糖的包裹减轻了镉离子对藻PCC6803的抑制，或Y9菌株的存在给藻PCC6803创造了某种适宜的微环境。在以后的研究中，需要结合代谢组学深入研究菌藻互作抗Cd2+机制。
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