杨娅男1, 李彦澄1,2
, 李江1,2, 吴攀1,2, 艾佳1, 钟雄1 1. 贵州大学资源与环境工程学院, 贵州 贵阳 550025;
2. 贵州喀斯特环境生态系统教育部野外科学观测研究站, 贵州 贵阳 550025
收稿日期：2020-01-06；修回日期：2020-04-21；网络出版日期：2020-04-24
基金项目：国家重点研发计划（2016YFC0400702-4）；贵州省科技计划（黔科合重大专项字[2019]3009）；贵州省人才基地项目（RCJD2018-21）
作者简介：杨娅男, 女, 汉族, 1995年4月, 贵州大学硕士研究生, 环境工程专业。研究方向为城镇污水深度处理技术, 主要研究基于甲烷氧化菌的深度脱氮技术。以第一作者发表论文2篇, 分别为《基于甲烷氧化菌的脱氮技术研究进展》、《基于甲烷氧化菌的城镇污水厂尾水极限脱氮系统构建及机理研究》, 申请国家发明专利1项《一种用于城镇污水处理厂深度脱氮氧化系统及构建方法》(2019107749860).
*通信作者：李彦澄。E-mail:ycli3@gzu.edu.cn;
李江。E-mail:jli82@gzu.edu.cn.
摘要：[目的] 探究甲烷浓度、温度和氮浓度对好氧甲烷氧化耦合反硝化（AME-D）极限脱氮系统的影响，分析该系统微生物群落结构，并对贵阳某污水处理厂尾水进行应用研究。[方法] 采用阶段性实验研究甲烷浓度、温度和氮浓度对系统脱氮效能的影响，通过16S rRNA基因测序技术分析系统中微生物群落结构，利用共焦显微拉曼光谱仪分析实际废水水质变化特征。[结果] 甲烷进气比为3%、温度为30℃、氮浓度为20 mg/L时脱氮效果最好，系统的总氮、氨氮和硝酸盐氮平均去除率分别为93.66%、96.13%和92.25%；系统中的主要甲烷氧化菌分别为Methylosarcina（1.84%）、Methylovulum（0.01%）和Crenothrix（0.14%），以及兼性甲烷氧化菌属Methylocystis（1.9%），主要的亚硝化菌为Nitrosomonas（0.008%），硝化菌为Nitrospira（0.42%），反硝化菌为Hyphomicrobium（1.19%）和Pseudomonas（0.61%）；采用该系统处理贵阳某污水处理厂尾水时，出水总氮平均浓度达到0.96 mg/L，能达到极限脱氮的目的，拉曼光谱分析显示系统对硝酸盐氮和亚硝酸盐氮有较高的去除，甲烷被氧化形成的中间产物可能为醇类或醛类物质，为反硝化菌提供所需碳源。[结论] AME-D极限脱氮由多种微生物协同实现，其功能微生物为甲烷氧化菌、亚硝化菌、硝化菌和反硝化菌，应用研究显示该系统在城镇污水处理系统中具有较大的应用潜力。
关键词：AME-D极限脱氮效能拉曼光谱16S rRNA
Efficiency and application of aerobic methane coupled to denitrification ultimate denitrification system
Yang Ya'nan1, Li Yancheng1,2
, Li Jiang1,2, Wu Pan1,2, Ai Jia1, Zhong Xiong1 1. College of Resource and Environmental Engineering, Guiyang 550025, Guizhou Province, China;
2. Guizhou Karst Emiron Mental Ecosystems Observation and Research Station, Ministry of Education, Guiyang 550025, Guizhou Province, China
Received: 6 January 2020; Revised: 21 April 2020; Published online: 24 April 2020
*Corresponding author: Yancheng Li, E-mail:ycli3@gzu.edu.cn;
Jiang Li, E-mail:jli82@gzu.edu.cn.
Foundation item: Supported by the National Key Research and Development Program (2016YFC0400702-4); by the Guizhou Provincial Science and Technology Planning Project (Guizhou Science and Technology Cooperation Major Special Word[2019]3009) and by Guizhou Provincial Talent Base Project (RCJD2018-21)
Abstract: [Objective] This research is to analyze the effects of methane concentration, temperature and nitrogen concentration on the aerobic methane coupled to denitrification (AME-D) ultimate denitrification system, the microbial communities in this AME-D system, and the application of this system into the tail water of a sewage treatment plant in Guiyang, China. [Methods] The effects of methane concentration, temperature, and nitrogen concentration on the nitrogen removal efficiency of this system were studied in staged experiments. The microbial community in the system was analyzed by 16S rRNA gene sequencing technology, and changes of the wastewater water quality were analyzed by confocal micro-Raman spectrometer. [Results] With the methane intake ratio of 3%, and the nitrogen concentration of 20 mg/L at 30 ℃, the average removal rates of total nitrogen, ammonia nitrogen, and nitrate nitrogen in the system reached high up to 93.66%, 96.13% and 92.25%, respectively; The dominant methanotrophs in this system were Methylosarcina (1.84%), Methylovulum (0.01%) and Crenothrix (0.14%); the facultative methanotrophs was Methylocystis (1.9%); and the dominant nitroso-bacteria were Nitrosomonas (0.008%), nitrifying bacteria were Nitrospira (0.42%), and denitrifying bacteria were Hyphomicrobium (1.19%) and Pseudomonas (0.61%). Applying this system into the tail water of a sewage treatment plant in Guiyang, the average total nitrogen concentration in the effluent reached 0.96 mg/L, reaching the limit of denitrification. Raman spectrum analysis showed that nitrate nitrogen and nitrite nitrogen can be effective removed in this system. Intermediate products of the oxidized methanotrophs could be alcohols or aldehydes, which can provide the required carbon source for denitrifying bacteria. [Conclusions] AME-D ultimate denitrification was realized by the synergy of microorganisms, including functional microorganisms like methanotrophs, nitroso-bacteria, nitrifying bacteria, and denitrifying bacteria. Research results also exhibited great potential of this system applied into the urban sewage treatment.
Keywords: AME-Dextreme denitrificationefficiencyRaman spectroscopy16S rRNA
城镇污水处理厂生化处理后出水中仍含有大量的氮污染物，如果直接排入自然水体，会导致严重的水体富营养化，因此需对污水处理厂生化池出水进行深度脱氮处理。常规的深度脱氮技术包括反硝化生物滤池、人工湿地、膜分离法等，Lin等[1]利用基于反硝化除磷(DPR)的单级生物滤池进行深度营养去除，TN和NO3--N的去除率达到71.08%和74.81%。王宁等[2]构建曝气生物碳潜流湿地(SW)以常规曝气潜流湿地(CW)作为参照，探究生物碳投加对系统脱氮性能的影响，SW系统平均出水TN和NH4+-N浓度为1.98 mg/L和0.17 mg/L，去除率较CW系统提高了6.9%和5.1%。黄山等[3]利用一种新型一体化生物反应器研究不同DO浓度和水力停留时间下对城市污水的处理效果，NH4+-N平均去除率达94.5%以上，TN平均去除率仅为40%左右。但常规深度脱氮技术普遍存在碳源不足的问题，成为制约生物脱氮的重要因素。
早在1971年，Harremoes和Christensen将甲烷作为反硝化的气体碳源应用到污水处理中，首次发现AME-D (Aerobic methane coupled to denitrification)现象[4]。1978年Rhee等[5]证实AME-D是由好氧甲烷氧化菌和反硝化菌协同作用完成的，好氧甲烷氧化菌能利用甲烷为唯一的碳源、能源，在氧化甲烷的同时释放出中间产物为反硝化菌脱氮提供碳源。目前发现的AME-D分为AME与反硝化菌协同脱氮[6]、AME单独完成甲烷氧化与反硝化[7]两种过程。同时也有研究者[8]分离、筛选出一株甲烷氧化菌MO-01，利用麦芽糖、蔗糖和甲醇等作为碳源。中国正在由“低碳社会”迈入“低氮社会”，20世纪70年代，“生物脱氮除磷之父” James Barnard[9]创造出经典的Bardenpho污水处理脱氮工艺，认为未来完全可以设计出可靠的系统实现高标准出水，即TN < 3 mg/L。1996年，美国弗罗里达州执行的美国TN < 3 mg/L和TP < 0.1 mg/L排放标准，推动州内污水厂的升级，应用极限脱氮技术主要分布在美国东部。此外，昆明等重点区域TN排放标准从20 mg/L (一级B)和15 mg/L (一级A)，提升至5 mg/L (昆明A标)，逐渐向极限脱氮迈进。
研究采用改良型反硝化生物滤池，探究甲烷浓度、温度和氮浓度对好氧甲烷氧化耦合反硝化(AME-D)极限脱氮系统的影响，在最佳控制参数条件下，对系统微生物进行16S rRNA基因测序分析；进一步采用贵阳某污水处理厂生化池出水进行实验，并通过拉曼光谱分析进出水水质，为城镇污水处理厂深度脱氮技术提供理论及技术支撑。
1 材料和方法 1.1 实验水质
1.1.1 实验配水水质: 影响因素研究阶段采用人工模拟城镇污水厂尾水，模拟废水水质参数分别为COD 20 mg/L、氨氮8 mg/L和总磷1 mg/L，此外，总氮分别控制为20 mg/L、30 mg/L和40 mg/L。其中葡萄糖模拟COD，KH2PO4模拟总磷，NH4Cl模拟氨氮，NaNO3模拟硝酸盐氮。同时添加微生物必需的微量元素[10]，每升微量元素溶液含CaCl2·2H2O 0.2 g、MgSO4·7H2O 1 g、Fe-EDTA 0.38 mg、Na2MoO4·H2O 0.26 mg、FeSO4·7H2O 0.90 mg、MnCl2·4H2O 0.02 mg、CoCl2·6H2O 0.05 mg、H3BO3 0.015 mg、Na-EDTA 0.25 mg、ZnSO4·7H2O 0.40 mg、NiCl2·6H2O 0.01 mg、CuSO4·5H2O 1.25 mg。
1.1.2 贵阳某污水处理厂二级出水水质: 贵阳某污水处理厂采用“格栅+SBR+活性砂过滤”污水处理工艺，出水水质执行国家《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)一级A标准，污水处理厂出水排入城市河流。采用该污水处理厂SBR出水进行实验，其水质分别为：COD为8 mg/L，氨氮为0.7 mg/L，总氮为9 mg/L。
1.2 实验装置 实验装置如图 1所示，反应器与曝气式反硝化生物滤池构造类似，主体为双层构造，反应器内层的有效体积为2 L，底部设置曝气管，并铺设6-8 mm的鹅卵石垫层5 cm，采用填料为2-4 mm石英砂，外层为水浴保温层，通过循环水控制温度(10 ℃、20 ℃和30 ℃)，反应器为间歇式运行方式。实验所需气体为甲烷与空气形成混合气体，甲烷比例分别为3%、2%和0%，并在反应器出气管上设置甲烷在线监测仪。
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| 图 1 实验装置 Figure 1 Experimental reactor. 1: reactor body; 2: packing (2-4 mm quartz sand); 3: cushion (6-8 mm pebbles); 4: aerator or aerator head; 5: valve; 6: check valve; 7: inlet pipe; 8: out of the trachea; 9: waste water inlet pipe; 10: waste water outlet pipe; 11: hot water inlet pipe; 12: hot water outlet pipe; 13: methane online monitor; 14: inlet peristaltic pump; 15: hot water circulating pump; 16: into the water tank; 17: constant temperature water tank; 18: gas flowmeter; 19: gas flow control valve; 20: mixed gas. |
| 图选项 |
1.3 实验方法 实验构建成功后采用上方进水下方出的间歇式运行方式，温度控制为(30±1) ℃，运行周期为“进水0.5 h，运行23 h，出水0.5 h”，每个周期结束后更换反应器内部所有液体，其水量为1.2 L/d。进水氮浓度为20 mg/L，进水和出水时停止进气，运行时进气甲烷比例为3%、流量为30 mL/min。依次探究甲烷浓度(气体公司订制的低浓度甲烷混合气体) (3%、2%和0%)、温度(30、20和10 ℃)、氮浓度(20、30和40 mg/L)对反应器效能的影响，对反应器运行过程中采用甲烷在线监测仪监测出气中甲烷浓度比，并计算甲烷平均日消耗量(甲烷日消耗量=进气甲烷浓度比-出气甲烷浓度比)，定期检测出水中的温度、DO、氨氮、硝酸盐氮和COD等水质指标。
1.4 分析方法 氨氮分析采用水杨酸分光光度法(HJ536-2009)，硝酸盐氮分析采用紫外可见分光光度法(HJ/T346-2007)，甲烷消耗量监测采用SK-600-CH4型甲烷在线监测仪，DO采用DO便携式分析仪，COD采用HACH-COD快速消解分析法[11]。
1.4.1 拉曼光谱分析方法: 取约15 mL样品放于离心管中，冷冻成冰，利用真空冷冻干燥机将样品制成干燥的粉末并冷藏保存。采用LRS-8共焦显微拉曼光谱仪对干燥的样品进行分析。具体分析方法同杨娅男等[12]相同。
1.4.2 微生物多样性分析: 采集系统影响因素实验后的微生物进行16S rRNA基因测序分析，将采集的混合液置于离心管中进行离心1 min，转速6000 r/min去除上清液后立即储存于-20 ℃条件下冷冻，然后送至上海美吉(Majorbio)进行16S rRNA基因测序分析，进行V3-V4高变区测序[13]，选用细菌通用引物为：338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，分析测试方法与李彦澄等[14]方法相同。
2 结果和讨论 2.1 AME-D极限脱氮系统的效能研究
2.1.1 甲烷浓度对系统的影响: 在温度为30 ℃、进水中总氮浓度为20 mg/L时，控制甲烷浓度分别为3%、2%和0%，系统的脱氮效能如图 2所示。当甲烷浓度为3%时，出水DO为1.94 mg/L，出水COD为22.27 mg/L，甲烷平均日消耗量为0.36%，出水中氨氮和硝酸盐氮平均浓度分别为0.68 mg/L和0.30 mg/L，总氮和氨氮平均去除率为94.93%和91.54%。2%时出水DO为2.25 mg/L，出水COD上升为26.18 mg/L，甲烷平均日消耗量为0.29%，总氮和氨氮平均去除率为31.63%和90.13%，此甲烷浓度下甲烷消耗量表现出下降趋势，由0.36%下降为0.29%，从图 2可知，出水硝酸盐氮浓度明显上升，由0.30 mg/L增加至12.78 mg/L，而氨氮浓度维持在0.68 mg/L与0.79 mg/L之间，主要是由于甲烷浓度降低至2%后，系统中DO变高，降低了系统中反硝化菌的活性，此外，系统对甲烷的消耗量减少，产生中间产物减少，导致反硝化菌脱氮所需碳源不足。由于反硝化菌所需环境为缺氧环境，故甲烷浓度0%时，系统采用停止供应混合气体进行控制，该条件下系统出水中的DO为1.47 mg/L，出水COD下降趋势为10.7 mg/L，氨氮和硝酸盐氮平均浓度分别为7.52 mg/L和0.8 mg/L，总氮和氨氮平均去除率分别为57.91%和6%，说明在不供应混合气体时，系统基本无去除氨氮的能力，而反硝化菌则可利用进水中的部分有机物进行反硝化脱氮，但由于碳源不足，导致脱氮效率较低。其他相关研究如Thalasso等[15]发现停止供应氧气，好氧甲烷氧化菌无法氧化甲烷，未能释放出作为反硝化电子供体的中间产物，反硝化作用就会终止。通过上述分析可知，该系统在甲烷浓度为3%时，系统已实现极限脱氮，并由于增加甲烷浓度会降低该系统应用于实际工程的可能性，故该AME-D系统的最适甲烷浓度为3%。
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| 图 2 不同甲烷进气比下反应器出水TN、NH4+-N、NO3--N和去除率 Figure 2 TN, NH4+-N, NO3--N and efficiency in the effluent under the different methane intake ratio. The error bars represent the standard error of the mean. P < 0.05. |
| 图选项 |
2.1.2 温度对系统的影响: Mohanty等[16]认为，温度能影响甲烷氧化菌的生长和群落结构的组成。同时温度也是影响AME-D系统的因素之一。完成甲烷浓度对系统的影响研究后，将系统重新采用甲烷浓度为3%，进水中氮浓度为20 mg/L，控制系统的温度分别为30、20和10 ℃，系统的脱氮效能如图 3所示。当温度为30 ℃时，出水COD为23.71 mg/L，出水中氨氮和硝酸盐氮平均浓度分别为0.37 mg/L和0.08 mg/L，总氮和氨氮平均去除率分别为97.65%和95.38%。当温度降低至20 ℃时，出水COD降低为21.24 mg/L，出水硝酸盐氮和氨氮分别为0.01 mg/L和0.37 mg/L，总氮和氨氮的平均去除率仍较高，分别为97.97%和95.38%。而当温度降低至10 ℃时，出水COD为20.59 mg/L，硝酸盐氮平均浓度上升至1.17 mg/L，总氮平均去除率下降至92.16%，氨氮平均浓度与平均去除率变化不大，分别为0.38 mg/L和95.25%，说明在温度为10 ℃时，降低了系统中微生物的活性，相关研究发现大部分的甲烷氧化菌的生长温度为20-30 ℃[17]，故该AME-D系统在20-30 ℃均能实现极限脱氮。
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| 图 3 不同温度下反应器出水TN、NH4+-N、NO3--N和去除率 Figure 3 TN, NH4+-N, NO3--N and efficiency in the effluent under the different temperatures. The error bars represent the standard error of the mean. P < 0.05. |
| 图选项 |
2.1.3 氮浓度对系统的影响: 为了进一步探究系统对不同氮浓度的适应能力，(温度为30 ℃，甲烷浓度为3%，控制进水总氮浓度分别为20 mg/L、30 mg/L和40 mg/L，测定了系统的脱氮性能。如图 4所示。)当进水中总氮浓度为40 mg/L时，出水COD为39.38 mg/L，出水氨氮和硝酸盐氮的平均浓度分别为0.53 mg/L和26.76 mg/L，出水总氮、氨氮和硝酸盐氮平均去除率分别为31.68%、93.38%和16.38%。Modin等[18]采用MBfR反应器研究发现当进水硝酸盐浓度高时，混合气体供应下会产生大量的亚硝酸盐，脱氮效果差，同时通过亚硝酸还原酶基因nirS和nirK的PCR扩增证明该实验中的生物膜具有反硝化的遗传潜力。当进水中总氮浓度为30 mg/L时，出水COD为28.6 mg/L，出水硝酸盐氮和总氮平均浓度分别下降至3.04 mg/L和3.62 mg/L，硝酸盐氮和总氮平均去除率分别上升至86.18%和87.93%，而当进水中总氮浓度为20 mg/L时，出水COD为22.89 mg/L，出水硝酸盐氮和总氮平均浓度表现出明显下降至0.93 mg/L和1.27 mg/L，出水总氮、氨氮和硝酸盐氮平均去除率上升至93.66%、96.13%和92.25%。由此可知，虽然该AME-D系统在进水中总氮浓度较高时具有一定的脱氮效率，出水中氮污染物的浓度仍然较高，而在进水中总氮浓度较低时的脱氮率最高，即1.27 mg/L < 3 mg/L能实现极限脱氮[9]。
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| 图 4 不同氮负荷下反应器出水TN、NH4+-N、NO3--N和去除率 Figure 4 TN, NH4+-N, NO3--N and efficiency in the effluent under the different nitrogen loads. The error bars represent the standard error of the mean. P < 0.05. |
| 图选项 |
2.1.4 微生物群落分析: 采集最佳控制条件下系统中微生物进行16S rRNA基因测序分析，在门水平上(图 5-A)，占优势的菌群是变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)和放线菌门(Actinobacteria)，分别占41.09%、25.99%、10.76%和6.41%，而在AME-D过程中起主要作用为变形菌门，有研究发现大部分反硝化菌和甲烷氧化菌均属于变形菌门[19]。
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| 图 5 门、科和属水平上的微生物分类 Figure 5 Respective microbial classification at the phylum, family and genus level. A: phylum level; B: family level; C: genus level. |
| 图选项 |
在科水平上(图 5-B)，占优势的菌群是腐螺旋菌科(Saprospiraceae)、A0839和Microscillaceae，分别占12.48%、5.85%和4.09%。此外，嗜甲基菌科(Methylophilaceae)、甲基球菌科(Methylococaceae)和甲基囊孢菌科(Methylocystaceae)的相对丰度分别为3.86%、1.99%和1.9%，甲基球菌科和甲基囊孢菌科均属于好氧甲烷氧化菌，具有氧化甲烷的能力[20-21]，同时嗜甲基菌科能以甲醇等为生长基质，是一种甲基营养菌[22]。
在属水平上(图 5-C)相对丰度较高的为norank-f＿Saprospiraceae(12.31%)、norank-f＿A0839(5.85%)和Flavobacterium(3.76%)。系统中检测出的甲烷氧化菌属分别为Methylosarcina(1.84%)、Methylovulum(0.01%)[21]和Crenothrix(0.14%)[23]，属于兼性甲烷氧化菌属的为Methylocystis(1.9%)，其中，Methylosarcina、Methylovulum和Crenothrix属于甲基球菌科，而Methylocystis属于甲基囊孢菌科，而属于嗜甲基菌科的微生物为Methylophilus (1.9%)。Chen等[24]研究发现Methylosarcina和Methylocystis属好氧甲烷氧化菌都在甲烷氧化过程中起重要作用。此外，系统中检测出的硝化菌属为Nitrospira(0.42%)，亚硝化菌属为Nitrosomonas(0.008%)，而反硝化菌属占优势的分别为Hyphomicrobium (1.19%)和Pseudomonas(0.61%)，系统中还存在其他丰度较小的反硝化菌属，如Bacillus(0.13%)和Rhizobium(0.008%)。Rorbertson等[25]最早研究发现反硝化菌能在好氧条件下进行生物脱氮，同时Lukow等[26]提出，已报道的好氧反硝化菌包括Hyphomicrobium、Pseudomonas、Bacillus和Rhizobium等。
2.2 AME-D极限脱氮系统的应用研究
2.2.1 贵阳某污水处理厂生化池出水处理效果: 采集贵阳某污水处理厂二级出水进行实验，系统的参数控制条件为温度30 ℃，甲烷浓度3%。进水中氨氮为0.7 mg/L、总氮为9 mg/L，通过AME-D极限脱氮系统处理后，出水中总氮和氨氮平均浓度为0.96 mg/L和0.38 mg/L，出水DO为6.02 mg/L，出水COD为甲烷平均消耗量为0.3%，出水总氮、氨氮和硝酸盐氮平均去除率分别为89.28%、45.71%和93.25%，说明该系统对贵阳某污水处理厂生化池出水具有极限脱氮效果。
2.2.2 拉曼光谱分析: 采集实验配水进出水和实际污水进出水进行拉曼光谱分析，其图谱如图 6所示，拉曼光谱图解如表 1所示，通过比对图谱可知，实验配水经过处理后，波数为716.21 cm-1、1010.53 cm-1、1050.55 cm-1、1346.65 cm-1和1360.88 cm-1的峰明显消失，分别由烯烃(顺式)CH面外弯曲、亚硫酸酯R1O-SO-OR2的O-S-O反对称伸缩、NO3-对称伸缩、芳香胺的C-N伸缩和芳香族NO2对称伸缩引起，说明系统对硝酸盐氮和亚硝酸盐氮有较高的去除能力，Kauffmann等[27]测定硝酸盐溶液的拉曼光谱，在1047 cm-1波长处得到特定NO3-的阴离子。同时系统中的芳香族化合物也被去除，此外，实验出水中明显出现的峰分别为983.86 cm-1和465.46 cm-1，是由烯烃CH2扭曲和PO43-的PO4对称变角引起。实际污水经过处理后，波数为413.89 cm-1、619.29 cm-1、669.97 cm-1、1052.33 cm-1、1136.80 cm-1、3407.80 cm-1和3497.61 cm-1的峰明显消失，分别由PO43-的PO4对称变角、PO43-的PO4不对称变角、醇COH面外弯曲、NO3-对称伸缩、仲胺R1-NH-R2的C－N伸缩、芳香族仲胺NH伸缩和膦酸ArP(O)(OH)2的O-H伸缩引起，说明系统对硝酸盐氮有较高的去除能力，同时系统中的芳香族化合物、醇类物质也被去除，此外，实际出水中出现的峰为1087.80 cm-1，是由醇类C-OH伸缩引起，进一步说明甲烷被氧化形成的中间产物可能为醇类或醛类物质。李震等[28]检测了10 g/L的NaNO2溶液的拉曼光谱，发现在1335 cm-1附近貌似有NO2-的拉曼特征峰。由图 6和表 1可知，实际污水中存在磷酸盐类物质、醇类或醛类物质和芳香族化合物等，而实验配水中存在芳香族化合物和亚硝酸盐氮等，两种实验进水存在相同的物质均由亚硫酸酯R1O-SO-OR2的O-S-O反对称伸缩和NO3-对称伸缩引起的，即实验配水(1010.53 cm-1和1050.55 cm-1)和实际污水(1009.64 cm-1和1052.33 cm-1)。
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| 图 6 系统进出水拉曼光谱图 Figure 6 The Raman spectrum of the inflow and effluent in the methanotrophic system. |
| 图选项 |
表 1. 拉曼光谱图解析 Table 1. Results of Raman spectroscopic analysis
| Absorption peak wave number/(cm-1) | Group vibration |
| 413.89, 465.46, 619.29 | The symmetric Angle of PO4 of PO43- and the asymmetric Angle of PO4 of PO43- |
| 669.97, 716.21 | Alcohol COH surface bending and alkene (cis) CH surface bending |
| 983.86 | Olefin CH2 distortion |
| 1008.62, 1008.76, 1009.64, 1010.12 | Sulfite R1O-SO-OR2 O-S-O antisymmetric expansion |
| 1050.55, 1052.33, 1087.80 | NO3- symmetric contraction and alcohol C-OH contraction |
| 1136.80 | The C-N expansion of the secondary amine R1-NH-R2 |
| 1346.65, 1360.88 | The C-N expansion of aromatic amines and the symmetric expansion of aromatic NO2 groups |
| 3407.80 | The aromatic secondary amines NH stretch |
| 3497.61 | O-H expansion of phosphonic ArP(O)(OH)2 |
表选项
3 结论 (1) AME-D极限脱氮系统在甲烷进气比为3%、温度为30 ℃、氮浓度为20 mg/L时脱氮效果最好，系统的总氮、氨氮和硝酸盐氮平均去除率分别为93.66%、96.13%和92.25%，此外，该系统在20-30 ℃均能实现极限脱氮。
(2) 16S rRNA基因测序分析结果显示系统中的甲烷氧化菌分别为Methylosarcina(1.84%)、Methylovulum(0.01%)和Crenothrix(0.14%)，以及兼性甲烷氧化菌属Methylocystis(1.9%)，硝化菌属主要为Nitrospira(0.42%)，亚硝化菌属主要为Nitrosomonas(0.008%)，而反硝化菌属主要为Hyphomicrobium(1.19%)和Pseudomonas(0.61%)，AME-D极限脱氮是由好氧甲烷氧化菌、反硝化菌、硝化菌和亚硝化菌协同实现。
(3) 采用该AME-D极限脱氮系统处理贵阳某污水处理厂尾水时，出水总氮和氨氮平均浓度达到0.96 mg/L和0.38 mg/L，能达到极限脱氮的目的，拉曼光谱分析显示1052.33 cm-1、1050.55 cm-1和1360.88 cm-1的峰明显消失，系统对硝酸盐氮和亚硝酸盐氮有较高的去除，同时出水中明显出现的峰分别为1087.80 cm-1，甲烷被氧化形成的中间产物可能为醇类或醛类物质。
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