李颖颖1,2, 谢媚1,2, 程子骞3, 李卓波1,2, 罗鹏1
1. 中国科学院南海海洋研究所, 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东省应用海洋生物学重点实验室, 广东 广州 510301;
2. 中国科学院大学, 北京 101408;
3. 河北农业大学海洋学院, 河北 沧州 060010
收稿日期：2019-07-23；修回日期：2019-08-23；网络出版日期：2019-10-17
基金项目：国家自然科学基金（31370149）；广东省渔业科技攻关项目（A201701B03）
*通信作者：罗鹏. E-mail:luopengli@163.com.
摘要：[目的] 从副溶血弧菌TF2基因组框架序列中拼接获得整合性接合元件（ICE）ICEVpaTF2的全序列，分析其基因组学特征；研究ICEVpaTF2是否具有从基因组中剪切、环化活性以及剪切、环化时attB和attP位点如何形成。[方法] 对副溶血弧菌TF2基因组框架序列进行RAST注释，发现其基因组中可能存在一个完整的ICE元件，命名为ICEVpaTF2，经过人工拼接和PCR扩增测序验证，得到完整的ICEVpaTF2序列，并对ICEVpaTF2再次进行RAST注释和ICE元件部分特征分析。通过PCR检测，探索ICEVpaTF2是否能够从基因组剪切并环化。通过attL、attR、attB、attP位点序列比较，探索attB和attP重组特征。[结果] ICEVpaTF2全长83588 bp，包含SXT/R391家族ICE元件的52个保守核心基因，它们与ICE切除、整合、自我转移和调节机制相关。ICEVpaTF2也包含5个外源基因插入的热点区（HS）、2个可变区（VR）以及3个非典型插入位点。HS和VR包含了大量可变基因，它们负责编码限制性修饰系统、DNA修复系统或毒素-抗毒素系统等，赋予宿主广泛适应性功能，ICEVpaTF2也包含独特未知功能基因。通过对int、xis二个核心保守基因种系发生分析，发现ICEVpaTF2的int、xis分别属于以R391和SXT为代表的亚群。ICEVpaTF2在attL和attR处发生剪切并完成环化，新形成杂合重组的attB和attP位点。[结论] ICEVpaTF2属于SXT/R391家族，是一个具备自我剪切和环化能力的完整ICE元件，剪切后新形成的attB和attP位点由attL、attR杂合重组形成。
关键词：副溶血弧菌SXT/R391元件ICEVpaTF2生物信息学特征剪切和环化
Bioinformatics characteristics and excision/cyclization activities of an ICE element, ICEVpaTF2, in Vibrio parahaemolyticus TF2
Yingying Li1,2, Mei Xie1,2, Ziqian Cheng3, Zhuobo Li1,2, Peng Luo1
1. CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology(LMB), Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Marine Biology(LAMB), South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, Guangdong Province, China;
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 101408, China;
3. Marine College, Agricultural University of Hebei, Cangzhou 060010, Hebei Province, China
Received: 23 July 2019; Revised: 23 August 2019; Published online: 17 October 2019
*Corresponding author: Luo Peng, E-mail:luopengli@163.com.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31370149) and by the Program of Fishery Problem Tackling of Guangdong Province (A201701B03)
Abstract: [Objective] To obtain complete sequence of an integrating conjugative element (ICE), ICEVpaTF2, from Vibrio parahaemolyticus TF2, and analyze its genomic characteristics; to investigate if ICEVpaTF2 has excision/cyclization activities from host genome and how att sites recombine during excision/cyclization. [Methods] The genomic frame sequences of V. parahaemolyticus TF2 was first annotated by RAST, which led to the finding of a potential and complete ICE element, named ICEVpaTF2. After manual splicing, PCR amplification followed by sequencing verification, a complete sequence of ICEVpaTF2 was obtained, and then it was annotated and characterized again. PCR detection and subsequent sequencing were performed to explore whether ICEVpaTF2 could excise from its host genome and cyclize itself and to characterize the forming of attB and attP by comparing the sequences of attL, attR, attB and attP. [Results] ICEVpaTF2, with a total length of 83588 bp, contains 52 conserved core genes of SXT/R391 ICE elements, which are related to excision, integration, self-transfer, and regulatory mechanisms. ICEVpaTF2 also contains five hot spots (HS), two variable regions (VR), and three atypical insertion sites accommodating variable genes. HS and VR contain a large number of variable genes, encoding for restrictive modification system, DNA repair system, toxin-antitoxin system, and etc., which confer the host extensive adaptive profits to the bacterial host. ICEVpaTF2 also contains unique genes with unknown functions. Through phylogenetic analysis of the two core conserved genes, int and xis, it was found that int and xis of ICEVpaTF2 belong to subgroups represented by that of R391 and SXT, respectively. ICEVpaTF2 excises at chromosomal attL and attR sites and cyclizes resulting in the forming of new heterozygous and recombined attB and attP sites. [Conclusion] ICEVpaTF2 belongs to the SXT/R391 family and it is a complete ICE element harboring self-excision and cyclization activities. New attB and attP sites are generated by hybrid recombination between primary attL and attR sites.
Keywords: Vibrio parahaemolyticusSXT/R391 elementsICEVpaTF2bioinformatics characteristicsexcision/cyclization
整合接合元件(integrating conjugative elements，ICEs)是一类可自我转移的遗传元件，它们既能像前噬菌体一样特异性整合入宿主染色体的特定位点，又能像接合质粒一样通过宿主与受体菌接合形成的通道实现细菌间的接合转移[1]。ICE水平转移对细菌的广泛环境适应性以及细菌的遗传多样性和基因组进化均产生重要影响[2-4]。ICE包含一系列保守基因组成的核心区以及位于核心区间的插入热点区(HS)和可变区(VR)，位于HS和VR的基因赋予ICE独特的功能[5]。
SXT/R391家族是迄今为止发现最早、数量最多、研究最为深入的一类ICE[6-7]。SXT/R391家族编码高度保守的整合酶Int，Int是一种酪氨酸重组酶，介导SXT/R391元件的attP位点与宿主prfC基因(编码肽链释放因子3的保守染色体基因)内近5′端的位点(attB)处发生特异性整合，被认为是SXT/R391元件的一个决定性特征，整合后的线性化SXT/R391两端分别形成一个新的高度相似的attL和attR位点[2, 6]。在重组相关因子Xis的辅助下，Int识别整合SXT/R391元件的最左端的attL位点和最右端的attR位点，并介导重组，使整个元件从染色体上切除，切除的元件环化形成新的attP位点，同时染色体上剪切处也重组形成新的attB位点[5-7]。被切除的环化SXT/R391是共轭转移的主要底物，当受体菌具有与其attP位点相似的attB’位点，SXT/R391就可能自主转移整合到受体菌相应的attB’位点，从而实现SXT/R391水平转移[3, 5, 7]。
SXT/R391家族的典型代表SXT元件最初发现于O139型霍乱弧菌中[8]。后来发现1972年分离于南非的雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)携带一种与STX密切相关的可自主转移的遗传元件，命名为R391[9]。此后，SXT/R391元件被发现广泛存在于亚洲和非洲地区临床和环境分离的霍乱弧菌和其他弧菌属细菌中[10]。此外，SXT/R391元件也存在于美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、腐败斯瓦尼菌(Shewanella putrefaciens)和奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的分离株中[10]。在人工实验条件下，发现原存在于弧菌中的SXT/R391元件能以极高的频率转移至大肠杆菌中[11-12]，表明SXT/R391元件具备在遗传关系遥远的细菌群体间转移的巨大潜力，因此具有进一步扩大分布群体范围的可能。
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)普遍存在于海洋和河口环境，是三大对人类健康具有重大威胁的弧菌之一[13]，副溶血弧菌同时也是海水养殖动物的重要致病菌，可造成巨大的经济损失[14-15]。迄今为止，未有在副溶血弧菌中发现SXT/R391元件的报道，本研究从一株对虾致病菌——副溶血弧菌TF2的框架基因组序列中获得了一个完整的ICE元件ICEVpaTF2，从比较基因组学角度对此元件的基因组学特征进行了分析，对其剪切、环境化活性进行了检测，此外分析了att位点的重组特征。
1 材料和方法 1.1 菌株来源和全基因组测序 副溶血弧菌TF2分离于广东湛江养殖的患病凡纳滨对虾肝胰腺，并保存于本实验室。首先对副溶血弧菌TF2提取的基因组进行机械剪切，剪切后的DNA进行末端补平，再通过3′端加碱基A，使得DNA片段能与3′端带有T碱基的接头连接，用电泳回收目的片段(400–500 bp)连接产物，再使用PCR扩增两端带有接头的DNA片段，最后用检验合格的文库进行Illumina Miseq(美吉生物，上海)上机测序。
1.2 副溶血弧菌TF2的基因组注释和ICE拼接 采用线上注释工具Rapid Annotations using Subsystem Technology(RAST)[16]对91个框架序列进行注释并进行注释结果分析，找出包含SXT/R391元件的片段的Scaffold11和Scaffold7序列。以Scaffold11末端序列(300 bp)进行BLAST搜索发现高度相似的DNA序列(GenBank No: MH160822)，以MH160822与Scaffold11末端序列高度匹配部分的侧翼序列(30 bp)为质询序列在Scaffold系列中搜索到包含Scaffold7侧翼未知序列的Scaffold50。进一步对Scaffold11 (5′末端包含attL序列)、Scaffold50、Scaffold7 (3′末端包含attR序列)进行了人工拼接，得到一个完整的ICE序列，该ICE命名为ICEVpaTF2。设计跨3个Scaffold连接区的引物(表 1)。ICEVpaTF2-F2/R2和ICEVpaTF2-F3/R3二对引物分别锚定3个Scaffold连接处的上下游，进行PCR扩增和测序以验证拼接结果。获得完整ICEVpaTF2后再次以RAST对其基因注释。
表 1. 引物和引物扩增的DNA区域 Table 1. Primers used for the amplification of different DNA regions in this study
| Primer name | Nucleotide sequence (5′→3′) | PCR amplification for |
| ICEVpaTF2-F2 | AAGTTGAGTAACGGCAAGAGC | Gap between Scaffold 11 and Scaffold 50 |
| ICEVpaTF2-R2 | TATCTAGGATGACGGGCTTTG | |
| ICEVpaTF2-F3 | CAACAAGAAGCTGCCAACACC | Gap between Scaffold 50 and Scaffold 7 |
| ICEVpaTF2-R3 | CGATGGTATCAATGTGGTGC | |
| attL-F1 | AGCGCGTGGCTAGAAGTAAG | attL, attR, attB, and attP sites when using different primer combinations |
| attL-R1 | ACACCGCCAGACTCGATTC | |
| attR-F4 | ACAATACCCTGCAATACCGATC | |
| attR-R4 | TACTTCCATTGGATCACGAACG |
表选项
1.3 ICEVpaTF2的基因组学分析 以SXT序列(GenBank No: AY055428)以及ICEValE0601序列(GenBank No: KT072768)为参考，对ICEVpaTF2中的保守基因进行识别，对ICEVpaTF2中部分假想基因进行了保守结构域查找(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi)，以补充完善基因的功能。通过Blast搜索与ICEVpaTF2全长最为相似的ICE序列。以MEGA 6.0对ICE整合和剪切的关键保守基因int和xis进行系统进化树构建和种系发生分析，高度相似的序列来源于BLAST搜索并随机选取。
1.4 ICEVpaTF2的剪切和环化活性检测 在ICEVpaTF2元件的起点(attL)两端和终点(attR)两端设计引物attL-F1、attL-R1、attL-F2、attL-R2，引物间进行不同的组合(表 1)，进行PCR扩增，借以检测ICEVpaTF2是否存在整合、剪切环化的形式。
2 结果和分析 2.1 ICE的组装 以副溶血弧菌TF2基因组DNA为模板，以ICEVpaTF2-F2/R2、ICEVpaTF2-F3/R3引物对分别进行PCR扩增均得到预期大小的PCR片段，PCR产物递交测序，测序结果表明对Scaffold11、Scaffold50、Scaffold7的拼接完全正确，因此得到一个完整的ICEVpaTF2序列(GenBank No：MN201567)。
2.2 ICEVpaTF2的一般结构 经生物信息学预测和分析，ICEVpaTF2全长为83588 bp，包含78个蛋白编码基因，由52个保守核心基因形成的骨架和26个可变基因组成。可变基因所在区域总长约34.5 kb，占ICE元件全长的41.3%。ICE主要存在5个外源DNA频繁插入的区域，称为热点区域HS1–HS5[17]；此外，在一些ICE中包含另外的可变区域，命名为VRⅠ–VRⅣ[17]。ICEVpaTF2中可变基因主要分布在5个HS、可变区VRⅠ和VRⅢ之间(图 1)，VR Ⅱ和VR Ⅳ没有基因插入。此外，有3个单基因分别出现在HS和VR以外的插入位点(图 1)。最大的可变区域插入片段位于HS5区，长度达到15.5 kb，该区包括7个编码基因。最小的可变区域HS4仅有一个基因插入。
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| 图 1 SXT/R391家族52个核心基因示意图以及副溶血弧菌TF2的ICEVpaTF2与V. owensii V180403的ICEVowV18的结构比较 Figure 1 Schematic representation of 52 conserved core genes of SXT/R391 family and structural comparison between ICEVpaTF2 of V. parahaemolyticus TF2 and ICEVowV18 of V. owensii V180403. The thick arrows represent 52 core genes of SXT/R391 elements. The length of the arrows corresponds to the length of core genes of ICEVpaTF2. The short vertical lines at both sides of SXT/R391 elements represent the start (attL) and the end (attR) of them. The white thick arrows represent conserved genes with unknown functions. The purple thick arrows represent the genes closely related to prophage that are responsible for the integration, the excision, and the recombination of SXT/R391 ICEs. The green thick arrows represent the genes closely related to conjugative plasmids that are responsible for conjugation transfer of SXT/R391 ICEs. The upward vertical arrows indicate the insertion positions of the variable regions. The downward vertical arrows indicate three unusual insertion sites for variable gene. The red arrows indicate the specific genes in ICEVpaTF2 when compared to ICEVowV18, the yellow arrows indicate the specific genes in ICEVowV18, and the blue arrows indicate common genes of two ICEs in variable regions. |
| 图选项 |
2.3 ICEVpaTF2核心保守基因 与其他SXT/R391元件相似，ICEVpaTF2也注释到3个保守功能模块C1-C3(图 1)，其中C1内的保守基因为int和xis，负责ICE整合和切除[17]；C2内的保守基因主要是一系列tra基因，主要负责单链DNA运输、DNA加工以及DNA输出的交配孔道形成等[18-19]；C3区的保守基因setCD和setR负责整个ICE整合、切除和转移活性的调控[20]。C1–C3保守基因的排列顺序与SXT/R391家族元件完全相同。在预测到的ICEVpaTF2的52个保守核心基因中，有32个已经获知功能注释(图 1中标注基因名称)，但是仍然有20个保守基因功能未知(图 1中白色粗箭头，未标注基因名称)。
分别以C1保守模块内int和xis两个基因预测的核苷酸序列构建系统进化树(图 2-A和图 2-B)，结果发现二者具有明显不同的拓扑学构型。基于int的种系进化树中，来源于不同ICE的int基因明显分为2个分支，ICEVpaTF2的int基因处在以R391为代表的分支上；基于xis的种系进化树中，来源于不同ICE的xis基因也明显分为2个分支，但ICEVpaTF2的xis基因处在以SXT为代表的分支上。在采用相同比例的标尺(Bar)上，xis分枝的平均长度大于int分枝的平均长度，表明同处C1保守模块的int、xis虽然功能密切相关，位置紧邻，但可能具有明显不同的进化速率。
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| 图 2 ICEVpaTF2和随机选取的SXT/R391元件int基因(A)和xis基因(B)系统发育树 Figure 2 Phylogenetic trees of int (A) and xis (B) genes from ICEVpaTF2 and some randomly selected SXT/R391 ICEs. The trees were constructed using the neighbor-joining method. Bootstrap values were obtained after 1000 repetitions. |
| 图选项 |
2.4 ICEVpaTF2可变基因 对ICEVpaTF2的可变基因区域进行生物信息学分析，发现HS1包含higA和higB基因，它们编码一个毒素-抗毒素系统(TAS)。此外，ICEVpaTF2可变区域VRⅠ插入了hipA和hipB基因，它们也编码1个TAS。TAS广泛存在于ICE中，推测它们通过杀死失去该元件的细胞来维持ICE在宿主基因组的存在[21]。HS2区包含7个功能不完全明确基因orf16–orf22 (表 2)，推测它们与乙酰基转移、磷脂合成和能量供应有关，可能参与调节生物膜的形成、细菌运动和生物体的毒力[22]。HS3由2个假想基因组成，HS4由一个假想基因构成，这些假想基因在GenBank中缺少同源基因，因此功能无法预测。HS5包含7个基因，编码多个功能各异的蛋白，包括：XRE家族转录调节因子XreB、Ⅰ型限制修饰系统中的甲基转移酶M亚基HsdM、S亚基HsdS、蛋白激酶PknB，以及3个功能未知的假想蛋白。VR Ⅲ插入了2个不同的Tn3家族转座酶基因tra1、tra2，破坏了rumB基因。rumB基因常因外源携带抗生素抗性基因的转座子插入而打断成2个基因rumB’和rum‘B[23-24]，但是在ICEVpaTF2的rumB’和rum‘B之间未发现抗性基因，推测转座子的插入与插入位点基因的失活或者激活有关[24]。此外，在ICEVpaTF2中还注释到位于3个非常规插入位点的单基因orf3、orf6、orf23，编码的假想蛋白长度不超过116个氨基酸，其功能大部分完全未知，小的假想基因大量存在于细菌基因组中，其生物学意义不明。
表 2. ICEVpaTF2可变区域中的基因及功能预测 Table 2. Genes and functions prediction of variable genes in ICEVpaTF2
| ORF | Gene | Functions of genes | Start | Stop | Length/aa |
| orf1 | hipB1 | XRE family transcriptional regulator | 809 | 1129 | 321 |
| orf2 | hipA2 | Type II toxin-antitoxin system toxin | 1122 | 2336 | 1215 |
| orf3 | \ | Hypothetical protein | 5349 | 5516 | 168 |
| orf4 | tra1 | Tn3 family transposase | 7628 | 8221 | 594 |
| orf5 | tra2 | Tn3 family transposase | 8335 | 9948 | 1614 |
| orf6 | \ | Hypothetical protein | 11019 | 11273 | 255 |
| orf7 | xreB | XRE family transcriptional regulator | 14338 | 14565 | 228 |
| orf8 | hsdM | Type I RM system methyltransferase subunit M | 14565 | 16619 | 2055 |
| orf9 | \ | Hypothetical protein | 16616 | 16828 | 213 |
| orf10 | hsdS | Type I RM system methyltransferase subunit S | 16825 | 18240 | 1416 |
| orf11 | pknB | Protein kinase | 18250 | 22383 | 4134 |
| orf12 | \ | Hypothetical protein | 22380 | 24026 | 1647 |
| orf13 | \ | Hypothetical protein | 24023 | 29497 | 5475 |
| orf14 | higA | Helix-turn-helix domain-containing antitoxin | 34898 | 35176 | 279 |
| orf15 | higB | Type II toxin-antitoxin system toxin | 35173 | 35496 | 324 |
| orf16 | \ | GNAT family N-acetyltransferase | 39824 | 40330 | 507 |
| orf17 | \ | DUF1778 domain-containing protein | 40321 | 40587 | 267 |
| orf18 | \ | Hypothetical protein | 41147 | 41266 | 120 |
| orf19 | \ | AAA family ATPase | 41403 | 44132 | 2730 |
| orf20 | \ | Hypothetical protein | 44129 | 45238 | 1110 |
| orf21 | \ | Phospholipid synthase family protein | 45251 | 46783 | 1533 |
| orf22 | \ | FIS family transcriptional regulator | 46786 | 48231 | 1446 |
| orf23 | \ | Conjugative transfer protein 345 | 51460 | 51807 | 348 |
| orf24 | \ | Hypothetical protein | 58299 | 59072 | 774 |
| orf25 | \ | Hypothetical protein | 71317 | 71517 | 201 |
| orf26 | \ | Hypothetical protein | 71579 | 72679 | 1101 |
表选项
2.5 ICEVpaTF2与Vibrio owensii V180403的ICE基因组比较 以获得的完整ICEVpaTF2元件为质询序列，通过NCBI的Blast搜索，发现GenBank中与ICEVpaTF2最为相似的ICE来自于弧菌V. owensii V180403 (GenBank No：CP033144)，命名为ICEVowV18。在78%的覆盖度范围内ICEVpaTF2与ICEVowV18整体具有高达98%的相似性。ICEVpaTF2与ICEVowV18的HS1、HS2、VRⅠ区的可变基因显示高度的同源相似性，此外3个非常规插入位点的3个单独基因也同样匹配到高度的同源相似性(图 1，蓝色箭头)。ICEVpaTF2与ICEVowV18具有高度的整体序列相似性，由高度相似的结构和基因组成，表明2个ICE很可能来自于共同的祖先。但二者也存在一些明显区别：ICEVowV18中注释到三套TAS；ICEVowV18的VRⅢ区是最大的可变区域，主要包含2个Tn3家族转座酶基因tra1和tra3，2个IS91家族转座酶基因tra4和tra5，1个四环素抗性基因tetR，2个链霉素抗性基因strA、strB，和1个磺胺类抗生素抗性基因sul2。目前GenBank中已经发布1327株副溶血弧菌全基因组序列(包括基因组草图)，以ICEVpaTF2为质询序列，在测序菌株中仅发现5株副溶血弧菌存在与ICEVpaTF2相似的未鉴定ICE，5株菌中有2株分离自对虾，1株来源于环境，另外2株来源未知。其中与ICEVpaTF2最相似的一个未鉴定ICE位于副溶血弧菌菌株Vb0624中(CP041202.1)，它与ICEVpaTF2相比，在62%的覆盖范围内具有97%的一致度，5个未鉴定副溶血弧菌株的ICE彼此间并不相同。
2.6 ICEVpaTF2的剪切、环化活性 PCR检测结果表明，采用attL-F1/attL-R1、attR-F4/attR-R4、attR-F4/attL-R1、attL-F1/attR-R4引物组合均能扩增出预期大小的条带(图 3)，4条引物的锚定位点见图 4。这一结果表明，副溶血弧菌TF2细胞群体中，部分细胞中的ICEVpaTF2处于整合于宿主基因组的状态，部分细胞中ICEVpaTF2处于剪切、环化状态(图 4)。结合ICEVpaTF2具有完整的结构和功能基因，表明ICEVpaTF2是一个有剪切、环化活性的完整ICE，因此也具有潜在的转移活性。
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| 图 3 锚定attL和attR位点上下游区域的引物不同组合PCR扩增结果 Figure 3 The PCR results based on different combinations of primers anchoring upstream and downstream regions of attL and attR sites. M: DNA marker DL2000; 1: attL-F1/attL-R1; 2: attR-F4/ attR-R4; 3: attR-F4/attL-R1; 4: attL-F1/ attR-R4. |
| 图选项 |
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| 图 4 推测的ICEVpaTF2剪切、环化时att位点形成示意图 Figure 4 Speculated schematic diagram of the att-sites forming during the excision/cyclization of ICEVpaTF2 |
| 图选项 |
进一步比较了ICEVpaTF2处于整合状态的attL和attR序列，发现attL和attR长度为20 bp，二者并非完全相同，二者在第3、6、9、15位点存在碱基差异。ICEVpaTF2发生剪切后，染色体attB位点呈现attL和attR的杂合重组，即attB位点由attL的5′端和attR的3′端组成(图 4)，通过测序峰图发现，attB第9个碱基具有2个同等大小的峰，因此第9碱基不确定，可能为T或C(图 5-A)。同样环化后的ICEVpaTF2产生的attP位点也呈现attL和attR的杂合重组，即attP位点由attR的5′端和attL的3′端组成(图 4)，通过测序峰图发现，attP第9碱基同样具有2个同等大小的峰，因此第9碱基不确定，可能为C或T(图 5)。
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| 图 5 attB位点测序峰图(A)和attP位点测序峰图(B) Figure 5 Sequencing peaks of attB (A) and attP (B). Four colors of peaks represent four different bases. Both attB and attP have two overlapping peaks at ninth base sites, which represent base T or C |
| 图选项 |
3 讨论 此前尽管在弧菌中发现了大量SXT/R391元件存在，但是并未有在副溶血弧菌中发现SXT/R391元件的明确报道，我们以ICEVpaTF2为质询序列，通过Blast搜索发现有5个副溶血弧菌菌株存在与ICEVpaTF2相似的未鉴定ICE序列，因此表明本研究中发现的副溶血弧菌菌株TF2存在ICE元件并非是孤立事件，这5个GenBank中发现的未鉴定的ICE元件彼此并非不相同，表明副溶血弧菌也存在多样化的ICE元件。ICEVpaTF2内大量基因编码功能各异蛋白，包括限制性修饰系统、DNA修复系统、毒素-抗毒素系统等，它们赋予宿主对环境多样化的适应功能，同时对副溶血弧菌的遗传多样性产生重要影响。大多数ICE元件可变基因编码对多种抗生素的耐药性基因[11, 25]，虽然ICEVpaTF2中未发现抗性基因，但是根据其结构预测，至少在rumB基因内部具有捕获和容纳携带抗性基因转座子的潜力。
SXT/R391元件集中出现在非洲和亚洲沿海地区，且来源多为海洋细菌[10]，表明海洋环境很可能是SXT/R391主要的贮藏库，并且经由海洋环境株向临床株扩散[10, 23, 26]。对int的研究表明，一些诱发细菌DNA损伤的因素，如抗生素、丝裂霉素C、紫外线等可以使SXT/R391的转移频率增加10–100倍以上[1, 11, 25, 27]，因此有理由相信某些化学污染物或抗生素的滥用极有可能加剧SXT/R391的扩散。
多数情况下处于C1模板的int和xis紧密相连，功能上密切相关，int负责SXT/R391的整合和剪切，xis负责剪切[1]。一般而言，同一个ICE元件内的int如果归属SXT亚群，其xis也会归属SXT亚群，反之二者同属于R391亚群(图 2)，但本文中的ICEVpaTF2中的int与xis分属于SXT和R391亚群(图 2)，这一现象揭示同一模块内功能密切相关的基因也可能发生同源重组，因此很可能在ICEVpaTF2的进化史中，它可能曾与R391源的ICE处于同一个祖先细菌细胞中，导致了因同源重组而产生的杂合。2001年，Hochhut等[28]发现R391与SXT可以同时转移到大肠杆菌中形成串联R391、SXT排列，并且二者之间因为高度的同源，发生了重组，产生了杂合体。因此，这一研究加深我们的推测。基于int和xis种系进化分析还发现相比int基因，xis具有更快的进化速率，这说明二者可能承受着不同的进化压力，侧面反映出int相比xis具有更为重要的功能。
SXT/R391元件中，HS1–HS5以及可变区VR I–VR IV是最为常见的容纳外源DNA片段区域，本研究中ICEVpaTF2和最为相似的ICEVowV18均产生3个独立的非典型小插入位点。此前我们对溶藻弧菌多个SXT/R391元件的研究中发现在ICEVpaTF2和ICEVowV18同样的位置具有非典型小插入位点[23]，因此这些发现丰富了我们对SXT/R391元件遗传结构的认识。
在正常非压力诱导环境下，大多数细胞中SXT/R391处于整合状态，只有极少部分细胞中ICE处于剪切状态[6, 29]，本文中我们发现副溶血弧菌ICEVpaTF2的SXT/R391元件在细菌细胞群体中以整合和剪切环化两种形式存在，再一次证实了这一发现。此前关于SXT/R391元件遗传结构的研究中，并未对att位点序列以及其整合、剪切中的分配进行过分析。本研究发现ICEVpaTF2中attL的5′端和attR的3′端重组成新的attB位点，attR的5′端和attL的3′端重组成剪切后环化ICE的attP位点。然而，并不知道具体在attL和attR的哪一个位点开始剪切，测序峰图发现attB或attP的正链第9位碱基具有T和C二种可能，且两个峰几乎是重合的(图 5)，表明该位点出现碱基C或T的机率可能相同。因此我们推测attL和attR很可能在正链的第8和第9碱基间以及负链的第9和第10碱基间产生缺口，在位点特异性整合酶Int的作用下可能发生链交换式重组(图 4)，由于attL和attR正链第9位碱基分别为C和T，导致重组时新产生的attB或attP的二条链在第9位碱基不配对，必然产生修复以配对，理论上这种错配修复随机，结果attB或attP正链该位点具有C和T可能性的机会是均等的，导致测序时该位点产生C和T近乎相同的峰值。这是第一次探讨SXT/R391元件从基因组剪切时attB和attP的重组产生的机制。
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