徐心怡1, 张斌1
, 吴晓玉1, 江燕1, 陈雪岚2 1. 江西农业大学生物科学与工程学院, 江西省农业微生物资源开发利用工程实验室, 江西 南昌 330045;
2. 江西师范大学生命科学学院, 功能有机小分子教育部重点实验室, 江西 南昌 330022
收稿日期：2019-06-02；修回日期：2019-08-03；网络出版日期：2019-12-06
基金项目：江西农业大学博士科研启动基金；国家自然科学基金（31660019）
*通信作者：张斌, Tel/Fax:+86-791-83813459;E-mail:zhangbin2919@163.com.
摘要：L-鸟氨酸是一种非蛋白类氨基酸参与尿素代谢及生物多胺类的合成，其对人体具有治疗肝脏疾病、增强免疫力等作用，被广泛应用于医疗、保健、食品等领域。工业上生产鸟氨酸主要有化学法、酶法及工业发酵法。其中，发酵法因其生产成本及环境保护等方面的优势而逐渐成为研究的焦点。本文归纳了近年来采用基因工程技术选育鸟氨酸高产菌种最新研究进展，重点讨论了产鸟氨酸谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造策略，并对未来的研究方向进行了预测。
关键词：L-鸟氨酸代谢工程谷氨酸棒杆菌分子育种
Advances in metabolic engineering of L-ornithine producing strains
Xinyi Xu1, Bin Zhang1
, Xiaoyu Wu1, Yan Jiang1, Xuelan Chen2 1. Jiangxi Engineering Laboratory for the Development and Utilization of Agricultural Microbial Resources, College of Bioscience and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, Jiangxi Province, China;
2. Key Laboratory of Functional Small organic molecule, Ministry of Education, College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, Jiangxi Province, China
Received: 2 June 2019; Revised: 3 August 2019; Published online: 6 December 2019
*Corresponding author: Bin Zhang, Tel/Fax: +86-791-83813459; E-mail: zhangbin2919@163.com.
Foundation item: Supported by the Doctoral Research Foundation of Jiangxi Agricultural University and by the National Natural Science Foundation of China (31660019)
Abstract: L-ornithine is a non-protein amino acid involved in urea metabolism and polyamines biosynthesis. Due to the positive functions in treating liver diseases and enhancing immunity, L-ornithine is widely used in medicine and food industry. Currently, L-ornithine production mainly depends on chemosynthesis, enzymatic catalysis and microbial fermentation. Among them, microbial fermentation has gradually become the focus for L-ornithine production owing to its superiority in cost and environmental protection. In this article, recent progress in the development of high L-ornithine producing strains through genetic engineering is summarized, the metabolic engineering strategies for improving L-ornithine production in Corynebacterium glutamicum are discussed, and the future direction is predicted.
Keywords: L-ornithinemetabolic engineeringCorynebacterium glutamicummolecular breeding
1877年，杰费在鸟尿的水解液中分离得到一种特殊的氨基酸，随后将其命名为鸟氨酸。L-鸟氨酸是一种碱性氨基酸，含有2个氨基和1个羧基，化学名称为α，δ-二氨基戊酸，分子式为C5H12N2O5。研究发现，鸟氨酸是普遍存在于生物体内的一种非蛋白类氨基酸，作为尿素循环途径的一种中间代谢产物，也是合成精氨酸、瓜氨酸、胺类等重要代谢产物的前体物质，其由于对肝脏方面具有解毒作用而被广泛应用于医药健康领域[1-2]。
随着人们生活水平的提高，市场上对鸟氨酸的需求也在逐年增长，这也对鸟氨酸的生产提出了更高的要求。目前，用于生产鸟氨酸的方法主要有化学法、酶催化法和微生物发酵法。由于化学法合成鸟氨酸具有操作工艺复杂、环境污染等多种缺陷以及酶催化法合成鸟氨酸的高成本问题，科学家正逐渐将研究焦点转移到利用微生物发酵法生产鸟氨酸。目前，微生物发酵法已成功被应用于各种高附加值产品如有机酸[3]、氨基酸[4]、天然产物[5]等的合成研究。微生物发酵法可以利用廉价的原料，如葡萄糖、糖蜜、硫酸铵等经过高密度发酵，依靠细菌自身的代谢反应生成鸟氨酸，具有成本低、环境污染小、提高产量方面潜力大等优势。随着微生物分子育种方法的不断发展和微生物遗传操作系统的日益完善，越来越多的菌种被开发用于合成鸟氨酸。然而，尽管早在1961年人们就想到利用微生物发酵法合成鸟氨酸，但是微生物发酵法在鸟氨酸生产的应用较为有限，鸟氨酸发酵菌种的性能还有待提升[6-7]。
1 L-鸟氨酸的生物合成途径 想要获得性能优良的L-鸟氨酸发酵菌种，首先就需要了解其生物合成途径。微生物体内，L-鸟氨酸的生物合成途径主要有两条，如图 1所示。第一条是存在于大肠杆菌等微生物体内的线性合成途径。葡萄糖依次经历糖酵解途径、三羧酸循环途径转化为谷氨酸以后，谷氨酸再依次经历argA编码的N-乙酰谷氨酸合成酶、argB编码的N-乙酰谷氨酸激酶、argC编码的N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸还原酶、argD编码的N-乙酰鸟氨酸氨基转移酶、argE编码的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的催化最终生成鸟氨酸。此外，第二种是存在于棒杆菌、酵母菌、芽孢杆菌等微生物体内的经济循环途径。以谷氨酸棒杆菌为例，该菌体内，鸟氨酸合成代谢途径与大肠杆菌极为相似，均以谷氨酸为前体，经历多步酶促反应生成。然而，谷氨酸棒杆菌不存在argA，其第一步N-乙酰谷氨酸的合成是由argJ编码的双功能酶鸟氨酸乙酰基转移酶和cg3035编码的乙酰基转移酶共同催化完成的。其中，发挥主要功能的是鸟氨酸乙酰基转移酶，其不仅能催化N-乙酰鸟氨酸的去乙酰化生成鸟氨酸，又能将N-乙酰鸟氨酸水解下来的乙酰基转移至谷氨酸生成N-乙酰谷氨酸。此条代谢途径，乙酰基作为一个辅基被循环利用，因此也称为经济循环途径。在反馈调控方面，大肠杆菌argA编码的N-乙酰谷氨酸合成酶受到终产物精氨酸的反馈抑制，而谷氨酸棒杆菌体内精氨酸则是对argB编码的N-乙酰谷氨酸激酶具有反馈抑制作用(图 1)。大肠杆菌体内，催化鸟氨酸合成的相关基因分散排列于基因组，而在谷氨酸棒杆菌基因组内argCJBDFR以操纵子的形式排列并受到负调控蛋白ArgR的反馈阻遏[8]。
 |
| 图 1 L-鸟氨酸生物合成途径 Figure 1 The metabolic pathway of L-ornithine. Glc: glucose; G6P: glucose-6-P; PEP: phosphoenolpyruvate; Qxa: oxaloacetate; Mal: malate; Fum: fumarate; Suc: succiate; Suc-CoA: succinyl-coA; Oxo: α-oxoglutarate; Iso: isocitrate; Cit: citrate; gdh: encodes glutamate dehydrogenase; cg3035/argA: encodes N-acetylglutamate synthase; argB: encodes N-acetylglutamate kinase; argC: encodes N-acetyl-gamma-glutamylphosphate reductase; argD: encodes acetylornithine aminotransferase; argE: encodes N-acetylornithine deacetylase; argF: encodes ornithine carbamoyltransferase; argJ: encodes ornithine acetyltransferase; argR: encodes arginine repressor. |
| 图选项 |
2 代谢工程改造谷氨酸棒杆菌产鸟氨酸 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum，简称C. glutamicum)被认定为一株非致病性的工业发酵菌种，被广泛应用于合成各种氨基酸[9]、工业化学品[10]、食品类产品等[11]，在合成鸟氨酸方面同样具有非常大的潜力。生物体内鸟氨酸的合成是以谷氨酸为前体，然后进一步依靠自身代谢途径完成的。因此，选择能产大量谷氨酸的谷氨酸棒杆菌为底盘细胞合成鸟氨酸，在前体供应方面具有较大的优势。传统选育高产鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌主要是依靠化学诱变法，同时结合类似物的筛选获得精氨酸营养缺陷型或瓜氨酸营养缺陷型菌种，再从这些菌种筛选具有积累鸟氨酸的能力的突变体。然而，利用化学诱变法筛选鸟氨酸高产菌种存在突变的随机性大、筛选工作繁琐以及易产生回复突变株等缺点，使得其在鸟氨酸高产谷氨酸棒杆菌的选育方面应用有限。为了规避化学诱变法的缺点，科学家们借助了快速发展的分子生物学技术，对谷氨酸棒杆菌进行理性的改造，使得产鸟氨酸工程菌的选育工作取得了长足的进步。近年来，已有许多研究报道了开发谷氨酸棒杆菌产鸟氨酸的案例，见表 1。
表 1. 目前被应用于合成鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌 Table 1. Comparison of C. glutamicum strains engineered for L-ornithine production
| Strains | L-ornithine production (g/L)/yield (g/g glucose) | Cultivation | Modulations | Reference |
| C. glutamicum SJC8514 (pEC-argCJBDmut) | 12.48/ND | Shake flask; Batch | Overexpression of NCgl0462 and argCJBD mut | [12] |
| C. glutamicum SO27 | 38.5/0.44 | Shake flask; Batch | Deletion of argF, ncgl1221, argR, putP, mscCG2 and iolR; attenuation of odhA, proB, ncgl2228, pta, cat, pgi; overexpression of lysE, gdh, cg3035, pfkA, tkt, argCJBD, glt, gdh2 | [6-7] |
| C. glutamicum YW06 (pSY223) | 51.5/0.240 | Fermenter；Fed-Batch | Deletion of argF, argR, proB; overexpression of pentose phosphate pathway and mutant N-acetylglutamate kinase | [13] |
| C. glutamicum ORN6 | 20.96*/0.524 | Shake flask; Batch | Deletion of argF, argR, argG; overexpression of argBM; attenuation of pgi | [14] |
| C. glutamicum SJC8039 ?NCgl0281?NCgl2582 ?NCgl2053 | 14*/ND | Shake flask; Batch | Deletion of argF, argR, proB; block the synthetic pathway of gluconate | [15] |
| C. glutamicum ?APE6937R42 | 24.1/0.298 | Fermenter; Batch | Deletion of argF, argR, proB; adaptive evolution | [16-17] |
| C. glutamicum 1006?argR-argJ | 31.6/0.396 | Shake flask; Batch | Deletion of argR; overexpression of argJ | [18] |
| *These values were not described in the main text of the original reference and thus estimated from the figure or graph. | ||||
表选项
2.1 阻断鸟氨酸分解代谢及竞争支路代谢提高鸟氨酸产量 鸟氨酸作为精氨酸代谢的一个中间产物，可以在argF编码的鸟氨酸氨甲酰基转移酶的作用下生成瓜氨酸，而瓜氨酸进一步代谢生成精氨酸，同时精氨酸和瓜氨酸积累又分别会对其合成途径argB编码的N-乙酰谷氨酸激酶和argJ编码的鸟氨酸乙酰基转移酶形成反馈抑制作用，从而抑制该通路的代谢流。因此，构建鸟氨酸高产菌种首先需要敲除argF，阻断鸟氨酸的分解代谢途径，获得精氨酸和瓜氨酸营养缺陷型菌种。当前通过理性设计代谢工程改造构建的鸟氨酸高产工程菌种均对argF进行了敲除，同时也不可避免地需要向发酵培养基投入精氨酸以维持菌体的正常生长，这显然不利于节约成本。本课题组借助常规的遗传操作方法，如更换核糖体结合位点、替换起始密码子以及添加转录终止子等，弱化argF的表达量，结果发现基于同源重组的方法在argF基因上游插入强转录终止子T4，可以有效抑制argF的转录，从而开发了一种基于添加转录终止子的代谢工程改造策略。应用此方法不仅可以降低argF的表达量以弱化鸟氨酸的分解代谢途径，同时还可以提高鸟氨酸合成基因簇argCJBD的表达量，最终获得一株鸟氨酸产量达到6.1 g/L的重组谷氨酸棒杆菌，与原始菌种相比其鸟氨酸产量提高了11倍，与argF敲除菌种相比鸟氨酸产量提高了42.8%[19]。此外，经过对代谢途径剖析发现，前体谷氨酸除了流向鸟氨酸合成途径以外，还可以流向脯氨酸合成的代谢支路，脯氨酸和鸟氨酸的合成存在竞争前体谷氨酸的关系。为了构建鸟氨酸高产菌，显然也需要对脯氨酸合成途径γ-谷氨酰激酶的编码基因proB进行敲除，阻断谷氨酸的分支代谢流，使谷氨酸最大量地流向鸟氨酸合成途径[15]。然而，敲除proB虽然可以阻断脯氨酸的合成代谢途径，提高鸟氨酸的产量，但同时也使得菌种成为脯氨酸营养缺陷型，需要额外添加脯氨酸至发酵培养基方可维持细胞正常的生长。为了规避因向发酵培养基添加脯氨酸引起的成本问题，本课题组前期通过插入转录终止子的方法弱化proB的表达，发现此举不仅可以降低脯氨酸的合成代谢通量，提高鸟氨酸的产量，而且还不会导致菌种成为脯氨酸营养缺陷型[20]。
2.2 解除胞内反馈阻遏及反馈抑制促进鸟氨酸的积累 鸟氨酸合成途径的四步酶促反应所需的基因argCJBD在谷氨酸棒杆菌基因组上以操纵子的形式排列，受到阻遏蛋白ArgR的反馈阻遏作用。开发鸟氨酸高产菌时，解除ArgR的反馈阻遏作用可以极大提升基因簇argCJBD的表达水平，从而强化鸟氨酸生物合成途径所需酶的表达丰度。因此，构建鸟氨酸和精氨酸高产菌种首先就需要敲除精氨酸操纵子的负调控蛋白ArgR[8]。此外，虽然针对鸟氨酸的反馈抑制靶点尚未得到报道，但构建的鸟氨酸高产菌种一般都是精氨酸营养缺陷型，需要向培养基投入一定量的精氨酸以满足菌体生长的需要，精氨酸则会对鸟氨酸合成途径的关键限速酶N-乙酰谷氨酸激酶(由argB编码)形成反馈抑制作用，从而不利于鸟氨酸的合成。选育精氨酸高产菌种时，研究者们运用点突变的方法对ArgB与精氨酸结合的部位进行改造，得到多种对精氨酸敏感度降低的N-乙酰谷氨酸激酶突变体，再通过质粒将这些酶导入谷氨酸棒杆菌，发现过表达这些酶突变体不仅可以提高精氨酸的产量，而且还可以应用于鸟氨酸高产菌种的选育。Jensen等[14]通过质粒表达当前报道的多种对精氨酸不敏感的N-乙酰谷氨酸激酶突变体，发现过表达源自大肠杆菌的argB，以及含有A49V和M54V突变的内源性ArgB可使得鸟氨酸的转化率达到0.3 g/g葡萄糖，相对表达未突变的argB提高了接近20%。
2.3 改造中心代谢途径优化鸟氨酸代谢流 通常情况下，用于发酵合成鸟氨酸的原料是较好利用且廉价的葡萄糖。然而，从葡萄糖到鸟氨酸还需要经历糖酵解途径和三羧酸循环途径生成α-酮戊二酸，然后在谷氨酸脱氢酶的作用下转化为谷氨酸，谷氨酸又进一步在argCJBD编码的相应酶的作用下最后生成鸟氨酸。因此，强化中心代谢途径对鸟氨酸的合成同样具有重要作用。Jiang等[16]根据前期完成的全蛋白组学数据，利用质粒分别对pgi、pfkA、gap、pyc、pyk、gltA和gdh等基因进行过表达，结果发现过表达pgi、pfkA、gap、pyc、gdh对鸟氨酸的积累具有较大的促进作用。本课题组在构建鸟氨酸高产菌种的研究时，也采用插入强启动子的方法分别在基因组水平对pfkA、gap、pyk进行过表达，发现过表达pfkA可以使得鸟氨酸产量在出发菌种的基础上提高11.2%[7]。
2.4 增加细胞内辅因子的供给促进鸟氨酸的合成 生物体内，NADPH是一种非常重要的辅因子，广泛存在于体内的合成与分解代谢途径[21-23]。谷氨酸棒杆菌体内，脂肪酸以及多种氨基酸如赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、精氨酸等的合成均需要NADPH的参与，且NADPH常常是限制产量进一步提升的限速瓶颈[24-26]。根据鸟氨酸的生物合成途径，从葡萄糖到鸟氨酸的合成代谢途径中有两步反应需要辅因子NADPH的参与：第一步是在gdh编码的谷氨酸脱氢酶的作用下，将α-酮戊二酸转化成谷氨酸；第二步是在argC编码的N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸还原酶的作用下，将N-乙酰-谷氨酰磷酸转化为N-乙酰鸟氨酸。为了疏通辅因子对进一步提高鸟氨酸产量的限制，研究者们开发了多种增加细胞内NADPH的方法。近期，本课题组将谷氨酸棒杆菌蛋白降解标签SsrA[27]的其中一种短肽AAV (AAEKSQRDYAAAV)插入到6-磷酸葡萄糖异构酶的C端以弱化其表达，并通过插入强启动子的策略过表达tkt操纵子，以及更换zwf的核糖体结合位点等方式提高了鸟氨酸产量[7]。Kim等[13]利用强化磷酸戊糖途径的方法将更多的碳代谢流引向NADPH的合成，为鸟氨酸的生物合成提供足量的辅因子。Hwang等[15]敲除了3个NADP+依赖的氧化还原酶编码基因ncgl0281、ncgl2582和ncgl2053，使得细胞内NADPH的含量提高了72.4%，发酵液鸟氨酸产量相对出发菌种提高了66.3%。Jiang等[17]通过表达源自丙酮丁醇梭菌的gapC，其编码的3-磷酸甘油醛脱氢酶可以偶联NADPH的再生，使得细胞可利用糖酵解途径生成NADPH，最终促进了鸟氨酸的积累。由此可见，提高胞内辅因子NADPH的供给对提高鸟氨酸的发酵水平是非常有效的策略。
2.5 加强转运系统提高鸟氨酸产量 开发产氨基酸菌种时，特异性转运系统的发现往往可以较大幅度地推动其发酵菌种性能的提升，如谷氨酸转运蛋白Ncgl1221[28]、赖氨酸转运蛋白LysE[29-31]等。目前针对鸟氨酸的特异性转运蛋白尚未报道，2001年，Bellmann等[32]在argF敲除菌中过表达lysE，短期发酵结果显示过表达lysE并不能使该菌胞内胞外的鸟氨酸含量发生变化，得出LysE不能充当鸟氨酸转运蛋白的角色。然而，近期本课题组在一株工业发酵生产谷氨酸的菌种谷氨酸棒杆菌S9114中过表达lysE，发现经过72 h的发酵可以使得鸟氨酸产量提高21.8%[8]。随后进行了敲除实验，发现敲除lysE可以使鸟氨酸产量下降41.7%。同时，基于基因组插入强启动子的策略也同样可以过表达lysE，鸟氨酸产量可以从15 g/L提升至19 g/L。该研究结果进一步证实了谷氨酸棒杆菌S9114中过表达LysE对鸟氨酸产量提高具有重要作用[20]。
3 利用代谢工程改造其他菌种发酵产鸟氨酸 3.1 钝齿棒杆菌 钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum，简称C. crenatum)是我国科学家从土壤中分离得到的另一种棒杆菌，其基因组与谷氨酸棒杆菌具有99%的相似度，理论上，该菌种应当具有类似谷氨酸棒杆菌的发酵产氨基酸性能。目前，对钝齿棒杆菌的研究主要集中于采用诱变育种或基因工程育种等手段对其进行改造，使其具有发酵产精氨酸的能力[33-34]。位于精氨酸合成途径的鸟氨酸，作为一种高价值的非蛋白类氨基酸也进入了研究者们的视线。Shu等[35]以钝齿棒杆菌为研究对象，通过切除竞争代谢途径，过表达大肠杆菌来源的argA以及粘质沙雷氏菌来源的argE，最终得到一株在5 L发酵罐中鸟氨酸产量达到40.4 g/L的重组菌种。
3.2 大肠杆菌 大肠杆菌(Escherichia coli，简称E. coli)是微生物界的“超级明星”，其由于遗传背景清楚、生长繁殖速度快、基因操作工具成熟等优势而被广泛应用于产各种高附加值化学品工程菌种的开发研究。目前，大肠杆菌已被成功改造产苏氨酸、精氨酸、丝氨酸等多种蛋白类氨基酸[36]。鸟氨酸的合成也可以利用大肠杆菌作为底盘细胞，经过相应的遗传改造，最后发酵生成。2006年，Lee等[37]以常用于氨基酸分子育种的大肠杆菌W3110为出发菌种，进行了多种途径工程改造，如敲除argF阻断鸟氨酸向瓜氨酸的代谢，解除负调控蛋白ArgR的反馈阻遏作用，过表达抗精氨酸反馈抑制的ArgA，以及敲除speF和proB阻断鸟氨酸向胺类的分解代谢和谷氨酸流向脯氨酸的竞争代谢支路，最终构建了一株重组大肠杆菌，其鸟氨酸产量达到13.2 mg/g菌体干重。
3.3 酿酒酵母 酿酒酵母又称面包酵母(Saccharomyces cerevisiae，简称S. cerevisiae)，是日常生活中与人类联系异常紧密的一种真核生物，在食品和酿酒方面得到非常广泛的应用[38]。由于近代分子生物学技术的飞速发展，其在工业方面的应用逐渐可以与大肠杆菌相媲美，具备极其优良的分子生物学工具、能够高效表达复杂的酶等优势，从而成为极具吸引力的微生物细胞工厂[39-40]。秦久福等[41]利用模块化路径重新布线策略，将酿酒酵母体内鸟氨酸的合成代谢途径分为三个模块：第一，鸟氨酸降解或消耗模块，通过更换弱启动子PKEX2弱化ARG3和敲除CAR2降低鸟氨酸的分解代谢；第二，鸟氨酸合成模块，改造靶点包括过表达内源性的ORT1、AGC1、GDH1基因、异源表达大肠杆菌来源的argA和argB以及谷氨酸棒杆菌来源的argC、argD和argJ等；第三，α-酮戊二酸合成模块，改造靶点包括过表达与α-酮戊二酸合成有关的基因PDA1、PYC2、CIT1、ACO2和IDP1等和过表达MTH1-△T (编码己糖转运蛋白Mth1p)。经过以上3个模块的改造，再结合对尿素循环途径CAR1的过表达，最终使得鸟氨酸产量可以达到1041 mg/L，首次开发了产鸟氨酸的真核微生物细胞。
4 展望 利用微生物发酵法生产鸟氨酸虽然是一个极富潜力的方法，选育鸟氨酸高产菌种是热门的研究领域。当前，L-鸟氨酸发酵菌种的开发已取得了巨大进步，利用微生物发酵法合成鸟氨酸已成为现实。但仍然存在生产成本高、菌种性能低等缺点。选育鸟氨酸高产菌种仍是一个亟待解决的问题。为了进一步提高鸟氨酸发酵菌种的性能，接下来的研究可以集中于以下几个方面：(1)挖掘鸟氨酸转运蛋白。除了LysE以外，理论上谷氨酸棒杆菌体内应当存在特异性的转运蛋白负责鸟氨酸的运输。倘若能借助转录组学、蛋白质组学等系统生物学技术找出鸟氨酸转运蛋白，再利用质粒或插入强启动子等方法对其进行过表达，将不仅可以加强鸟氨酸向胞外的运输，而且还能避免因胞内积累鸟氨酸产生的毒性和反馈调控问题，可以为微生物发酵法合成鸟氨酸提供巨大的推动力。(2)结合CRISPR技术高效改造鸟氨酸生物合成途径。随着科学技术的不断发展，CRISPR基因编辑技术正以席卷的态势覆盖各个研究领域[42]，并且已被广泛开发用于各种细菌，如大肠杆菌[43-45]、酿酒酵母[46-47]、谷氨酸棒杆菌[48-50]、枯草芽孢杆菌[51]等工业菌种的遗传改造。在CRISPR基因编辑技术的推动下，采用基因工程技术对鸟氨酸合成途径进行优化将更为高效和便捷。未来的途径工程改造可以进一步拓宽至糖酵解途径、三羧酸循环途径以及磷酸戊糖途径的大部分甚至每一个基因。另外，借助CRISPRi[52]技术还可以对鸟氨酸合成途径关键基因的表达实行精细调控，从而解决产物合成与菌体生长的矛盾关系，进一步促进鸟氨酸产量的提升。(3)建立鸟氨酸高通量筛选方法，结合非理性菌种选育技术筛选鸟氨酸高产菌。虽然诱变育种、定向进化等传统的非理性菌种选育技术具有筛选工作量大、正突变率少等缺点，但其在基因突变的广度方面具有巨大的优势。通常情况下，生物体的代谢网络极其复杂，使得运用理性的基因工程技术对单个靶点进行改造的效率较低，难以获得满意的效果。近年来，代谢产物生物传感器的开发推动了高通量筛选方法的迅猛发展[53]，如Mahr等[54]基于转录调控因子Lrp开发了一种响应缬氨酸的胞内生物传感器，然后借助适应性进化和荧光分选技术筛选到一种生长显著提升的突变株，其缬氨酸产量较出发菌种提高了25%，并且副产物的含量也下降了3–4倍。若是能借助系统生物学技术找出响应鸟氨酸的合成生物学元件，构建鸟氨酸高通量筛选方法，再结合化学诱变、紫外诱变、常压室温等离子体诱变等技术应当可以获得较为理想的产鸟氨酸菌种。(4)通过发酵过程控制提高鸟氨酸产量。当前对微生物发酵法合成鸟氨酸的研究主要集中于发酵菌种的开发工作，但想要实现鸟氨酸的工业化生产，选择合适的微生物发酵方法以及优化诸如溶氧、pH等发酵参数同样具有重要作用。
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