黄河浪1,2, 刁于真1,2, 杨白雪1,2, 夏子渊1,2, 汤岳琴1,2
1. 四川大学建筑与环境学院, 四川成都 610065;
2. 四川省环境保护有机废弃物资源化利用重点实验室, 四川 成都 610065
收稿日期：2020-07-24；修回日期：2020-09-10；网络出版日期：2020-09-22
基金项目：国家自然科学基金（31170093）
作者简介：汤岳琴, 四川大学建筑与环境学院教授(博导), 四川省环境保护有机废弃物资源化利用重点实验室主任, 主要从事废弃生物质生物转化生产生物能源和化学品、微生物育种、微生物生态、环境生物技术方向的研究.
*通信作者：汤岳琴, Tel:+86-28-85990937;E-mail:tangyq@scu.edu.cn.
摘要：[目的] 以秸秆等木质纤维素类生物质为原料生产液体生物燃料乙醇，目前生产成本高，大规模工业化生产尚有较大难度。构建能同化阿拉伯糖进行木糖还原生产木糖醇的重组酿酒酵母菌株，以实现原料中全糖利用、生产高附加值产品，实现产品多元化。[方法] 首先，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术依次向出发菌株中导入阿拉伯糖代谢途径和木糖还原酶基因，使菌株获得代谢阿拉伯糖和将木糖转化为木糖醇的能力；其次，通过适应性驯化的进化工程手段，提高重组菌株对阿拉伯糖的利用效率；最后，通过混合糖发酵验证重组菌株利用阿拉伯糖和还原木糖产木糖醇的能力。[结果] 通过导入植物乳杆菌的阿拉伯糖代谢途径，酿酒酵母菌株获得了较好的利用阿拉伯糖生长繁殖的能力；进一步导入假丝酵母的木糖还原酶基因后，重组菌株在葡萄糖作为辅助碳源条件下可高效还原木糖产木糖醇，但阿拉伯糖的利用能力下降。利用以阿拉伯糖为唯一碳源的培养基进行反复批次驯化，阿拉伯糖的利用能力得以恢复和提升，得到表型较好的重组菌株KAX3-2。该菌株在木糖（50 g/L）和阿拉伯糖（20 g/L）混合糖发酵条件下发酵72 h时，对阿拉伯糖和木糖利用率分别达到42.1%和65.9%，木糖醇的收率为64%。[结论] 本研究成功构建了一株能有效利用阿拉伯糖并能将木糖转化为木糖醇的重组酿酒酵母菌株KAX3-2，为后续构建、获得阿拉伯糖代谢能力更强、木糖醇积累效率更高菌株的工作奠定了基础。
关键词：酿酒酵母木糖醇木糖阿拉伯糖CRISPR/Cas9进化工程
Construction of a xylose-reducing and L-arabinose-assimilating Saccharomyces cerevisiae strain by genetic and evolutionary engineering
Helang Huang1,2, Yuzhen Diao1,2, Baixue Yang1,2, Ziyuan Xia1,2, Yueqin Tang1,2
1. College of Architecture and Environment, Sichuan University, Chengdu 610065, Sichuan Province, China;
2. Sichuan Environmental Protection Key Laboratory of Organic Waste Resource Utilization, Chengdu 610065, Sichuan Province, China
Received: 24 July 2020; Revised: 10 September 2020; Published online: 22 September 2020
*Corresponding author: Yueqin Tan, Tel: +86-28-85990937; E-mail: tangyq@scu.edu.cn.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31170093)
Abstract: [Objective] In order to utilize all sugars in the raw materials and produce high value-added products, this research aims to construct a recombinant Saccharomyces cerevisiae strain that could assimilate L-arabinose and reduce xylose to xylitol. [Methods] Firstly, we used CRISPR/Cas9 gene editing technique to sequentially introduce genes in L-arabinose metabolism pathway and gene of xylose reductase into the Saccharomyces cerevisiae host strain to endow it the ability to metabolize L-arabinose and convert xylose into xylitol. Secondly, we used adaptive evolutionary engineering method to improve L-arabinose utilization efficiency of the recombinant strain. Finally, we verified the ability of the recombinant strain to metabolize L-arabinose and transfer xylose to xylitol by mixed sugar fermentation. [Results] By introducing the L-arabinose metabolic pathway of Lactobacillus plantarum, the engineered S. cerevisiae strain obtained good ability to grow on L-arabinose. After introducing the xylose reductase gene of Candida tropicalis, the strains were able to efficiently reduce xylose to xylitol using glucose as auxiliary carbon source, yet the utilization of L-arabinose decreased. After repeated batch acclimation with L-arabinose as the sole carbon source, the L-arabinose utilization ability of strains restored and improved. We isolated evolved strain KAX3-2 with good phenotype and evaluated its fermentation capacity using medium containing xylose (50 g/L) and L-arabinose (20 g/L). After 72 h fermentation, the utilization ratio of L-arabinose and xylose reached 42.1% and 65.9%, respectively, and the yield of xylitol was 64%. [Conclusion] This study successfully constructed a S. cerevisiae strain KAX3-2 which could utilize L-arabinose and convert xylose to xylitol efficiently as well as provided the base for the construction of strains with higher L-arabinose utilization efficiency and xylitol yield.
Keywords: Saccharomyces cerevisiaeL-arabinosexylosexylitolCRISPR/Cas9evolutionary engineering
以农业秸秆为代表的木质纤维素类生物质(lignocellulosic biomass)作为一类可再生的生物资源，其主要成分为由葡萄糖聚合成的纤维素(cellulose)、由木糖和阿拉伯糖等聚合成的半纤维素(hemicellulose)以及由3种醇单体(对香豆醇、松柏醇、芥子醇)组成的木质素[1-2]。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是木质纤维素类生物质转化最常用的微生物之一，虽能高效利用葡萄糖等六碳糖产乙醇，却无法利用木糖和阿拉伯糖等五碳糖[3]。近年来，通过基因改造，赋予酿酒酵母五碳糖代谢能力的研究较多，但绝大部分都致力于六碳糖和五碳糖同步转化生产乙醇。由于木糖代谢过程辅酶不平衡、六碳糖抑制作用等因素，五碳糖的乙醇转化效率和速率都不理想[4-7]。
木糖作为木质纤维素中主要的五碳糖，其还原产物木糖醇在医药和食品方面具有巨大的应用前景，是价值较高的生物基产品。将木质纤维素原料中的木糖还原为木糖醇，理论上比木糖转化为乙醇更高效，经济价值也更高[8]。微生物可通过木糖还原酶实现木糖的还原，但该还原过程需要消耗还原力NADPH，需要碳源提供还原力。利用酿酒酵母将木质纤维素原料水解液中所有六碳糖(主要是葡萄糖和少量的甘露糖、半乳糖等)和五碳糖(主要是木糖、少量的阿拉伯糖)分别转化，同步生产乙醇和木糖醇，可以提高纤维素原料的利用效率，降低燃料乙醇生产成本，提高经济效益。但酿酒酵母只能将六碳糖转化为乙醇，虽具有转运五碳糖的能力，却不能天然利用木糖和阿拉伯糖。因此，构建可还原木糖产木糖醇且可代谢阿拉伯糖为木糖还原提供还原力的重组酿酒酵母菌株，可实现纤维素原料的全糖利用，同步生产乙醇和木糖醇。构建利用阿拉伯糖代谢过程中提供的还原力将木糖转化为木糖醇的酿酒酵母，目前尚未有研究涉及。
酿酒酵母中GRE3基因编码的醛糖还原酶具有木糖还原能力，但活性和效率低，因此需要导入高活性的外源木糖还原酶(XR)基因。Lee等[9]将毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)的木糖还原酶基因导入酿酒酵母中，利用葡萄糖代谢提供NADPH，该重组酿酒酵母的木糖醇产率有显著提高；Pratter等[10]通过在酿酒酵母中表达热带假丝酵母(Candida tropicalis)木糖还原酶CtXR基因，获得了高效产木糖醇的重组酿酒酵母菌株，可转化40 g/L的木糖为木糖醇，且收率达到100%。
酿酒酵母中亦无阿拉伯糖代谢途径，需外源导入。自然界真菌中阿拉伯糖的代谢途径涉及6种酶和4个交替氧化还原反应，且存在辅酶不平衡问题；而细菌中的代谢途径一般只涉及基因araA (编码L-阿拉伯糖异构酶，催化L-阿拉伯糖生成L-核酮糖)、araB (编码L-核酮糖激酶，催化L-核酮糖生成L-核酮糖-5-磷酸)和araD (编码L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶，催化L-核酮糖-5-磷酸生成木酮糖-5-磷酸)编码的3种酶，无辅酶参与反应，是较为理想的外源阿拉伯糖代谢通路[11]。Sedlak等[12]将大肠杆菌的阿拉伯糖代谢途径基因在酿酒酵母中表达，使之获得了阿拉伯糖的利用能力。Wang等[13]通过在具有木糖代谢能力的重组酿酒酵母中引入细菌的阿拉伯糖基因表达框(与基因表达有关的序列元件组合)，获得了能转化两种五碳糖产乙醇的重组菌株。
本研究使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对耐热絮凝酿酒酵母二倍体菌株KF-7进行改造，将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的阿拉伯糖代谢途径基因araA、araB、araD插入到KF-7基因组中XYL2基因(ScXYL2，编码木糖醇脱氢酶)位点，获得能利用阿拉伯糖生长繁殖的重组酿酒酵母菌株；以此为基础进一步将热带假丝酵母的木糖还原酶基因(CtXYL1)整合到基因组中PHO13基因(对硝基苯磷酸盐磷酸化酶)位点，赋予了阿拉伯糖代谢菌株木糖还原能力，进一步通过反复批次驯化培养，提升了阿拉伯糖利用能力。研究结果可以为构建纤维素原料全糖利用菌株提供一定指导。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 实验所用菌株、质粒及引物: 本研究所用主要菌株、质粒及引物分别如表 1、表 2和表 3所示，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
表 1. 本研究所用主要菌株 Table 1. Main strains used in this study
| Strains | Genotype | Source |
| KF-7 | From protoplast fusion of Saccharomyces cerevisiae EP-1 and IR-2 | [14] |
| KF-7-Cas9 | KF-7, containing plasmid encoding Cas9 | This study |
| KA23, KA27 | KF-7, ΔXYL2, PTDH3-araA-TCYC1, PHXT7-araB-TCYC1, PTEF1-araD-TCYC1 | This study |
| KA27-Cas9 | KA-27, containing plasmid encoding Cas9 | This study |
| KAX3, KAX5 | KA-27, ΔPHO13, PTDH3-CtXYL1-TCYC1 | This study |
表选项
表 2. 本研究所用主要质粒 Table 2. Main plasmids used in this study
| Plasmids | Characteristic | Source |
| pUG35-KanMX | PTDH3-TCYC1, PTEF1-kanMX-TTEF1 | GenScript Co., Ltd. |
| araB in pUG35-Kan-PHXT7 | PHXT7-araB-TCYC1, PTEF1-kanMX-TTEF1 | This study |
| araD in pUG35-Kan-PTEF1 | PTEF1-araD-TCYC1, PTEF1-kanMX-TTEF1 | This study |
| araAaraD in pUG35-KanMX | PTEF1-araD-TCYC1-PTDH3-araA-TCYC1, PTEF1-kanMX-TTEF1 | This study |
| pK-CtXR | PTDH3-CtXYL1-TCYC1, PTEF1-kanMX-TTEF1 | This study |
| pMEL13 | Ampr; 2 μm origin, kanMX, gRNA-CAN1.Y | [15] |
| pMEL13-XYL2-gRNA | Ampr; 2 μm origin, kanMX, XYL2-gRNA | This study |
| pMEL13-PHO13-gRNA | Ampr; 2 μm origin, kanMX, PHO13-gRNA | This study |
| Cas9-NAT | Ampr; Cas9; NAT1 | [16] |
表选项
表 3. 本研究所用主要引物 Table 3. Main primers used in this study
| Primer | Sequence |
| HXT7p-F | GGACTAGTCTCGTAGGAACAATTTCGG |
| HXT7p-R | TCCCCCGGGTTTTTGATTAAAATTAAAAAAACTT |
| TEF1p-F | GGACTAGTACAATGCATACTTTGTACGTT |
| TEF1p-R | TCCCCCGGGTTGTAATTAAAACTTAGATTAG |
| araD cassette-F | TTGGCGCGCACAATGCATACTTTGTACGTTCAA |
| araD cassette-R | GGACTAGTTACCGGCCGCAAATTAAAG |
| araAaraD Primer-F3 | ATCCATACACACTAAAAAGACATATTCATACTGCCTTGAGGATAGAGAACACCATTGAGCCATGATTACGCCAAGCG |
| araAaraD Primer-R3 | CTCAGAAGAACACGCAGGGGCCCGAAATTGTTCCTACGAGACTAGTTCTAGCCAGCTTTTTCGAGAACCCTTAATGGTACC |
| araB Primer-F3 | AGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCGGCCGGTACCATTAAGGGTTCTCGAAAAAGCTGGCTAGAACTAGTCTC |
| araB Primer-R3 | ATATAAAAAAAATCAAATGTATTGTGCATCTTGGATGCCAAAAGTTACATTTTCTTTCCTTCGAGAACCCTTAATGGTACC |
| PHO13-CtXYL1-F | AAACCTGAATATTTTTCCTTTTCAAAAAGTAATTCTACCCCTAGATTTTGCATTGCTCCTTCAATCAATGAATCGAAAAT |
| PHO13-CtXYL1-R | AGCCAAATCACAAAAAAAGCCTTATAGCTTGCCCTGACAAAGAATATACAACTCGGGAAATCAGTTCGAGTTTATCATTAT |
| The restriction site and the homology arm are underlined. | |
表选项
1.1.2 主要培养基: YP培养基：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，超纯水1000 mL；阿拉伯糖唯一碳源培养基(YNBA20培养基)：酵母氮源(yeast nitrogen base，不含氨基酸) 6.7 g，阿拉伯糖20 g，超纯水1000 mL。固体培养基额外添加15 g琼脂粉。培养基于121 ℃下高温高压灭菌15 min。
1.2 阿拉伯糖代谢基因质粒及表达框构建 根据National Center for Biotechnology Information上登记的来源于植物乳杆菌分别编码L-阿拉伯糖异构酶(GenBank accession No. CCC80517.1)、L-核酮糖激酶(GenBank accession No. CCC80519.1)、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(GenBank accession No. CCC80518.1)的基因序列，参考酿酒酵母密码子碱基偏好性对3个基因进行了密码子优化，由苏州金唯智生物科技有限公司进行了基因合成。利用含有密码子优化的araA、araB、araD基因的3种质粒araA、araB、araD in pUG35-KanMX构建重组质粒。以HXT7p-F和HXT7p-R为正、反引物扩增菌株KF-7基因组中的HXT7启动子，经SpeⅠ-SmaⅠ双酶切体系酶切纯化后与araB in pUG35-KanMX质粒使用T4 DNA连接酶连接，转化于E. coli DH5α感受态细胞中，转化子培养后抽提得到重组质粒araB in pUG35-Kan-PHXT7。将引物替换为TEF1p-F和TEF1p-R，使用上述同样方法扩增菌株KF-7基因组中的TEF1启动子，转化后抽提得到重组质粒araD in pUG35-Kan-PTEF1。以质粒araB in pUG35-Kan-PHXT7为模板，使用引物araB primer-F3和araB primer-R3扩增araB基因表达框PHXT7-araB-TCYC1。以araD in pUG35-Kan-PTEF1质粒为模板，使用引物araD cassette-F和araD cassette-R扩增araD表达框PTEF1-araD-TCYC1，扩增后同araA in pUG35-KanMX质粒经SpeⅠ和BssH Ⅱ酶切纯化后进行连接，转化后抽提得到重组质粒araAaraD in pUG35-KanMX。以质粒araAaraD in pUG35-KanMX为模板，替换引物为araAaraD Primer-F3和araAaraD Primer-R3，扩增获得araAaraD基因表达框PTEF1-araD-TCYC1-PTDH3- araA-TCYC1。
1.3 使用CRISPR/Cas9系统构建阿拉伯糖代谢菌株 利用CRISPR/Cas9基因编辑设计工具Yeastriction http://yeastriction.tnw.tudelft.nl[15]设计识别ScXYL2基因的gRNA序列并合成对应引物XYL2-targetRNA Fw和XYL2-targetRNA Rv，混合孵育后获得片段XYL2-gRNA。以质粒pMEL13为模板，6006-F、6005-R为引物扩增线性骨架，用Dpn Ⅰ限制性内切酶消化后切胶回收获得线性骨架pMEL13-backbone。将XYL2的gRNA与线性骨架pMEL13-backbone使用Gibson连接试剂盒连接，转化后抽提得到重组质粒pMEL13-XYL2-gRNA。用醋酸锂转化法向宿主菌株KF-7中导入含编码Cas9蛋白基因的质粒Cas9-NAT，使用含80 mg/mL诺尔斯菌素的YPD20 (葡萄糖含量20 g/L)固体培养基筛选转化子，获得KF-7-Cas9菌株。利用醋酸锂法向KF-7-Cas9菌株中同时导入araB和araAaraD基因表达框以及质粒pMEL13-XYL2-gRNA，使用含80 mg/mL诺尔斯菌素和100 mg/mL G418的YPD20固体培养基筛选转化子并验证，获得具有阿拉伯糖代谢能力的重组菌株。
1.4 使用CRISPR/Cas9系统构建木糖还原菌株 利用具有热带假丝酵母木糖还原酶基因CtXYL1的质粒pK-CtXR构建重组质粒。以PHO13-CtXYL1-F和PHO13-CtXYL1-R作为正、反引物，扩增CtXYL1基因表达框PTDH3-CtXYL1- TCYC1。使用Yeastriction设计识别PHO13基因的gRNA序列PHO13-gRNA并合成对应引物PHO13-targetRNA Fw和PHO13-targetRNA Rv，混合孵育后获得片段PHO13-gRNA。将PHO13- gRNA与线性骨架pMEL13-backbone使用Gibson连接试剂盒连接，转化后抽提得到重组质粒pMEL13-PHO13-gRNA。以1.3中获得的具有阿拉伯糖代谢能力的重组菌株为宿主，按相同操作导入Cas9-NAT质粒，再导入CtXYL1基因表达框以及质粒pMEL13-PHO13-gRNA，获得具有木糖还原能力的重组菌株。
1.5 培养方法
1.5.1 活化与预培养: 将于–80 ℃保藏的酿酒酵母菌株接种到YPD20平板培养基上，置于30 ℃下活化培养20 h。用接种环取一环活化后的菌株，接种到含100 mL YPD20液体培养基的500 mL锥形瓶中，30 ℃、140 r/min加塞培养16–20 h。
1.5.2 反复批次驯化培养: 将预培养后的菌株接种至含100 mL YNBA20液体培养基的300 mL锥形瓶中，35 ℃、200 r/min加塞培养，每24 h测定细胞生长情况，待细胞生长进入明显指数期后(除前两轮外)取2 mL菌液接种到新的YNBA20 (第三轮为YNBA15D5)液体培养基中继续培养，如此反复16次。
1.5.3 发酵评价: 以0.1 g细胞干重将预培养后的菌株转接到含100 mL YP液体培养基(细胞初始浓度约2×106个/mL)和设定浓度糖的300 mL锥形瓶中，35 ℃、200 r/min加塞培养，定时测定细胞生长情况、糖消耗量和产物积累量。
1.5.4 单细胞分离培养: 用接种环取一环活化后的细胞群，混悬于5 mL灭菌水中。充分振荡混匀后，利用MSM300显微操作系统挑取大小、形态相似的酵母单细胞若干，接种于平板培养基上30 ℃培养，定期观察生长状况。
1.6 分析方法
1.6.1 细胞浓度分析: 取2 mL发酵菌液，于8000 r/min离心2 min，弃上清收集菌体，用2 mL 0.5 mol/L EDTA重悬，稀释适当倍数，使用JASCO V-530紫外/可见光分光光度计测定600 nm处的吸光值(OD600)。
1.6.2 底物和产物浓度分析: 取2 mL发酵菌液，于8000 r/min离心2 min，收集上清，通过0.45 μm的微孔滤膜过滤，稀释适当倍数待测。使用SHIMADZU SI10A高效液相色谱(HPLC)测定木糖、甘油及木糖醇浓度，SHIMADZU LC-20AD高效液相色谱测定葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖浓度；使用GL Sciences GC353B气相色谱(GC)测定乙醇浓度。
2 结果和讨论 2.1 阿拉伯糖代谢菌株的构建及评价 利用CRISPER/Cas9技术，将阿拉伯糖代谢途径整合到酿酒酵母的XYL2位点，获得了重组菌株KA23和KA27。接种于YPA20培养基生长(图 1)，相比于出发菌株KF-7，重组菌株可以利用阿拉伯糖进行生长。菌株KA27在以阿拉伯糖为唯一碳源的培养基中生长120 h时的OD600达到15.64，阿拉伯糖利用率达到42.8%；而KF-7最终OD600仅为3.77，几乎无法利用阿拉伯糖。这表明外源阿拉伯糖代谢途径的导入使酿酒酵母获得了阿拉伯糖代谢能力。在Wang等[17]的研究中，将阿拉伯糖代谢途径导入酿酒酵母后，得到的重组菌株一开始并不能利用阿拉伯糖生长，还需后续基因改造。而在本研究中，阿拉伯糖的代谢途径导入菌株后即得到了有效表达。发酵产物中未检测到乙醇，表明消耗的阿拉伯糖并未转化为乙醇，可能更多用于菌体细胞的生长繁殖。
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| 图 1 菌株KF-7、KA23和KA27阿拉伯糖利用及生长情况 Figure 1 L-arabinose consumption and growth of strains KF-7, KA23 and KA27. Solid line: L-arabinose concentration; dashed line: OD600. |
| 图选项 |
2.2 木糖代谢菌株的构建及评价 再次利用CRISPR/Cas9技术将编码CtXR的基因CtXYL1替换到PHO13位点，构建了具备阿拉伯糖利用能力和木糖还原能力的菌株KAX3和KAX5。酿酒酵母自身几乎不具备木糖还原能力，需外源导入编码活性较强的木糖还原酶的基因。有研究表明敲除PHO13基因能有效提高酿酒酵母利用木糖的能力[18]，因此将木糖还原酶基因整合到PHO13基因位点。
以出发菌株KA27为对照，选择两株重组菌株KAX3和KAX5进行木糖(50 g/L)发酵评价(添加葡萄糖作为辅助碳源) (图 2)。结果表明，出发菌株KA27不能利用木糖，菌株KAX3和KAX5在72 h内的木糖利用率分别达到了73.7%和86.7%，木糖醇的收率分别为95%和94%(基于消耗木糖)。这说明导入了CtXYL1基因的菌株具有良好的木糖还原能力，且木糖醇收率高。
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| 图 2 菌株KA27、KAX3和KAX5木糖转化情况(葡萄糖为辅助碳源) Figure 2 Xylose conversion of strains KA27, KAX3 and KAX5 (glucose as auxiliary carbon source). Solid line: xylose concentration, dashed line: xylitol concentration. |
| 图选项 |
将上述3株菌株进行利用阿拉伯糖生长评价实验，以检验导入CtXYL1后菌株的阿拉伯糖利用能力是否受到影响，结果见图 3。可以看出，相比菌株KA27，导入CtXYL1的2个菌株的阿拉伯糖利用能力和生长能力显著下降，推测是由于CtXYL1的导入使得阿拉伯糖代谢相关基因的表达受到影响。
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| 图 3 菌株KA27、KAX3和KAX5阿拉伯糖利用及生长状况 Figure 3 L-arabinose consumption and growth of strains KA27, KAX3, and KAX5. Solid line: L-arabinose concentration; dashed line: OD600. |
| 图选项 |
2.3 重组酿酒酵母的驯化及评价 与KA27相比，KAX3与KAX5的阿拉伯糖代谢速率下降明显。有研究表明，适应性进化工程对于阿拉伯糖的代谢能力提升显著[19]。将KAX3和KAX5接入YNBA20液体培养基中进行反复批次驯化培养。如图 4所示，前两轮的生长速率极缓慢，分别培养72 h和216 h亦无法观察到OD600明显增加。第3轮时接入YNBA15D5培养基(阿拉伯糖含量15 g/L，葡萄糖含量5 g/L)，生长速率大幅提高。第4轮再转接入YNBA20，生长速率较前两轮有较大提升，后续十多轮培养中，细胞群均在约48 h进入指数期，且OD600较稳定。这说明从第5轮开始，细胞群利用阿拉伯糖生长能力得到大幅提高。16轮驯化后，观察到细胞群在阿拉伯糖中生长能力不再表现出明显增加，表明适应性驯化已无法继续提高阿拉伯糖利用能力。将驯化前的两株菌与驯化后的细胞群进行对比实验，结果如图 5所示。KAX3和KAX5生长和利用阿拉伯糖的能力都有提升，在培养96 h时，驯化前菌株的阿拉伯糖利用率(20 g/L)分别只有18.7%和18.2%，驯化后则分别达到了52.7%和46.6%，表明驯化过程显著提升了阿拉伯糖利用能力。
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| 图 4 反复批次驯化过程中各轮次48 h的生长状况 Figure 4 Cell growth at 48 h in each round during repeated batch acclimation. |
| 图选项 |
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| 图 5 驯化前菌株和驯化后细胞群的阿拉伯糖利用(A)及生长状况(B) Figure 5 L-arabinose consumption (A) and growth (B) of strains and cell populations before and after the acclimation, respectively. Solid line: after domestication; dashed line: before domestication. |
| 图选项 |
2.4 单细胞菌株的分离和筛选 将驯化所得KAX3和KAX5细胞群进行单细胞分离后，于30 ℃培养96 h。选择菌落较大、生长较好的单菌落各4个(共8个)进行阿拉伯糖生长评价，以确定挑单细胞筛选是否有效以及进一步筛选出较为高效的阿拉伯糖代谢菌株。从表 4可以看出，72 h时阿拉伯糖利用率最高的是菌株KAX3-2 (37.1%)，比起单细胞分离前的KAX3驯化细胞群(34.5%)有所提高，说明单细胞分离实验成功分离出了利用阿拉伯糖能力更强的菌株。
表 4. 单细胞菌株利用阿拉伯糖生长及消耗情况 Table 4. Single-cell strain growth and consumption of L-arabinose
| Evaluation parameters | t/h | KAX3-1 | KAX3-2 | KAX3-3 | KAX3-4 | KAX5-1 | KAX5-2 | KAX5-3 | KAX5-4 |
| OD600 | 0 | 0.20 | 0.20 | 0.20 | 0.20 | 0.20 | 0.20 | 0.20 | 0.20 |
| 24 | 3.53 | 3.72 | 2.47 | 3.67 | 3.71 | 3.63 | 3.61 | 3.67 | |
| 48 | 5.65 | 6.07 | 5.45 | 5.87 | 6.08 | 5.83 | 5.98 | 6.02 | |
| 72 | 8.12 | 8.73 | 7.79 | 8.61 | 7.85 | 8.38 | 7.84 | 8.17 | |
| L-arabinose concentration/(g/L) | 0 | 20.02 | 21.87 | 20.87 | 21.05 | 21.18 | 21.34 | 20.83 | 20.10 |
| 24 | 18.11 | 18.04 | 18.93 | 18.88 | 18.17 | 18.19 | 17.69 | 17.17 | |
| 48 | 16.62 | 15.80 | 17.24 | 16.48 | 16.90 | 16.79 | 15.33 | 15.84 | |
| 72 | 15.09 | 13.77 | 15.52 | 14.77 | 15.80 | 15.75 | 14.03 | 14.50 |
表选项
2.5 阿拉伯糖及木糖发酵评价 为评价驯化、筛选后菌株利用阿拉伯糖和转化木糖的能力，对KAX3-2进行木糖和阿拉伯糖混合糖(50 g/L木糖、20 g/L阿拉伯糖)发酵实验，以驯化前菌株KAX3-0作为对照。
由图 6可以看出，驯化获得的菌株KAX3-2两种五碳糖的利用率都高于驯化前菌株KAX3-0。KAX3-2 72 h内阿拉伯糖(20 g/L)利用率为42.1%，而KAX3-0则几乎不利用阿拉伯糖；前者72 h内消耗了约33 g/L木糖，木糖利用率达到65.9%，而后者仅有16%。不仅是阿拉伯糖的利用能力，KAX3-2的木糖利用能力较KAX3-0也有很大提升，但木糖醇的收率仅有64%。
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| 图 6 菌株KAX3-2和KAX3-0 (驯化前)混合糖发酵时阿拉伯糖消耗及菌株生长状况(A)、木糖消耗及木糖醇积累情况(B) Figure 6 L-arabinose comsumption and Growth (A) xylose consumption and xylitol accumulation (B) of strains KAX3-2 and KAX3-0 (before acclimation during mixed sugar fermentation of xylose and L-arabinose. A: solid line: L-arabinose concentration, dashed line: OD600; B: solid line: xylose concentration, dashed line: xylitol concentration. |
| 图选项 |
混合糖发酵时，驯化菌株的木糖醇收率明显低于菌株驯化前使用葡萄糖作为辅助碳源时的收率，推测在驯化过程中，菌株的木糖醇代谢能力得到提升，导致部分木糖醇被菌株进一步消耗。为了验证这一推测，使用YPX20 (20 g/L木糖)液体培养基进行了单独木糖的发酵评价，结果如图 7所示。野生酿酒酵母利用木糖的能力非常弱或者完全无法利用木糖生长繁殖。在导入外源高活性的CtXYL1基因后，如果没有其他辅助碳源提供还原力的条件下，木糖也不能被还原从而被进一步利用。但由图 7可以看出，比起驯化前，菌株KAX3-2利用木糖能力显著提升，72 h时消耗了18 g/L的木糖，木糖醇收率只有58%，表明部分木糖醇被菌株进一步消耗用于生长繁殖。因此，可以认为在利用阿拉伯糖进行驯化的过程中，不仅是菌株的阿拉伯糖代谢能力得到提升，木糖的代谢能力也得到显著提升。研究表明，酿酒酵母中部分转运蛋白和酶的表达对阿拉伯糖和木糖代谢都有促进作用，(推测可能是阿拉伯糖驯化过程强化了HXT7、GAL2等共用转运蛋白对于五碳糖的亲和性或GRE3、SOR1、YJR096W等对两种五碳糖代谢都有促进作用基因的表达[20-22]。)KAX3-2在混合糖条件下的木糖醇收率高于单独木糖发酵时的收率，即混合糖发酵时被进一步代谢消耗的木糖醇更少，而阿拉伯糖为细胞生长提供了部分碳源，因此混合糖条件下木糖醇积累更多。
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| 图 7 菌株KAX3-2和KAX3-0 (驯化前)单独木糖发酵时生长状况(A)、木糖消耗及木糖醇积累情况(B) Figure 7 Growth (A), xylose consumption and xylitol accumulation (B) of strains KAX3-2 and KAX3-0 (before acclimation) during xylose fermentation. B: solid line: xylose concentration; dashed line: xylitol concentration. |
| 图选项 |
基于上述结果，驯化后菌株的阿拉伯糖和木糖的代谢能力都得到明显提升，但为了在混合糖发酵时获得更高的木糖醇收率，后续工作需要对酿酒酵母本源的和木糖醇代谢相关的基因如SOR1/2或XKS1的表达进行控制，避免木糖醇的进一步消耗。
3 结论 本研究利用CRISPR/Cas9基因工程编辑技术构建了能利用阿拉伯糖并将木糖转化为木糖醇的重组酿酒酵母。以阿拉伯糖为唯一碳源通过反复批次培养驯化，显著提升了重组酿酒酵母的阿拉伯糖利用能力，获得了阿拉伯糖和木糖利用能力都较强的菌株KAX3-2。KAX3-2在发酵木糖与阿拉伯糖混合糖条件下，能较高效利用阿拉伯糖并将木糖转化为木糖醇。后续将利用基因工程手段进一步提升该菌株的阿拉伯糖利用能力和木糖醇收率，为纤维素原料的全糖利用生产乙醇和木糖醇提供优良菌株。
References
| [1] | Batalha LAR, Han Q, Jameel H, Chang HM, Colodette JL, Gomes FJB. Production of fermentable sugars from sugarcane bagasse by enzymatic hydrolysis after autohydrolysis and mechanical refining. Bioresource Technology, 2015, 180: 97-105. DOI:10.1016/j.biortech.2014.12.060 |
| [2] | Kumar V, Binod P, Sindhu R, Gnansounou E, Ahluwalia V. Bioconversion of pentose sugars to value added chemicals and fuels:recent trends, challenges and possibilities. Bioresource Technology, 2018, 269: 443-451. DOI:10.1016/j.biortech.2018.08.042 |
| [3] | Richard P, Verho R, Putkonen M, Londesborough J, Penttil? M. Production of ethanol from L-arabinose by Saccharomyces cerevisiae containing a fungal L-arabinose pathway. FEMS Yeast Research, 2003, 3(2): 185-189. DOI:10.1016/S1567-1356(02)00184-8 |
| [4] | Becker J, Boles E. A modified Saccharomyces cerevisiae strain that consumes L-arabinose and produces ethanol. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(7): 4144-4150. DOI:10.1128/AEM.69.7.4144-4150.2003 |
| [5] | Watanabe S, Abu Saleh A, Pack SP, Annaluru N, Kodaki T, Makino K. Ethanol production from xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae expressing protein engineered NADP+-dependent xylitol dehydrogenase. Journal of Biotechnology, 2007, 130(3): 316-319. DOI:10.1016/j.jbiotec.2007.04.019 |
| [6] | Jansen MLA, Bracher JM, Papapetridis I, Verhoeven MD, de Bruijn H, de Waal PP, van Maris AJA, Klaassen P, Pronk JT. Saccharomyces cerevisiae strains for second-generation ethanol production:from academic exploration to industrial implementation. FEMS Yeast Research, 2017, 17(5): fox044. |
| [7] | Wisselink HW, Toirkens MJ, Wu QX, Pronk JT, van Maris AJA. Novel evolutionary engineering approach for accelerated utilization of glucose, xylose, and arabinose mixtures by engineered Saccharomyces cerevisiae strains. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(7): 907-914. |
| [8] | Yang B, Xu W, Jia DX, Jin LQ. Research progress of preparation of xylitol by biosynthetical method. Bulletin of Fermentation Science and Technology, 2017, 46(2): 113-117, 120. (in Chinese) 杨波, 许韦, 贾东旭, 金利群. 生物法制备木糖醇的研究进展. 发酵科技通讯, 2017, 46(2): 113-117, 120. |
| [9] | Lee WJ, Kim MD, Yoo MS, Ryu YW, Seo JH. Effects of xylose reductase activity on xylitol production in two-substrate fermentation of recombinant Saccharomyces cerevisiae. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2003, 13(5): 725-730. |
| [10] | Pratter SM, Eixelsberger T, Nidetzky B. Systematic strain construction and process development:xylitol production by Saccharomyces cerevisiae expressing Candida tenuis xylose reductase in wild-type or mutant form. Bioresource Technology, 2015, 198: 732-738. DOI:10.1016/j.biortech.2015.09.046 |
| [11] | Wang CQ, Shen Y, Zhang YY, Suo F, Hou J, Bao XM. Research progress in ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae using L-arabinose. Chinese Journal of Bioprocess Engineering, 2014, 12(1): 86-93. (in Chinese) 汪城墙, 沈煜, 张艳艳, 索凡, 侯进, 鲍晓明. 酿酒酵母L-阿拉伯糖转化乙醇代谢工程的研究进展. 生物加工过程, 2014, 12(1): 86-93. |
| [12] | Sedlak M, Ho NWY. Expression of E. coli araBAD operon encoding enzymes for metabolizing L-arabinose in Saccharomyces cerevisiae. Enzyme and Microbial Technology, 2001, 28(1): 16-24. DOI:10.1016/S0141-0229(00)00282-9 |
| [13] | Wang X, Yang JJ, Yang S, Jiang Y. Unraveling the genetic basis of fast L-arabinose consumption on top of recombinant xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology and Bioengineering, 2019, 116(2): 283-293. DOI:10.1002/bit.26827 |
| [14] | Kida K, Kume K, Morimura S, Sonoda Y. Repeated-batch fermentation process using a thermotolerant flocculating yeast constructed by protoplast fusion. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1992, 74(3): 169-173. DOI:10.1016/0922-338X(92)90078-9 |
| [15] | Mans R, van Rossum HM, Wijsman M, Backx A, Kuijpers NGA, van den Broek M, Daran-Lapujade P, Pronk JT, van Maris AJA, Daran JMG. CRISPR/Cas9:a molecular Swiss army knife for simultaneous introduction of multiple genetic modifications in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research, 2015, 15(2): fov004. |
| [16] | Zhang GC, Kong Ⅱ, Kim H, Liu JJ, Cate JHD, Jin YS. Construction of a quadruple auxotrophic mutant of an industrial polyploid Saccharomyces cerevisiae strain by using RNA-guided Cas9 nuclease. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(24): 7694-7701. DOI:10.1128/AEM.02310-14 |
| [17] | Wang CQ, Shen Y, Zhang YY, Suo F, Hou J, Bao XM. Improvement of L-arabinose fermentation by modifying the metabolic pathway and transport in Saccharomyces cerevisiae. Biomed Research International, 2013, 2013: 461204. |
| [18] | van Vleet JH, Jeffries TW, Olsson L. Deleting the para-nitrophenyl phosphatase (pNPPase), PHO13, in recombinant Saccharomyces cerevisiae improves growth and ethanol production on D-xylose. Metabolic Engineering, 2008, 10(6): 360-369. DOI:10.1016/j.ymben.2007.12.002 |
| [19] | Wisselink HW, Toirkens MJ, del Rosario Franco Berriel M, Winkler AA, van Dijken JP, Pronk JT, van Maris AJA. Engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic alcoholic fermentation of L-arabinose. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(15): 4881-4891. DOI:10.1128/AEM.00177-07 |
| [20] | Tr?ff KL, J?nsson LJ, Hahn-H?gerdal B. Putative xylose and arabinose reductases in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 2002, 19(14): 1233-1241. DOI:10.1002/yea.913 |
| [21] | Konishi J, Fukuda A, Mutaguchi K, Uemura T. Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae using endogenous xylose-assimilating genes. Biotechnology Letters, 2015, 37(8): 1623-1630. DOI:10.1007/s10529-015-1840-2 |
| [22] | Li YC, Meng FB, Gou M, Sun ZY, Tang YQ. Research progresses on strain construction of xylose isomerase-based recombinant xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Bulletin, 2017, 33(10): 88-96. (in Chinese) 李云成, 孟凡冰, 苟敏, 孙照勇, 汤岳琴. 基于木糖异构酶途径的木糖发酵酿酒酵母菌株构建研究进展. 生物技术通报, 2017, 33(10): 88-96. |
