闫倩倩1, 刘杏忠2, 张永杰1
1.山西大学生命科学学院, 山西 太原 030006;
2.中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室, 北京 100101
收稿日期：2018-03-29；修回日期：2018-04-25；网络出版日期：2018-05-12
基金项目：山西省自然科学基金（201601D011065）；山西省留学回国人员科技活动择优资助项目；山西省回国留学人员科研资助项目（2017-015）
*通信作者：张永杰, E-mail:zhangyj2008@sxu.edu.cn
摘要：[目的] 鉴定洛斯里被毛孢OWVT-1菌株的线粒体基因组，验证公布的USA-87-5菌株线粒体基因组中的错误，对洛斯里被毛孢正确的线粒体基因组序列进行注释并开展不同被毛孢物种间的比较线粒体基因组学分析。[方法] 借助DNA高通量测序数据并通过必要的Sanger测序组装OWVT-1的线粒体基因组。通过PCR验证OWVT-1与公布的USA-87-5线粒体基因组序列差异的真实性。利用多种生物信息方法分析和注释洛斯里被毛孢的线粒体基因组。[结果] 公布的洛斯里被毛孢USA-87-5菌株的线粒体基因组存在几处序列错误，包括3处长片段的插入缺失和多处短片段的插入缺失。实际上，洛斯里被毛孢USA-87-5与OWVT-1菌株的线粒体基因组序列完全相同。该菌的线粒体基因组全长62949 bp，在7个基因中共插入13个内含子，部分内含子和基因间区显现出序列退化的特征。洛斯里被毛孢、明尼苏达被毛孢、线虫被毛孢的线粒体基因组具有较强的共线性关系。除一些独立的ORF外，核心蛋白编码基因、rRNA基因和tRNA基因的排列顺序非常保守。基因间区的长短是影响3种被毛孢线粒体基因组大小最主要的因素。[结论] 公布的洛斯里被毛孢USA-87-5菌株线粒体基因组中存在序列错误。本文新报道了OWVT-1菌株的线粒体基因组，并进行注释和比较线粒体基因组学分析。
关键词：洛斯里被毛孢线粒体基因组校正注释比较线粒体基因组
Reanalysis of the mitochondrial genome of the nematophagous fungus Hirsutella rhossiliensis
Qianqian Yan1, Xingzhong Liu2, Yongjie Zhang1
1.School of Life Sciences, Shanxi University, Taiyuan 030006, Shanxi Province, China;
2.State Key Laboratory of Mycology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
Received 29 March 2018; Revised 25 April 2018; Published online 12 May 2018
*Corresponding author: Yongjie Zhang, E-mail:zhangyj2008@sxu.edu.cn
Supported by the Natural Science Foundation of Shanxi Province (201601D011065), by the Fund Program for the Scientific Activities of Selected Returned Overseas Professionals in Shanxi Province and by the Research Project Supported by Shanxi Scholarship Council of China (2017-015)
Abstract: [Objective] To identify the mitochondrial genome (mitogenome) of Hirsutella rhossiliensis OWVT-1 strain, verify erroneous sequences present in the published USA-87-5 mitogenome, and perform comparative mitogenomic analyses of three Hirsutella species. [Methods] The OWVT-1 mitogenome was assembled based on high-throughput DNA sequencing data and Sanger sequencing. PCR assays were performed to verify 3 long varying regions observed during alignment between the published USA-87-5 mitogenome and OWVT-1 mitogenome assembled in this study. Bioinformatics analyses were used to annotate the mitogenome sequence of OWVT-1. [Results] We detected several sequence errors in the published USA-87-5 mitogenome, including long sequence insertions/deletions and small indels. The mitogenomes of OWVT-1 and USA-87-5 were identical without any nucleotide difference. The complete mitogenome of H. rhossiliensis was 62949 bp in length, with 13 introns in seven genes. Several introns and intergenic regions seemed to have degenerated. The mitogenomes of H. rhossiliensis, H. vermicola, and H. minnesotensis showed a high synteny. Except free-standing ORFs, the gene order of core protein-encoding genes, rRNA genes, and tRNA genes were highly conserved among the three Hirsutella mitogenomes. The length at intergenic regions was a main factor affecting mitogenome sizes of different Hirsutella species. [Conclusion] There were erroneous sequences in the published USA-87-5 mitogenome. We reported the authentic mitogenome sequence of H. rhossiliensis using the highly virulent strain OWVT-1.
Keywords: Hirsutella rhossiliensismitochondrial genomecorrectionannotationcomparative mitogenomics
线粒体(mitochondrion)是真核细胞中的一种半自主性细胞器，被普遍认为起源于寄生在真核生物共同祖先细胞内的远古细菌，具有自身的基因组，独立于细胞核基因组而遗传(主要是单亲遗传)，不受减数分裂时核染色体重组的影响[1]。线粒体基因组虽然明显小于细胞核基因组，但由于拷贝数高而成为细胞总DNA的重要组成部分。线粒体基因组特定的基因组成、遗传密码和复制方式，记载着生物从单细胞到多细胞、从低等到高等进化过程中丰富的历史信息，是研究物种起源与进化的有力工具[2]。
近年来，随着DNA测序技术的发展和测序成本的降低，越来越多真菌的线粒体基因组被报道。截止2018年3月，NCBI细胞器基因组参考数据库中已有约260种真菌的线粒体基因组(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesGroup.cgi?taxid=4751&opt=organelle)，其中子囊菌210种(占80%)。仅2016和2017两年就有73种真菌(其中67种为子囊菌)的线粒体基因组被测序。虽然基于高通量测序数据能够较容易地得到真菌的线粒体基因组，但在组装过程中需十分谨慎，必要时需通过PCR扩增和测序确认可疑区域的序列，否则组装出的结果容易出现序列错误。例如，肺囊康定产生菌Glarea lozoyensis ATCC 74030菌株由于cox2基因具有2个拷贝，当仅基于高通量测序数据组装线粒体基因组时，在这两个cox2基因处出现了组装错误[3]。另外，我们发现一些发表的线粒体基因组中部分基因的注释也不够准确。
被毛孢属Hirsutella Pat.是一类寄主广泛、全球性分布的节肢动物和线虫病原真菌，在控制节肢动物种群、维持生态系统平衡、医药及生物活性物质开发等方面具有重要价值。自1892年Patouillard以嗜虫被毛孢Hirsutella entomophila Pat.为模式种建立以来，被毛孢属的成员不断增加，目前已有约90个有效名称[4]。被毛孢属物种在现代分类系统中的分类地位尚未最终确定，但多数应归到子囊菌门Ascomycota肉座菌目Hypocreales的线虫草科Ophiocordycipitaceae[5]。根据国际命名法规“一菌一名”的要求，Quandt et al. (2014)建议保留线虫草属Ophiocordyceps，而弃用被毛孢属(注：部分被毛孢是虫草的无性型)，因为被毛孢属的模式材料已经无法得到，并且保留被毛孢属比保留线虫草属要做更大量的物种名称处理工作[6]。被毛孢属多数真菌可能最终被组合到线虫草属，但目前大部分被毛孢属真菌缺乏分子数据，因此，科研人员尚未对被毛孢属的物种名称进行系统处理[5]。被毛孢属真菌大部分以寄生昆虫为生，少数可寄生线虫、螨、蜘蛛等[4]。已知能够寄生线虫的被毛孢只有3个种，即洛斯里被毛孢Hirsutella rhossiliensis Minter & Brady 1980、明尼苏达被毛孢Hirsutella minnesotensis Chen, Liu & Chen 2000和线虫被毛孢Hirsutella vermicola Xiang & Liu 2006；前两种对植物寄生线虫具有较高的侵染性和致死性，而第3种主要寄生食细菌线虫[7]。虽然被毛孢属包含许多物种，但目前只有3个物种(即寄生线虫的3种被毛孢)有发表的线粒体基因组[8-10]。
洛斯里被毛孢是线虫的一种常见内寄生真菌，在自然界分布广泛，寄主范围也较广，已在16个属的23种土传线虫和8个国家被报道，包括美国、荷兰、法国、英国、意大利、新西兰、澳大利亚和中国等[11]。洛斯里被毛孢显示出较好的生防潜力并被广泛研究[12-13]，但不同菌株在形态、致病性、遗传特征等方面存在差异[14-16]。Liu & Chen (2001)利用琼脂平板、室内土壤和温室试验等，从93个洛斯里被毛孢菌株中筛选到一个优良菌株OWVT-1，该菌株对大豆胞囊线虫卵和二龄幼虫的种群密度抑制率分别达到95%和98%[13, 15]。随后，研究人员围绕OWVT-1菌株生长、产孢和孢子萌发的营养条件[17-18]、丝氨酸蛋白酶的分离纯化和基因克隆[19-20]、在土壤中的种群动态[21-22]、对胞囊线虫的功能反应[23]等做了大量的研究工作。
洛斯里被毛孢OWVT-1菌株的基因组测序已经完成，但尚未正式发表[24]。Wang等(2016)发表了洛斯里被毛孢USA-87-5菌株的线粒体基因组[9]，但我们后来在使用该线粒体基因组序列的过程中发现可能存在序列错误。为了提供洛斯里被毛孢正确的线粒体基因组，本文组装了OWVT-1菌株完整的线粒体基因组，确认USA-87-5菌株发表的线粒体基因组存在序列错误，对洛斯里被毛孢正确的线粒体基因组序列进行注释并开展比较线粒体基因组学分析。
1 材料和方法 1.1 菌株培养与DNA提取 洛斯里被毛孢菌株USA-87-5和OWVT-1分别分离自美国明尼苏达州卡顿伍德县(Cottonwood)和沃西卡县(Waseca)大豆田中的胞囊线虫Heterodera glycines上。其中，OWVT-1菌株分离自一块连作27年并出现线虫密度自然衰退的大豆田中[25]。这两个菌株均由中国科学院微生物研究所刘杏忠研究员课题组提供。将这两个菌株分别接种到铺有玻璃纸的PDA培养基上，在25 ℃黑暗培养2周，收集菌丝体后用月桂酸钠法提取总DNA[26]。
1.2 OWVT-1线粒体基因组的组装 利用高通量Roche 454和Illumina Hiseq 2000结合的测序技术对OWVT-1菌株进行基因组测序，得到约50.6 Mb的基因组组装数据[24]。为了得到该菌株的线粒体基因组序列，以明尼苏达被毛孢的线粒体基因组(NC_027660)为query (查询序列)，通过本地BLAST搜索OWVT-1组装数据，找到4条代表线粒体DNA的序列。这4条序列均存在多处缺口，因此，根据缺口两端的已知序列设计引物，通过PCR扩增和Sanger测序填补序列内部存在的缺口。通过与明尼苏达被毛孢线粒体基因组序列比较，判断这4条序列的前后顺序关系，然后在相邻序列的端部设计引物，通过PCR扩增和Sanger测序拼接这4条序列，从而得到OWVT-1完整的线粒体基因组。
1.3 USA-87-5和OWVT-1线粒体基因组的比较 利用MAFFT version 7软件(http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)对组装完成的OWVT-1的线粒体基因组与公布的USA-87-5的线粒体基因组(KU203675)进行比对，比对结果用Mauve 2.3.1软件进行展示[27]。为便于序列比对，将公布的USA-87-5线粒体基因组序列的起点调整到与OWVT-1一致(即rnl基因前15 bp处)。对OWVT-1和USA-87-5的线粒体基因组比对存在差异的区域，根据两端的保守序列设计引物(表 1)，然后通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳确认两个菌株间是否确实存在差异。为了进一步确认USA-87-5的线粒体基因组序列，利用专门的线粒体基因组组装软件MITObim 1.9[28]从USA-87-5的高通量测序数据中重新组装线粒体基因组。
表 1. 验证OWVT-1与USA-87-5的序列使用的引物 Table 1. Primers used to verify sequences in USA-87-5 and OWVT-1
| Locus | Primer name | Primer sequence (5′→3′) | Expected size/kb |
| VG1 | VG1-F1 | GTATTTAGTATTGGGTGTTCGAAT | |
| VG1-R1 | AGACCGTAGATTTGTCCTTTGT | 1.1 | |
| VG2 | VG2-F1 | TTTTGAGCTTATTTCCATAGTGC | |
| VG2-R1 | TAGCATTAGAACCCGATCCATT | 0.7 | |
| VG3 | VG3-F1 | TCATTCTTTTCTGCTGTTCCAT | |
| VG3-R1 | TACAGCCATTTAAACACCCCAT | 2.9 |
表选项
1.4 OWVT-1线粒体基因组的注释 由于公布的USA-87-5菌株的线粒体基因组存在序列及注释方面的错误，以OWVT-1菌株为代表重新注释洛斯里被毛孢的线粒体基因组。首先通过MFannot软件(http://megasun.bch.umontreal.ca/cgi-bin/mfannot/mfannotInterface.pl)进行自动注释(遗传密码表 4)，然后进行人工校对。通过与近缘真菌中无内含子基因的比较，确定核心蛋白编码基因和核糖体RNA基因的边界、内含子的有无及其序列边界。使用RNAweasel (http://megasun.bch.umontreal.ca/cgi-bin/RNAweasel/RNAweaselInterface.pl)确定内含子的类型。通过tRNAscan-SE 2.0[29]注释tRNA基因。通过ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)寻找内含子及基因间区序列中存在的ORF (开放阅读框)，只考虑长度大于300 bp的ORF。通过在线BLAST搜索判断ORF的功能。
1.5 OWVT-1线粒体基因组中的重复序列 通过本地BLAST对OWVT-1的线粒体基因组与其本身进行序列相似性搜索，只考虑E值小于10-5的比对结果。通过Tandem Repeats Finder (http://tandem.bu.edu/trf/trf.basic.submit.html)分析OWVT-1线粒体基因组中的串联重复序列(使用默认参数)。
1.6 被毛孢属不同真菌线粒体基因组的比较 为分析被毛孢属真菌线粒体基因组的进化特征，我们使用本研究组装出的洛斯里被毛孢OWVT-1菌株的线粒体基因组、已公布的明尼苏达被毛孢3608菌株和线虫被毛孢AS3.7877菌株的线粒体基因组[8, 10]，比较它们线粒体基因组的大小、基因组成及排列顺序、内含子的插入位置等。使用LAST软件(http://lastweb.cbrc.jp/)对洛斯里被毛孢与明尼苏达被毛孢或线虫被毛孢的线粒体基因组进行共线性分析。
1.7 序列提交 洛斯里被毛孢OWVT-1菌株的线粒体基因组已提交到GenBank，登录号为MG979071。
2 结果和分析 2.1 洛斯里被毛孢USA-87-5和OWVT-1线粒体基因组序列的比较 借助DNA高通量测序数据并辅以PCR扩增和Sanger测序，成功组装出OWVT-1的线粒体基因组，全长62949 bp，与USA-87-5公布的线粒体基因组(62483 bp，KU203675)相差466 bp。对OWVT-1的线粒体基因组与公布的USA-87-5线粒体基因组进行序列比对，发现3处长片段的插入缺失与多处短片段的插入缺失(图 1)。然而，通过对3处长片段插入缺失区域的PCR和凝胶电泳检测(图 2)，以及利用MITObim软件从高通量测序数据中重新组装USA-87-5的线粒体基因组，都发现序列比对时出现的这些差异是由于公布的USA-87-5线粒体基因组存在序列错误造成的。也就是说，菌株OWVT-1与USA-87-5的线粒体基因组实际均为62949 bp，并且无序列差异。
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| 图 1 OWVT-1与公布的USA-87-5线粒体基因组序列的比对 Figure 1 Alignment of the published USA-87-5 mitogenome and OWVT-1 mitogenome assembled in this study. Numbered scale bars indicate distances in base pairs. VG1, VG2, and VG3 indicate where three long insertion/deletion regions located. |
| 图选项 |
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| 图 2 PCR验证OWVT-1与公布的USA-87-5线粒体基因组比对存在差异的3处区域 Figure 2 PCR assays of the three long insertion/deletion regions resulting from alignment between the published USA-87-5 mitogenome and OWVT-1 mitogenome assembled in this study. Identical and expected amplicon sizes at each varying region between the two strains imply the presence of erroneous sequences in the published USA-87-5 mitogenome. |
| 图选项 |
2.2 洛斯里被毛孢OWVT-1线粒体基因组的组成结构 OWVT-1的线粒体基因组为环状分子，包括14个核心蛋白编码基因(atp6、atp8、atp9、cob、cox1-3、nad1-6和nad4L)、2个rRNA基因(rnl和rns)、26个转运氨基酸的tRNA基因和另外7个独立的ORF。除orf186外，所有其他基因均在正义链上转录(图 3)。这26个tRNA基因可以转运所有20种标准的氨基酸；除甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)各有2-3个具有相同或不同反义密码子的tRNA基因外，其他氨基酸均只有一个tRNA基因。tRNA基因主要聚集在nad6/rnl (5个)、rnl/nad2 (13个)和rns/cox3 (4个)这3个区域(图 3)。
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| 图 3 洛斯里被毛孢线粒体基因组环状图 Figure 3 Circular map of the H. rhossiliensis OWVT-1 mitogenome. Arrows indicate transcription directions of mitochondrial genes. Introns are shown in white boxes. |
| 图选项 |
在洛斯里被毛孢的线粒体基因组中共有13个内含子，分布在rnl (2)、nad2 (1)、nad5 (2)、cob (3)、cox1 (3)、nad1 (1)和cox3 (1)这7个基因中。除nad5-i1的内含子类型不能确定外，其他内含子均为Ⅰ型，但又可细分成若干亚型(表 2)。除cox1-i1外(上游外显子以C结尾，内含子本身以G结尾)，其他内含子都符合Ⅰ型内含子典型的序列特征(即上游外显子以T结尾，内含子本身以G结尾)。除两个内含子nad5-i2和cox3-i1因序列较短而无ORF外，其他内含子中均有至少一个ORF (编码核糖体蛋白RPS3，GIY-YIG或LAGLIDADG归巢内切酶)，并且4个内含子rnl-i1、nad2-i1、cox1-i3和nad1-i1由于移码突变和/或终止密码子突变而显现出序列退化的特征。此外，在rnl/nad2基因间区还存在多处退化的GIY-YIG和LAGLIDADG归巢内切酶的编码序列，已不能鉴定出完整的读码框。
表 2. 洛斯里被毛孢线粒体基因组中的内含子及其ORF Table 2. Introns and intronic ORFs in the H. rhossiliensis OWVT-1 mitogenome
| Intron | Intronic ORF | Length/bp | Intron type | Notes |
| rnl-i1 | 1443 | IB(3′) | Degeneration | |
| orf165 | 498 | GIY-YIG endonuclease | ||
| rnl-i2 | 2240 | IA | ||
| orf544 | 1635 | RPS3 | ||
| nad2-i1 | 1370 | IA | Degeneration | |
| orf102 | 309 | LAGLIDADG endonuclease | ||
| nad5-i1 | 1403 | Unknown | ||
| orf428 | 1287 | LAGLIDADG endonuclease | ||
| nad5-i2 | 492 | ID | ||
| cob-i1 | 1179 | ID | ||
| orf287 | 864 | GIY-YIG endonuclease | ||
| cob-i2 | 1244 | IA | ||
| orf298 | 897 | LAGLIDAG endonuclease | ||
| cob-i3 | 987 | IB | ||
| orf237 | 714 | LAGLIDADG endonuclease | ||
| cox1-i1 | 1372 | IB | ||
| orf345 | 1038 | LAGLIDADG endonuclease | ||
| cox1-i2 | 1402 | IB(5′) | ||
| orf318 | 957 | LAGLIDADG endonuclease | ||
| cox1-i3 | 1364 | IB | Degeneration | |
| orf277 | 834 | GIY-YIG endonuclease | ||
| orf103 | 312 | GIY-YIG endonuclease | ||
| nad1-i1 | 1080 | IB | Degeneration | |
| orf100 | 303 | GIY-YIG endonuclease | ||
| cox3-i1 | 190 | IB |
表选项
通过本地BLAST对OWVT-1的线粒体基因组与其自身进行相似性搜索，找到42个高相似性的比对结果，但没有长片段的序列重复，只在29-101 bp (平均58 bp)的比对长度上有79.2%-100% (平均87.8%)的相似性；最大的101 bp的比对结果对应的是trnL_2/trnQ基因间区的序列与trnH/trnM_3基因间区的序列。Tandem Repeats Finder找到13个串联重复序列，总长度约550 bp (占线粒体基因组总长的0.87%)，6-25 bp的序列可重复2-11次；最长的串联重复序列是在nad5/cob基因间区，其中CTGCTGA以平均95%的匹配度串联重复了约11次。
2.3 3种被毛孢属真菌线粒体基因组的比较 洛斯里被毛孢与线虫被毛孢、明尼苏达被毛孢的线粒体基因组具有较强的共线性关系(图 4)。它们的线粒体基因组大小存在差异，受到基因间区的长度、独立ORF的数量和内含子数目的影响(表 3)，相关性系数(r)分别为0.98、0.93和0.38。在3种被毛孢的线粒体基因组中都有14个核心蛋白编码基因、2个rRNA基因、25-26个tRNA基因和3-7个独立的ORF (图 5)。根据BLASTN的分析结果，这些独立的ORF仅在各自所属真菌的线粒体基因组中存在，没有在其他两种真菌中发现有高相似性的序列。除trnA基因的位置在不同真菌中发生变化及洛斯里被毛孢的trnF基因多出1个拷贝外，其他所有核心蛋白编码基因、rRNA基因和tRNA基因的排列顺序在3种被毛孢中完全相同(图 5)。相邻基因nad2和nad3在3种被毛孢中都是紧密连接在一起的，没有任何间隔碱基；nad4L和nad5在3种被毛孢中都是重叠1个碱基(即nad4L的终止密码子TAA的最后一个碱基A充当nad5起始密码子ATG的第一个碱基A)。
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| 图 4 3种被毛孢线粒体基因组序列的共线性关系 Figure 4 Dot plots between different Hirsutella mitogenomes. A: between H. rhossiliensis (HR) and H. vermicola (HV) mitogenomes; B: between H. rhossiliensis (HR) and H. minnesotensis (HM) mitogenomes. |
| 图选项 |
表 3. 3种被毛孢线粒体基因组的比较 Table 3. Comparison among three Hirsutella mitogenomes
| Item | HV | HM | HR |
| Accession No. | KY465721 | KR139916 | MG979071 |
| Strain | AS3.7877 | 3608 | OWVT-1 |
| Size (bp) | 53793 | 52245 | 62949 |
| No. tRNAs | 25 | 25 | 26 |
| No. introns | 7 | 13 | 13 |
| No. ORFs | 3 | 4 | 7 |
| Length of exons | 24.6 kb | 24.9 kb | 26.0 kb |
| Length of introns | 15.5 kb | 17.1 kb | 15.8 kb |
| Length of intergenic regions | 13.7 kb | 10.2 kb | 21.1 kb |
| HR, H. rhossiliensis; HV, H. vermicola; HM, H. minnesotensis. Intergenic regions are those remaining regions after excluding exons and introns in core protein-encoding genes, rRNA genes, tRNA genes, and free-standing ORFs. | |||
表选项
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| 图 5 3种被毛孢线粒体基因排列顺序的比较 Figure 5 Comparison of gene orders among three Hirsutella mitogenomes. The number of introns is given in parentheses after gene names if present. HR, H. rhossiliensis; HV, H. vermicola; HM, H. minnesotensis. |
| 图选项 |
线虫被毛孢、明尼苏达被毛孢和洛斯里被毛孢分别在5、7和7个基因中含有7、13和13个内含子；明尼苏达被毛孢和洛斯里被毛孢虽然都在7个基因中插入了13个内含子，但含有内含子的不是相同的7个基因(图 5)。3种真菌在rnl、nad5和cob中都有内含子插入，并且在这3个基因中都有一共同的内含子插入位点。在rnl共同的内含子插入位点中都有编码核糖体蛋白RPS3的ORF；在nad5共同的内含子插入位点中无ORF或有未知功能的ORF；在cob共同的内含子插入位点中有未知功能的ORF或编码GIY-YIG归巢内切酶的ORF。
3 讨论 本文报道洛斯里被毛孢OWVT-1菌株的线粒体基因组，并验证公布的USA-87-5菌株线粒体基因组(KU203675)中存在的错误。这两个菌株的分离地点均位于美国明尼苏达州，但属于两个不同的县，相距约144公里。我们发现两个菌株的线粒体基因组序列实际上是完全相同的。公布的USA-87-5菌株的线粒体基因组(KU203675)中存在几处序列错误并引起一些注释错误，包括在nad4L终止处多出一个碱基A，因而改变了其与nad5的结合方式(二者本应重叠1个碱基，但多出的碱基使二者直接相连)；在trnQ和trnM_3间一段0.7 kb的序列串联重复了2次(即VG1处)，使得trnH基因多出1个拷贝；在trnS_1和cox3-E2间一段1.0 kb的序列重复了2次(即VG2处)，使得无法准确注释出cox3基因的起始位置；在nad6和trnI间丢失了一段2.4 kb的序列(即VG3处，也是公布序列的结尾处)，因此漏掉了trnV和orf263两个基因；在cox1基因中也存在序列错误等。在发表的USA-87-5菌株线粒体基因组序列正确的地方也存在一些注释错误，如nad2基因中的内含子没有被鉴定出来，rnl基因中内含子的鉴定不准确等[9]。
我们对洛斯里被毛孢正确的线粒体基因组序列进行注释，并与明尼苏达被毛孢和线虫被毛孢的线粒体基因组进行比较。3种被毛孢线粒体基因组的共线性较好，而且常见基因的顺序也比较保守，但洛斯里被毛孢比明尼苏达被毛孢和线虫被毛孢的线粒体基因组大(相差约10 kb)。我们发现基因间区的长度、独立ORF的数量和内含子数目均会影响被毛孢线粒体基因组的大小，但基因间区长度和独立ORF数量的影响程度较大(表 3)。例如，rnl/nad2基因之间的序列(除去其中的tRNA和独立ORF本身的序列)在线虫被毛孢、明尼苏达被毛孢和洛斯里被毛孢中分别为2.4、2.2和9.2 kb。Xiao et al. (2017)通过对酵母菌种间和种内多个线粒体基因组的分析，发现引起物种间和物种内线粒体基因组大小变化的主要因素是不同的，物种间差异主要是由基因间区序列引起的[30]。这与本文的结果相一致。
洛斯里被毛孢在7个基因中共插入13个内含子，其中4个内含子rnl-i1、nad2-i1、cox1-i3和nad1-i1由于移码突变和/或终止密码子突变而显现出序列退化的特征；2个内含子nad5-i2和cox3-i1序列较短，分别为492 bp和190 bp，小于明尼苏达被毛孢和线虫被毛孢中线粒体内含子的长度，可能也是序列退化的证据。实际上，线虫被毛孢7个内含子的平均长度为2.2 kb (范围617-5789 bp)[8]；明尼苏达被毛孢13个内含子的平均长度为1.3 kb (范围893-1818 bp)[10]；洛斯里被毛孢13个内含子的平均长度为1.2 kb (范围190-2240 bp；表 2)。此外，我们在洛斯里被毛孢rnl/nad2基因之间的序列中发现多处退化的GIY-YIG和LAGLIDADG归巢内切酶的编码序列，但已不能鉴定出完整的读码框。这些序列退化的证据意味着，洛斯里被毛孢祖先线粒体基因组可能比目前已知的62949 bp大。为了详细了解该菌的进化过程，我们目前正在利用不同地理来源的洛斯里被毛孢菌株开展种内比较线粒体基因组学研究。
致谢: 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所赖屹玲和中国科学院动物研究所王牛牛分别参与完成OWVT-1和USA-87-5菌株的基因组测序工作，在此表示感谢。
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