蛹虫草线粒体DNA与细胞核DNA进化关系的比较
张姝¹, 崔宁波², 赵宇翔², 张永杰²
1. 山西大学应用化学研究所, 山西 太原 030006;
2. 山西大学生命科学学院, 山西 太原 030006
收稿日期：2019-01-25；修回日期：2019-03-27；网络出版日期：2019-07-11
基金项目：国家自然科学基金（31872162）；山西省自然科学基金（201601D011065）；山西省回国留学人员科研资助项目（2017-015）
_*通信作者：张姝, Tel:+86-351-7017101, E-mail:zhangshu@sxu.edu.cn;
张永杰, E-mail:zhangyj2008@sxu.edu.cn.

摘要：[目的] 分析蛹虫草是否存在核内线粒体DNA片段，比较蛹虫草线粒体DNA与细胞核DNA的碱基变异程度及所反映的菌株间的系统发育关系。[方法] 通过本地BLAST或LAST对蛹虫草线粒体基因组和核基因组进行序列相似性搜索；从10个已知线粒体基因组的蛹虫草菌株中分别扩增7个细胞核蛋白编码基因片段，并与其在14个线粒体蛋白编码基因上的碱基变异情况进行比较。[结果] 蛹虫草核基因组中存在5处较短的核内线粒体DNA片段，总长只有278 bp。蛹虫草核DNA的变异频率整体上高于线粒体DNA。核DNA和线粒体DNA所反映的蛹虫草菌株间的系统发育关系存在显著差异。[结论] 蛹虫草线粒体DNA与核DNA间不存在长片段的基因交流，二者变异频率不同，所反映的蛹虫草菌株间的系统发育关系也有差异。本研究增加了对蛹虫草线粒体与细胞核DNA进化关系的认识。
关键词：蛹虫草线粒体DNA细胞核DNA基因交流变异频率
Comparison of evolutionary relationships between mitochondrial and nuclear DNAs in Cordyceps militaris
Shu Zhang¹, Ningbo Cui², Yuxiang Zhao², Yongjie Zhang²
1. Institute of Applied Chemistry, Shanxi University, Taiyuan 030006, Shanxi Province, China;
2. School of Life Sciences, Shanxi University, Taiyuan 030006, Shanxi Province, China
Received: 25 January 2019; Revised: 27 March 2019; Published online: 11 July 2019
_*Corresponding author: Shu Zhang, Tel: +86-351-7017101, E-mail:zhangshu@sxu.edu.cn;
Yongjie Zhang, E-mail:zhangyj2008@sxu.edu.cn.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31872162), by the Natural Science Foundation of Shanxi Province (201601D011065), and by the Research Project Supported by Shanxi Scholarship Council of China (2017-015)

Abstract: [Objective] To detect possible nuclear mitochondrial DNA segments (Numts) within nuclear genomes of Cordyceps militaris and to compare the degree of nucleotide variations and phylogenetic relationships between mitochondrial and nuclear DNAs by employing multiple C. militaris isolates. [Methods] Nuclear genomes of C. militaris were searched for sequence similarities by local BLAST/LAST analyses with its mitochondrial genome as the query. Seven nuclear protein-coding gene fragments were amplified from 10 C. militaris isolates that had available mitochondrial genomes. Nucleotide variations at seven nuclear fragments were compared with those at 14 mitochondrial protein-coding genes. [Results] Five short Numts with a total length of 278 bp were identified in the nuclear genomes of C. militaris. The overall nucleotide variabilities of C. militaris on nuclear fragments were generally higher than that on mitochondrial fragments. The phylogenetic relationships among different C. militaris isolates revealed by nuclear and mitochondrial DNAs were significantly different. [Conclusion] There was no detectable gene transfer of long fragments between mitochondrial and nuclear genomes of C. militaris. The nucleotide variabilities of mitochondrial and nuclear DNAs were different, and the phylogenetic relationships of different C. militaris isolates revealed by them were different either. This study enhanced our understanding of the evolutionary relationship between mitochondrial and nuclear DNAs in C. militaris.
Keywords: Cordyceps militarismitochondrial DNAnuclear DNAgene transfernucleotide variability
真核生物除细胞核中含有遗传物质外，在线粒体、叶绿体等细胞器中也有遗传物质。线粒体的主要功能是合成ATP，为细胞生命活动提供能量，但也参与细胞凋亡、老化、离子平衡的维持等过程^[1-2]。线粒体DNA具有多拷贝、基因组较小、单亲遗传(尤其在动植物中)、较高的碱基变异速率等特性，已被广泛用作生态学、群体遗传学等研究的分子标记^[3]。通过对线粒体DNA的研究，大大增加了我们对真核生物起源、多样性及复杂性的认识^[4]。虽然组成线粒体的许多蛋白为核基因编码的产物，但线粒体基因组也编码少许蛋白，并且其遗传独立于核基因组。目前，对于真核细胞中的核DNA和线粒体DNA的变异速率存在两种截然相反的观点：动物线粒体DNA通常比核DNA变异快，而植物核DNA通常比线粒体DNA变异快^[5]。正因为如此，动物中广泛使用线粒体COI基因片段作为物种鉴定的通用DNA条形码^[6]。
真菌属于低等真核生物，其遗传物质分布于细胞核和线粒体中。近年来，随着测序成本的降低，有越来越多真菌的细胞核基因组和线粒体基因组被测序。然而，关于真菌线粒体DNA和核DNA进化速率比较的研究还较少。在环孢菌素产生菌膨大弯颈霉Tolypocladium inflatum中，基于全基因组序列的比较研究发现，核基因组的SNP频率(0.97%)是线粒体基因组SNP频率(0.12%)的8倍^[7]。然而，在人体致病菌耶氏肺孢子菌Pneumocystis jirovecii中，线粒体基因cob和rnl显示出比细胞核超氧化物歧化酶基因SOD更高的多态位点比例(1.57%vs. 0.39%)和更多的基因型(14-22 vs. 4)^[8]。为了详细了解真菌中线粒体DNA与核DNA的进化速率，需对更多真菌开展类似的比较研究。
真核生物体内线粒体基因组与细胞核基因组间可能存在一定程度的基因交流。核内线粒体DNA片段(nuclear mitochondrial DNA segments，简称Numts)，也叫线粒体假基因(mitochondrial pseudogenes)，是指从线粒体基因组转移并整合到细胞核基因组的DNA片段。在线粒体进化的早期，从线粒体到细胞核的DNA转移曾是大规模发生的事件。在现代生物中仍可能检测到这种DNA转移的证据，但在不同生物中，Numts的数量和长度差别较大^[9-10]。例如，小麦颖枯病病原颖枯壳针孢Phaeosphaeria nodorum的Numts含量是77 kb，而在黑曲霉Aspergillus niger中只有298 bp^[10]。
蛹虫草Cordyceps militaris (L.) Fr.是虫草属的模式种，主要寄生阔叶林或混交林地表土层中鳞翅目昆虫的蛹或幼虫。由于具有较高的医疗保健功效和经济价值，科研人员近些年从基因组^[11]、转录组^[12]、甲基化组^[13]、蛋白质组^[12]和代谢网络^[14]等多个角度对蛹虫草作了深入研究。近年来，本研究团队开展了蛹虫草的种内比较线粒体基因组学研究，发现由于内含子数目的差异(2-8个)，不同蛹虫草菌株的线粒体基因组大小存在较大变化，从26.5 kb到33.9 kb，相差约7 kb^[15]。进一步研究发现，在已知的8个内含子位点都具有内含子的基因型为蛹虫草较古老的线粒体基因型；在蛹虫草种内分化过程中，总体趋势是丢失线粒体内含子，但部分内含子可以发生“失而复得”和“得而再失”^[16]。
自蛹虫草菌株CM01的基因组通过二代测序技术完成测序后^[11]，科研人员又使用三代测序技术完成了对菌株01和ATCC 34164的基因组测序，尤其是菌株ATCC 34164的基因组被组装到了染色体水平(7条染色体)^[17]。这些核基因组数据为我们研究蛹虫草中的Numts提供了便利。另外，之前在筛选适于蛹虫草遗传多样性分析的线粒体分子标记时，我们比较了12个线粒体DNA片段与3个核DNA片段(ITS、交配型基因MAT1-1-1和MAT1-2-1)的序列，发现这些线粒体DNA片段比核DNA片段进化快^[18]。但之前研究中参与比较的核DNA片段较少，且有研究显示核糖体DNA信息位点的比例比蛋白编码基因少^[19]，因此，我们尚不能就此认定蛹虫草线粒体DNA比核DNA变异快。为了比较蛹虫草线粒体DNA与核DNA的进化关系，为真菌线粒体与核DNA进化关系比较提供更多例证，本研究首先分析蛹虫草核基因组中的Numts，然后利用已知线粒体基因组的10个蛹虫草菌株，比较核DNA与线粒体DNA在多个蛋白编码基因上的变异速率及所反映的蛹虫草菌株间的系统发育关系。本文的研究结果将丰富我们对蛹虫草线粒体与细胞核DNA进化关系的认识。
1 材料和方法 1.1 菌株培养与DNA提取 本研究共使用10株蛹虫草菌株(表 1)，均由本实验室保藏。将这些菌株按照张永杰等^[18]所描述的方法进行培养、菌丝体收集和总DNA提取。
表 1. 蛹虫草菌株核DNA片段的序列登录号 Table 1. Accession numbers of nuclear DNA fragments from various C. militaris isolates

Isolate	Accession number
	AD	GD	TA	CP	CS	EP	RF
V26-17	MK299434	MK299474	MK299493	MK299444	MK299454	MK299464	MK299485
V40-4	MK299437	MK299477	MK299496	MK299447	MK299457	MK299467	MK299487
V40-5	MK299438	MK299478	MK299497	MK299448	MK299458	MK299470	MK299489
CM09-9-24	MK299435	MK299475	MK299494	MK299445	MK299455	MK299465	MK299486
CM09-31-28	MK299436	MK299476	MK299495	MK299446	MK299456	MK299466	MK299490
CM552	MK299439	MK299479	MK299498	MK299449	MK299459	MK299468	-
CM01	MK299432	MK299472	MK299491	MK299442	MK299452	MK299462	MK299482
CM06	MK299433	MK299473	MK299492	MK299443	MK299453	MK299463	MK299484
F02	MK299441	MK299481	MK299500	MK299450	MK299461	MK299471	MK299488
CMB	MK299440	MK299480	MK299499	MK299451	MK299460	MK299469	MK299483
Refer to Zhang et al.[18] for sources of these isolates and their mitogenome accessions. It’s noted that we failed to amplify the RF fragment from CM552.

表选项






1.2 线粒体基因组内部重复序列的分析 在目前已知线粒体基因组的蛹虫草菌株中，菌株V40-5因具有8个内含子而代表了蛹虫草最大的线粒体基因组(33.9 kb)^[15]。为了分析蛹虫草线粒体基因组内部不同区域间是否存在较高的序列相似性，将菌株V40-5的线粒体基因组与其自身进行本地BLASTn分析^[20]，筛选和保留E值小于10^-5的比对结果。通过SSRIT (http://archive.gramene.org/db/markers/ssrtool)分析蛹虫草线粒体基因组中的简单序列重复(SSR)，设置最大基序(motif)长度为10，最小重复次数为5。
1.3 核内线粒体DNA片段的检测 目前，GenBank数据库中共有3个蛹虫草菌株(CM01、01和ATCC34164)的基因组组装数据。将这3个菌株的基因组组装数据分别下载到本地电脑，用菌株V40-5的线粒体基因组与其分别进行本地BLASTn^[20]和LAST搜索^[21]，筛选和保留E值小于10^-5的匹配结果。
1.4 核DNA片段的扩增与测序 从公布的蛹虫草CM01菌株的基因组组装数据中随机选择7个核基因(分散在染色体IV和VII上，BLAST显示全部为单拷贝基因)，利用在线程序Primer 3 (http://primer3.ut.ee/)设计扩增这7个基因的引物(表 2)。所设计的引物由金唯智生物科技有限公司(天津，中国)合成。从表 1所列的蛹虫草菌株中扩增这些核DNA片段。扩增产物由金唯智生物科技有限公司(天津，中国)利用Sanger法进行双向测序，测序结果使用软件Vector NTI Suite (Invitrogen，美国)中的ContigExpress进行拼接。
表 2. 扩增核基因片段的引物 Table 2. Primers used for amplifying nuclear DNA fragments

Fragmenta	Primer name	Primer sequence (5′→3′)	Annealing temp./℃	Amplicon/bp	Target locus b	Chromosomec
AD	AD-F	GCCAGGCCCTCTCTAAATCT	53	1508	CCM_05174	IV
	AD-R	GCTGCAACGGACAAACTCAT
CP	CP-F	ATCATGCCCTCCACCACTAC	53	1421	CCM_00072	VII
	CP-R	GCTGCGCTTCTTTTCCTTCT
CS	CS-F	CCAATACCGCACCTACAAGC	52	1386	CCM_05104	IV
	CS-R	AGGCGTTGCTGTGGATAGAT
EP	EP-F	TAGGAGCAAGCACAGACGTT	53	1606	CCM_05090	IV
	EP-R	ATTCAGCCGTCCCACAAAC
GD	GD-F	GCACTTCCAGCCTGAGTTG	53	1854	CCM_07752	VII
	GD-R	GAGTCTGCCACCAAACGTTC
RF	RF-F	AACCCTGTTCGAAGTTCTGC	53	1570	CCM_00093	VII
	RF-R	TCACCACTCTCTCCACCAAC
TA	TA-F	CCAACATCTTTCCCTCCACAC	53	1862	CCM_00163	VII
	TA-R	GAGTCGGTGCAGTTCTCGAA
a These nuclear genes encoded for ATP-dependent DNA helicase recQ (AD), cutinase palindrome-binding protein (CP), cell surface receptor/MFS transporter (CS), endonuclease/exonuclease/phosphatase family protein (EP), guanosine-diphosphatase (GD), RING finger domain-containing protein (RF), and threonine ammonia-lyase precursor (TA). b Target locus means in which gene locus each corresponding nuclear fragment is positioned in the CM01 reference genome by referring to Zheng et al[11].c Chromosome means in which chromosome each corresponding nuclear fragment is positioned by referring to Kramer & Nodwell[17].

表选项






1.5 线粒体DNA与核DNA变异频率的比较 本研究使用的多数核DNA片段和少数线粒体DNA片段中有内含子。有研究显示内含子与外显子序列的进化速率不同^[15]。因此，为使线粒体DNA与核DNA的比较更加客观，本研究只利用外显子序列进行后面的分析。用MEGA 6.06软件^[22]中的Muscle程序对获得的不同蛹虫草菌株的各个核DNA片段进行序列比对，用DnaSP 5.10^[23]软件统计各DNA片段上存在的变异碱基数、等位基因数和单元型多样性指数，用MEGA 6.06^[22]中的K2P模型计算菌株间的平均遗传距离和最大遗传距离。利用同样的方法统计不同蛹虫草菌株在各个线粒体DNA片段上的碱基变异情况。用软件TOPALI 2.5^[24]将不同的核DNA片段拼接在一起，将不同的线粒体DNA片段拼接在一起，用前述同样方法统计和比较线粒体DNA与核DNA总体的碱基变异情况。
1.6 线粒体DNA与核DNA系统发育关系的比较 首先，利用DnaSP 5.10软件^[23]对各核DNA片段和各线粒体DNA片段进行中性检验(包括Tajima’s D，Fu and Li’s D & F test)。然后，对符合中性假说的各核DNA片段间用PAUP 4.0b10软件(Sinauer Associates，美国)进行分区同质性检验(以P < 0.001作为判断是否显著冲突的阈值)，将不存在冲突的所有核DNA片段拼接成核DNA数据集。同理，将不存在冲突的所有线粒体DNA片段拼接成线粒体DNA数据集。最后，用PAUP 4.0b10软件构建最大简约树(MP)，用TreeMap 3b1243 (https://sites.google.com/site/cophylogeny)将线粒体DNA树和核DNA树关联起来；通过KH (Kishino-Hasegawa)和SH (Shimodaira-Hasegawa)检验(在PAUP软件中运算)明确线粒体DNA树和核DNA树之间是否存在显著的拓扑结构差异。
2 结果和分析 2.1 线粒体基因组内部的重复序列 将蛹虫草V40-5菌株的线粒体基因组与其自身进行本地BLASTn搜索，共输出22条具有较高相似性的比对结果(E值< 7E-6，相似性73.4%-96.4%，比对长度28-259 bp；表 3)，排除冗余后实际只有13条比对结果。其中，比对长度大于100 bp的仅有3条，分别对应rnl-i1非编码区和rnl-i2非编码区(比对长度259 bp，相似性88.4%)、rnl-i1内的orf245和rnl-i2内的orf253(171-174 bp，76.6%-77.0%)、rnl-i1内的orf245和cox2-i1内的orf286 (172 bp，73.8%)。此外，在蛹虫草线粒体基因组中检测到4个SSR，分别位于rnl、rns、cox1和nad1的外显子序列中，其中TA、AT、TAT和TAA分别重复5次。
表 3. 蛹虫草V40-5线粒体基因组自身及与3个核基因组本地BLAST搜索的结果 Table 3. Local BLAST analyses of the C. militaris V40-5 mitogenome against itself and against three nuclear genomes

Query start	Query end	Sequence ID	Target strain	Subject length/bp	Subject start	Subject end	Subject strand	Alignment length/bp	Percent identity/%	Bit score	E value
V40-5 mitogenome BLAST against itself
2063	2319	KP722501	V40-5	33967	717	973	+	259	88.42	309.0	8.00E-85
717	973	KP722501	V40-5	33967	2063	2319	+	259	88.42	309.0	8.00E-85
2629	2796	KP722501	V40-5	33967	1259	1429	+	174	77.01	91.6	3.00E-19
1259	1429	KP722501	V40-5	33967	2629	2796	+	171	76.61	91.6	3.00E-19
30227	30290	KP722501	V40-5	33967	29291	29354	+	64	90.62	86.1	1.00E-17
29291	29354	KP722501	V40-5	33967	30227	30290	+	64	90.62	86.1	1.00E-17
12735	12902	KP722501	V40-5	33967	1259	1429	+	172	73.84	63.9	7.00E-11
22558	22622	KP722501	V40-5	33967	19453	19519	+	69	84.06	62.1	2.00E-10
19453	19519	KP722501	V40-5	33967	22558	22622	+	69	84.06	62.1	2.00E-10
32092	32139	KP722501	V40-5	33967	7539	7585	+	48	87.50	54.7	4.00E-08
7539	7585	KP722501	V40-5	33967	32092	32139	+	48	87.50	54.7	4.00E-08
29296	29347	KP722501	V40-5	33967	22495	22546	+	52	84.62	52.8	1.00E-07
22495	22546	KP722501	V40-5	33967	29296	29347	+	52	84.62	52.8	1.00E-07
12808	12861	KP722501	V40-5	33967	2702	2755	+	54	83.33	51.0	5.00E-07
2702	2755	KP722501	V40-5	33967	12808	12861	+	54	83.33	51.0	5.00E-07
22572	22602	KP722501	V40-5	33967	5677	5708	+	32	93.75	47.3	7.00E-06
19468	19499	KP722501	V40-5	33967	5715	5686	-	32	93.75	47.3	7.00E-06
23086	23113	KP722501	V40-5	33967	5720	5693	-	28	96.43	47.3	7.00E-06
30232	30283	KP722501	V40-5	33967	22495	22546	+	52	82.69	47.3	7.00E-06
5693	5720	KP722501	V40-5	33967	23113	23086	-	28	96.43	47.3	7.00E-06
22495	22546	KP722501	V40-5	33967	30232	30283	+	52	82.69	47.3	7.00E-06
21286	21341	KP722501	V40-5	33967	31827	31881	+	57	82.46	47.3	7.00E-06
V40-5 mitogenome BLAST against nuclear genomes
31680	31726	CP023324	ATCC 34164	8286469	4750747	4750701	-	47	87.23	54.7	1.00E-05
21881	21946	CP023326	ATCC 34164	3849251	2877664	2877729	+	66	98.48	117.0	6.00E-25
9142	9184	MQTM01000005	01	4088212	3848337	3848295	-	43	93.02	63.9	8.00E-09
6431	6468	MQTM01000010	01	1886322	479668	479631	-	38	97.37	65.8	1.00E-09
31680	31726	MQTM01000012	01	1944127	1819799	1819753	-	47	87.23	54.7	2.00E-06
6431	6468	NW_006271974	CM01	3240361	2723649	2723686	+	38	97.37	65.8	2.00E-09
9142	9184	NW_006271970	CM01	5422368	5176892	5176850	-	43	93.02	63.9	1.00E-08
21881	21940	NW_006271975	CM01	2818147	1095496	1095439	-	60	93.33	87.9	3.00E-16
31680	31726	NW_006271973	CM01	3260156	659497	659543	+	47	87.23	54.7	4.00E-06
When performing BLAST analyses against nuclear genomes, three target strains (CM01, 01 and ATCC 34164), which have available nuclear genomes, were employed as listed in the “Target strain” column.

表选项






2.2 核内线粒体DNA片段的检测 将蛹虫草V40-5菌株的线粒体基因组与公布的3个蛹虫草菌株(CM01、01和ATCC34164)的核基因组序列分别进行BLASTn搜索，只输出2-4条比对长度为38-66 bp的结果(相似性87.2%-98.5%；表 3)，进行LAST搜索的结果只比BLASTn多找出1个比对结果(表 4)。这些结果说明，蛹虫草核基因组中的Numts数量有限(最多5条)，总长只有278 bp。蛹虫草线粒体与细胞核基因组间已检测不到长片段的基因交流事件。
表 4. 蛹虫草V40-5线粒体基因组与3个核基因组的LAST搜索 Table 4. LAST searches of the C. militaris V40-5 mitogenome against three nuclear genomes

Query start	Query end	Query position	Subject sequence ID	Subject strain	Subject start	Subject end	Subject position	Alignment length/bp	Percent identity/%	Bit score	E value
21881	21946	cox1-E2	CP023326	ATCC 34164	2877664	2877729	chr III	66	98.48	103	2.60E-19
31748	31680	cox3-i1	CP023324	ATCC 34164	4750679	4750747	chr VII	69	76.81	60.1	1.90E-06
11326	11265	nad3	CP023325	ATCC 34164	3508316	3508377	chr V	62	77.42	55.3	5.00E-05
11265	11326	nad3	MQTM01000013	01	617828	617889	Contig 10	62	82.26	64.8	6.80E-08
31748	31680	cox3-i1	MQTM01000012	01	1819731	1819799	Contig 7	69	78.26	63.2	2.00E-07
9184	9142	trnQ	MQTM01000005	01	3848295	3848337	Contig 2	43	93.02	60.1	1.80E-06
6468	6431	rnl-i4	MQTM01000010	01	479631	479668	Contig 8	38	97.37	58.5	5.40E-06
11265	11326	nad3	NW_006271969	CM01	5079784	5079845	CCM_S00001	62	82.26	64.8	6.70E-08
31680	31748	cox3-i1	NW_006271973	CM01	659497	659565	CCM_S00005	69	78.26	63.2	2.00E-07
6431	6468	rnl-i4	NW_006271974	CM01	2723649	2723686	CCM_S00006	38	97.37	58.5	5.40E-06
21946	21881	cox1-E2	NW_006271975	CM01	1095433	1095496	CCM_S00007	66	90.91	75.9	3.10E-11
9184	9142	trnQ	NW_006271970	CM01	5176850	5176892	CCM_S00002	43	93.02	60.1	1.80E-06

表选项






2.3 线粒体与细胞核DNA变异频率的比较 除从CM552菌株中未扩增到核DNA片段RF外，我们从所有蛹虫草菌株中扩增到了本研究涉及的所有DNA片段(7个核DNA片段和14个线粒体DNA片段)。这些片段在外显子序列上均不存在碱基的插入缺失现象。不同核DNA片段或线粒体DNA片段的碱基变异程度不同(表 5)。供试菌株在7个核DNA片段上均表现出不同程度的遗传分化，而在14个线粒体DNA片段中，atp8、atp9和nad6这3个基因非常保守(无碱基变化)，其他线粒体DNA片段均存在碱基变化。整体而言，核DNA的变异频率略高于线粒体DNA (SNP频率1.24% vs. 0.71%)。核DNA片段在遗传距离、等位基因数及单元型多样性指数等指标上也比多数线粒体DNA片段高。
表 5. 不同蛹虫草菌株在各DNA片段上的碱基变异情况 Table 5. Nucleotide variations on each DNA fragment among different C. militaris isolates

Locus	Length/bp	Variable sites				Overall distance	Max. distance	Allele	Hd
		Pi	S	SNP	%
Nuclear loci
AD	1198	5	7	12	1.00	0.0034	0.0076	5 (4)	0.80
CP	1224	5	0	5	0.41	0.0020	0.0041	5 (5)	0.76
CS	1226	19	17	36	2.94	0.0100	0.0150	7 (4)	0.87
EP	1384	14	7	21	1.52	0.0057	0.0096	7 (3)	0.91
GD	1679	9	3	12	0.71	0.0027	0.0042	6 (3)	0.89
RF	1435	2	5	7	0.49	0.0014	0.0028	5 (4)	0.81
TA	1663	11	18	29	1.74	0.0055	0.0092	6 (4)	0.84
Sum (nr)	9809	65	57	122	1.24	-	-	-	-
Mitochondrial loci
atp6	783	0	4	4	0.51	0.0010	0.0039	4 (7)	0.53
atp8	147	0	0	0	0.00	0.0000	0.0000	1 (10)	0.00
atp9	225	0	0	0	0.00	0.0000	0.0000	1 (10)	0.00
cob	1161	4	4	8	0.69	0.0026	0.0061	5 (4)	0.80
cox1	1593	4	5	9	0.56	0.0018	0.0044	6 (5)	0.78
cox2	750	7	2	9	1.20	0.0055	0.0095	6 (4)	0.84
cox3	810	0	11	11	1.36	0.0028	0.0139	2 (9)	0.20
nad1	1104	3	3	6	0.54	0.0020	0.0036	4 (5)	0.71
nad2	1686	3	7	10	0.59	0.0017	0.0054	5 (4)	0.82
nad3	420	1	0	1	0.24	0.0013	0.0024	2 (5)	0.56
nad4	1449	2	7	9	0.62	0.0017	0.0049	4 (4)	0.73
nad4L	270	3	0	3	1.11	0.0062	0.0114	3 (5)	0.64
nad5	1995	12	10	22	1.10	0.0043	0.0086	4 (5)	0.71
nad6	633	0	0	0	0.00	0.0000	0.0000	1 (10)	0.00
Sum (mt)	13026	39	53	92	0.71	0.0024	0.0046	7 (4)	0.87
Pi: parsimony informative sites; S: singleton sites; SNP: single nucleotide polymorphism sites (=Pi+S); Hd: haplotype diversity. For the allele column, we listed the number of total alleles (outside parentheses) and the number of individuals represented by the dominant allele (within parentheses). For the nuclear locus RF, all data were from 9 isolates; for all other loci, the data were from 10 isolates. In order to make the comparison between mitochondrial DNA fragments and nuclear DNA fragments more objective, this study only used the exon sequences although most nuclear fragments and some mitochondrial fragments contained introns.

表选项






2.4 线粒体与细胞核DNA系统发育关系的比较 根据中性检验的结果，线粒体DNA片段cox3和nad4L不符合中性假说(P < 0.05)，而其他的线粒体DNA片段和所有的核DNA片段都符合中性假说。根据分区同质性检验的结果，核DNA片段EP与其他核DNA片段间存在明显冲突(P < 0.001)，剩余的核DNA片段间及符合中性假说的12个线粒体DNA片段间均不存在冲突。同时，又由于有1个菌株(即CM552)缺少核DNA片段RF的序列，因此，我们将除EP和RF外的5个核DNA片段组成最终的核DNA数据集(总长6990 bp)，将12个线粒体DNA片段组成最终的线粒体DNA数据集(总长11946 bp)。用这两个数据集分别构建MP系统发育树，其拓扑结构存在差异(图 1)，进一步通过KH和SH检验发现这种差异达到极显著水平(P < 0.0001)。

图 1 核DNA(左)与线粒体DNA(右)系统发育树拓扑结构的比较 Figure 1 Comparison between nuclear DNA (nr DNA, left) and mitochondrial DNA (mt DNA, right) phylogenies. Bootstrap values for nodes receiving a bootstrap value larger than 70% were marked.

图选项

3 讨论 线粒体被普遍认为起源于寄生在真核生物共同祖先细胞内的远古细菌(很可能是某种α-变形菌)。与自由生活的α-变形菌相比，线粒体基因组只编码少数功能基因，而多数功能基因可能转移到了细胞核基因组内或被其他具有类似功能的核基因所代替^[25]。Hazkani-Covo et al. (2010)分析了85种真核生物中的核内线粒体DNA片段(Numts)，发现不同生物中Numts的数量和长度存在较大差异^[10]。我们首次检测了蛹虫草中的Numts，仅检测到5个较短的Numts (单个Numt < 70 bp，总长278 bp)，没有发现线粒体与核基因组间长片段的基因交流事件。然而，在另外一些真菌中仍能检测到线粒体与细胞核基因组间长片段的基因交流，如在膨大弯颈霉中存在1条652 bp的Numt^[7]，在肺囊康定产生菌Glarea lozoyeneis中存在4条长度超过388 bp的Numts (最长的达到3.9 kb)^[26]。同时，本研究还发现不同蛹虫草菌株中的Numts数量存在差异(表 4)，这可能是由于某些Numts在插入核基因组后发生了突变或丢失而无法被检测到。
在真核生物线粒体和细胞核内存在的这两套基因组的变异情况如何一直是人们感兴趣的话题。在目前研究过的多数植物中，线粒体DNA的变异速率比核DNA慢，而在多数动物中，线粒体DNA的变异速率比核DNA快^[5]。真菌中开展过类似比较的研究还不多见。最近，通过系统总结涉及真菌线粒体DNA与核DNA进化速率比较的文献，我们发现与植物类似，多数真菌具有较慢的线粒体DNA进化速率和较快的核DNA进化速率^[27]。本研究关于蛹虫草的研究结果与此一致。通过对多个蛋白编码基因外显子区的序列比较，我们发现蛹虫草核DNA的变异速率是线粒体DNA变异速率的1.7倍(SNP频率1.24% vs. 0.71%)。
之前在筛选适于蛹虫草遗传多样性分析的线粒体分子标记时，我们曾报道线粒体DNA比参与比较的核DNA进化快^[18]。造成该结果与本文结论差异的原因可能是由于之前研究中选用的核DNA片段(ITS、交配型基因MAT1-1-1和MAT1-2-1)恰好较保守。由于蛹虫草为异宗配合真菌，一个菌株通常只有MAT1-1-1或MAT1-2-1，因此本研究筛选核DNA片段时没有选用交配型基因。本文只对线粒体和核基因组中的蛋白编码基因作了比较，核糖体RNA和非编码区是否也是同样的结果仍有待以后深入研究。
本研究发现线粒体DNA和核DNA反映的不同蛹虫草菌株间的系统发育关系并不完全一致。类似的现象在其他真菌中亦有报道^[28]。造成这种差异的原因可能主要是由于线粒体DNA与核DNA的遗传机制不同。细胞核DNA遵守典型的孟德尔遗传规律，可通过有性繁殖进行遗传重组，而线粒体DNA不遵守典型的孟德尔遗传规律，以克隆繁殖和单亲遗传为主^[29]。线粒体DNA与核DNA的差异还表现在一个细胞内通常只有一个或少数几个核基因组拷贝(取决于倍性及细胞核的数目)，却有大量的线粒体基因组拷贝。核DNA的复制和分裂与细胞有丝分裂同步，经过复制的核基因组受到严密的调控而平均分配给子细胞，然而线粒体的复制和分裂与细胞有丝分裂并不同步，线粒体DNA随机分配给子细胞。

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