李兰1, 郑其升1
, 侯继波1,2 1. 江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心, 江苏 南京 210014;
2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 江苏 扬州 225009
收稿日期：2018-10-30；修回日期：2019-01-17；网络出版日期：2019-03-13
基金项目：国家自然科学基金（31772701）；江苏省农业科技自主创新资金[CX（18）3011]
*通信作者：郑其升, Tel/Fax:+86-25-84392008, E-mail:immun_tech@163.com;
侯继波, Tel/Fax:+86-25-84392008, E-mail:houjiboccvv@163.com.
摘要：来源于海洋红藻的凝集素G已被证实对多种囊膜病毒都有抗病毒活性，可与囊膜病毒表面糖基结合而阻断病毒的入侵。以病毒入侵为作用靶点的抗病毒药物，不仅可以阻断病毒的自由传播途径，还可以阻断细胞间传播途径，红藻凝集素G还具有可溶性好、易表达、稳定性强、免疫原性低、安全性好等优点，所以红藻凝集素G作为一类新型抗病毒药物越来越受到科学家的青睐。
关键词：凝集素囊膜病毒糖蛋白抗病毒安全性
Research progress of griffithsin
Lan Li1, Qisheng Zheng1
, Jibo Hou1,2 1. National Research Center of Engineering and Technology for Veterinary Biologicals, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, Jiangsu Province, China;
2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, Jiangsu Province, China
Received: 30 October 2018; Revised: 17 January 2019; Published online: 13 March 2019
*Corresponding author: Qisheng Zheng, Tel/Fax: +86-25-84392008, E-mail: immun_tech@163.com;
Jibo Hou, Tel/Fax: +86-25-84392008, E-mail: houjiboccvv@163.com.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31772701) and by the Jiangsu Agriculture Science and Technology Innovation Fund (CX(18)3011)
Abstract: Griffithsin, originally isolated from Griffithsia spp. marine red algae., is a broad-spectrum antiviral lectin that inhibits viral entry through binding to viral glycoproteins. Drugs that inhibit virus's entry prevent infection of cells by cell-free virus particles and also prevent virus transmission between virus-infected and uninfected cells. Besides, griffithsin also has the advantages of good solubility, easy expression, strong stability, low immunogenicity and good safety. Thus, griffithsin, as a new potential class of antiviral drugs, has got the favor of scientists.
Keywords: lectinviral envelope glycoproteinsantiviralsafety
红藻凝集素G最初是由美国国家癌症研究院(National Cancer Institute，NCI)于2005年从海洋红藻(Griffithsia sp.)中分离到的一种藻类凝集素[1]，是目前报道的最有效的抗人体免疫缺陷病毒(HIV)药物，可在皮摩尔浓度范围内抑制HIV对靶细胞的感染，科学家们正在将其开发成一种抗HIV药物。另外其对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)[2]、严重急性呼吸窘迫综合征冠状病毒(SARS-CoV)、丙型肝炎病毒(HCV)[3-4]、中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)[5]、日本脑炎病毒(JEV)[6]等囊膜病毒也具有较强的抗病毒作用，笔者最新发现红藻凝集素G对猪流行性腹泻病毒(PEDV)也具有抑制作用，本文对红藻凝集素G的结构、稳定性、抗病毒作用、药代动力学参数及安全性等方面进行了阐述，以期为其进一步开发利用提供参考。
1 结构及稳定性 红藻凝集素G在天然状态下以结构域互换的同源二聚体存在[7](图 1-A)，其中第15-19位氨基酸(Phe15-Ser16-Gly17-Leu18-Ser19)编码铰链区，负责2个亚基之间的连接，当于16与17位之间插入Gly-Ser两个氨基酸时则不能形成二聚体，只能以单体的形式存在[8]。圆二色谱分析表明红藻凝集素G的主要二级结构是β-折叠片(表 1)[2]，在220.5 nm处有一正峰，在199.5 nm处有一负峰(图 2)，与先前的报导是一致的[7, 9]。红藻凝集素G任一亚基均由3个重复单位组成，包括4股反向平行的β-折叠片，其中1个亚基的2股β-折叠片与另外1个亚基的10股β-折叠片进行连接，反之亦然[7]。
 |
| 图 1 红藻凝集素G结构模式图[7, 9] Figure 1 The structure of griffithsin[7, 9]. |
| 图选项 |
表 1. 圆二色谱法鉴定重组蛋白红藻凝集素G的二级结构组成 Table 1. Secondary structure composition of recombinant griffithsin determined from its CD spectrum
| Sample | α-helix/% | β-sheet/% | β-turn/% | Random coil/% |
| Griffithsin | 23.1 | 51.1 | 21.6 | 4.3 |
表选项
 |
| 图 2 重组蛋白红藻凝集素G的圆二色谱图[2] Figure 2 CD spectrum of recombinant griffithsin[2]. |
| 图选项 |
单体红藻凝集素G分子量为12.7 kD，由121个氨基酸残基组成，无半胱氨酸，第31位为分子量151.05 Da的未知氨基酸，由丙氨酸代替时其抗病毒活性不受影响[1]。氨基酸序列分析发现其单体包含3个重复单位(图 1-B)，于8-12、40-44和86-90位存在着高度保守的氨基酸序列Gly-Gly-Ser-Gly-Gly，起着连接的作用。第30、70和102位氨基酸均为天冬氨酸，为3个糖基结合位点。红藻凝集素G具有极好的稳定性，在有机溶剂、强酸、高温、反复冻融等条件下仍保持活性[10]，另外研究人员还研究了红藻凝集素G对9种蛋白酶的稳定性，结果显示对其中8种是耐受的，仅对一种表现出敏感性[11]。
2 抗病毒作用 红藻凝集素G对多种囊膜病毒都表现出了较强的抑制作用。笔者发现红藻凝集素G对PRRSV和PEDV均具有较强的抗病毒活性，通过阻断病毒吸附而发挥作用[2]；2005年，Mori等[1]首次研究发现红藻凝集素G可以降低HIV对CEM-SS细胞的感染，随后大量研究表明红藻凝集素G在皮摩尔浓度范围内即可发挥强烈的抗HIV-1作用，红藻凝集素G通过与HIV-1表面囊膜糖蛋白gp120的结合，进而影响病毒与受体CD4及共受体CCR5和CXCR4的相互作用，从而阻断病毒入侵靶细胞的过程[12]。红藻凝集素G既可阻断HIV胞外自由扩散途径，又可阻断细胞间传播途径[13]，这种特性使其优于其他大多数抗病毒药物；红藻凝集素G还能够抑制严重急性呼吸窘迫综合征冠状病毒(SARS-CoV)对Vero细胞的感染，这种抑制作用与表面糖蛋白S有关，但与HIV作用不同的是，红藻凝集素G与S蛋白结合后不会影响病毒识别受体[7]，利用小鼠模型评价红藻凝集素G对SARS-CoV感染的效果，结果表明接受红藻凝集素G治疗的小鼠体重没有减轻，存活率为100%，而没有接受治疗的小鼠体重下降了25%，存活率仅为30%[14]；研究还发现红藻凝集素G对单纯疱疹病毒(HSV-2)有抗病毒效果，主要通过阻断HSV-2细胞间传播而发挥作用，对病毒入侵几乎没有影响[15]；另外红藻凝集素G对丙型肝炎病毒(HCV)[3-4]、中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)[5]、日本脑炎病毒(JEV)[6]等囊膜病毒也表现出不同程度的抑制作用。特别的，红藻凝集素G对非囊膜病毒人乳头瘤病毒(HPV)[16-17]也具有抑制作用，通过与HPV受体整合素α6的结合，进而影响HPV的内化阶段，但对病毒吸附没有影响。综上所述，现有研究结果大多显示红藻凝集素G通过与囊膜病毒表面的糖基结合，进而发挥其抗病毒作用。
作为一种高甘露糖型凝集素，红藻凝集素G对囊膜病毒表现出不同程度的抗病毒活性，其中对HIV的抑制作用是最强的。造成这种差异的原因尚不清楚，笔者推测可能与囊膜病毒表面的糖蛋白有关，如糖基组成结构和糖基化程度、囊膜病毒表面纤突数量。对于HIV，其表面糖蛋白gp120是自然界中糖基化程度最高的糖蛋白之一，约占其分子量的50%左右[18]；另外每个病毒粒子平均只有14个纤突(而对于A型流感病毒多达450个)，仅4个纤突就可介导病毒的入侵[19]，由此我们可以推断，为阻断1个HIV病毒粒子感染靶细胞，红藻凝集素G仅需对抗4个纤突即可，这或许可以解释为什么红藻凝集素G对HIV作用较其他囊膜病毒强。
3 重组表达 利用基因工程技术表达重组红藻凝集素G，为其研究提供稳定的物质基础是非常必要的。因此，研究人员先后尝试了多种表达系统(表 2)，以期获得表达量高、易纯化、易储存、安全性好的重组红藻凝集素G。研究人员首先采用pET 28a (+)表达载体在E. coli BL21(DE3)中进行表达，利用IPTG进行诱导表达时，大部分红藻凝集素G在包涵体中以不可溶的形式存在，为使红藻凝集素G获得可溶性表达，研究人员更换培养基进行自诱导表达，其可溶性大大提高，表达量也提高了45倍[20]；笔者采用pET 32a (+)表达载体在经研究团队改造的E. coli BL21(DE3)中利用IPTG进行诱导表达时，获得了可溶性表达，表达量可达88 mg/L；利用烟草花叶病毒(TMV)载体在烟草中进行表达也有报道[13, 21-22]，值得一提的是Fuqua等[21]利用红藻凝集素G极好的热稳定性对其实现了初步分离，在50-80 ℃条件下，除TMV外壳蛋白外，绝大部分杂蛋白因变性而沉淀出来，通过离心即可得到相对较纯的红藻凝集素G；还有研究人员利用农杆菌转化法使红藻凝集素G基因整合到烟草基因组中，实现了红藻凝集素G的稳定表达[23]；利用叶绿体表达系统在烟草中也成功表达了红藻凝集素G[24]，该研究还显示收获的转基因烟草干燥后于室温放置长达10个月，红藻凝集素G仍稳定存在，且其抗病毒活性不受影响；另外，水稻胚乳作为公认的表达药用重组蛋白的理想工具，Vamvaka等[25]尝试了利用水稻胚乳表达系统生产红藻凝集素G，以期获得易储存、安全性更好的红藻凝集素G。
表 2. 重组红藻凝集素G的表达 Table 2. The expression of recombinant griffithsin
| Expression system | Yield | Recovery after purification | Ref. |
| E. coli BL21(DE3)-shake flasks | 12 mg/L | [20] | |
| E. coli BL21(DE3)-fermenter | 819 mg/L | 542 mg/L | [20] |
| Tobacco leaves (transient expression) | 1 g/kg leaf | 300 mg/kg leaf | [21] |
| Tobacco leaves (stable expression) | 400 mg/kg leaf | 287 mg/kg leaf | [23] |
| tobacco chloroplasts | 287 mg/kg leaf | [24] | |
| Rice seeds (oryza sativa endosperm) | 301 mg/kg dry seed | 223 mg/kg | [25] |
表选项
4 药代动力学 Barton研究团队对红藻凝集素G的药代动力学进行了较为深入的研究。分别采用静脉注射、皮下注射和口服途径给予大鼠红藻凝集素G，皮下给药途径可被机体吸收进入血液，血药浓度于给药后4 h达到峰值，直到96 h仍能检测到红藻凝集素G的存在，同时在肾脏、肝脏和脾脏也能检测到红藻凝集素G的分布；静脉给药途径没有吸收过程，迅速进入血液，其清除速率也较皮下给药快，具体见表 3；口服给药途径不能被机体吸收进入血液，但在粪便中可以检测到红藻凝集素G的存在[26]。此外该研究团队还证实，给予大鼠红藻凝集素G后，采集血液，分离血清，体外试验表明该血清具有中和病毒的能力[27]。
表 3. 全身给药48 h内红藻凝集素G的药代动力学参数[26] Table 3. Pharmacokinetic parameters of griffithsin within 48 h of systemic administration[26]
| Parameter | Unit | Intravenous/(mg/kg) | Subcutaneous/(mg/kg) | |||
| 10 | 20 | 10 | 20 | |||
| Absorption half life | h | 0.5±0.1 | 0.5±0.2 | 1.3±0.3 | 1.6±0.4 | |
| Distribution half life | h | 1.7±0.3 | 2.1±0.7 | 2.1±0.9 | 2.8±1.2 | |
| Elimination half life | h | 10.7±4.6 | 17.5±6.1 | 13.8±6.8 | 6.6±1.9 | |
| AUC | (mg·h)/L | 105.7±16.9 | 203.6±27.6 | 45.6±9.9 | 183.2±45.3 | |
| VD | L | 0.4±0.1 | 0.6±0.2 | 1.2±0.6 | 0.2±0.1 | |
| Clearance | L/h | 0.03±0.01 | 0.02±0.01 | 0.06±0.01 | 0.02±0.01 | |
| Cmax | μg/mL | 81.8±25.7 | 176.0±26.7 | 6.6±0.6 | 19.7±2.4 | |
表选项
5 安全性 红藻凝集素G作为一种极具潜力的抗病毒药物，其安全性也备受关注，研究人员对其安全性进行了广泛的研究。
首先，红藻凝集素G作为一种凝集素，血凝性是其安全性评价的重要指标，2006年，人SP-A作为抗病毒药物进入Ⅰ期临床试验，后来研究证明SP-A能够干扰人的凝血系统，临床试验被迫停止[29]，所以检测红藻凝集素G对红细胞的凝集性非常重要，可喜的是红藻凝集素G仅能够凝集豚鼠红细胞，对人、绵羊、鸡、猪和小鼠红细胞均不会产生凝集[27]。其次，还有研究详细检测了红藻凝集素G对血液指标及血液生化指标的影响，结果显示红藻凝集素G对白细胞、红细胞和血小板等相关指标基本没有影响，具体见表 4[28]，另外对白蛋白、谷丙转氨酶、淀粉酶、血糖、血尿素氮、钙、肌酐、球蛋白、磷和总胆红素等血液生化指标也基本没有影响，但可轻微上调碱性磷酸酶和胆固醇的含量。第三，当小鼠给予10 mg/kg的红藻凝集素G时，不会引起小鼠的死亡，同时对其行为特征、体重没有影响，另外对心、肝、肺和肾等脏器重量也没有影响，可引起脾脏肿大，但2 d后，脏体比恢复至正常，病理学观察一切正常[28]。第四，红藻凝集素G作为一种异源蛋白质，其对免疫系统的影响是一个极其重要的考察因素，初步研究表明红藻凝集素G表现为弱免疫原性，在血清中检测不到抗体的存在[27]，虽然可与PBMC结合，但不会引起PBMC的活化或增殖[28]，另外对细胞因子的影响也可忽略不计[30]。
表 4. 红藻凝集素G对大鼠血液指标的影响[28] Table 4. Effect of griffithsin on a mouse hematological profile
| Cell type | Parameter | Unit | 14 d | 21 d | |||
| PBS | Griffithsin | PBS | Griffithsin | ||||
| Leucocytes | WBC | k/μL | 7.9±1.5 | 7.2±0.5 | 8.3±2.4 | 8.5±1.6 | |
| NE | k/μL | 1.7±0.6 | 2.7±0.2 | 2.1±1.3 | 2.9±1.0 | ||
| LY | k/μL | 5.4±0.7 | 3.6±0.4 | 5.0 ±0.6 | 4.3±0.4 | ||
| MO | k/μL | 0.6±0.1 | 0.6±0.1 | 0.9±0.2 | 1.0±0.5 | ||
| EO | k/μL | 0.2±0.1 | 0.3±0.1 | 0.2±0.3 | 0.3±0.1 | ||
| BA | k/μL | 0.1±0.0 | 0.1±0.0 | 0.1±0.1 | 0.1±0.0 | ||
| Erythrocytes | RBC | m/μL | 9.4±0.5 | 9.1±0.7 | 9.8±1.1 | 10.1±2.3 | |
| Hb | g/dL | 14.2±1.0 | 13.2±1.1 | 15.0±0.8 | 15.1±4.0 | ||
| HCT | % | 57.9±5.3 | 56.2±5.5 | 59.4±6.2 | 60.1±14.9 | ||
| MCV | fL | 61.4±2.6 | 61.7±1.2 | 60.6±3.4 | 59.3±1.5 | ||
| MCH | pg | 15.1±0.4 | 14.5±0.6 | 15.3±0.9 | 14.8±0.7 | ||
| MCHC | g/dL | 24.5±0.6 | 23.5±1.0 | 25.3±1.7 | 25.0±0.6 | ||
| RDW | % | 17.3±0.9 | 18.2±0.5 | 18.0±0.4 | 18.5±0.4 | ||
| Thrombocytes | PLT | k/μL | 1571±100 | 1397±302 | 850±43 | 949±211 | |
| MPV | fL | 3.6±0.1 | 3.7±0.3 | 3.6±0.2 | 3.8±0.2 | ||
表选项
6 红藻凝集素G在兽医领域应用展望 随着对凝集素结构与生物功能的研究，人类已经意识到凝集素的重要价值，近几十年来，关于凝集素的研究取得了重大进展，凝集素家庭成员不断增加，并且其功能也从最初的凝集血红细胞，发展到现在许多领域。红藻凝集素G作为一种来源于海洋红藻的凝集素，利用其识别并结合糖基的高度特异性，可以将其作为生物工具应用到不同的领域，如分离纯化、治疗及预防等。红藻凝集素G在人医领域研究较多，而在兽医领域未见其他相关报道。
在分离纯化方面，笔者进行了初步的探索[31]，笔者基于红藻凝集素G建立了一种基于GEM (革兰氏阳性增强基质，Gram-positive enhancer matrix，GEM)颗粒表面展示技术的PRRSV疫苗病毒纯化方法，其中具有锚定作用的接头蛋白是实现病毒纯化的关键，该接头蛋白由锚定结构域与红藻凝集素G结构域组成，首先凝集素结构域与PRRSV进行特异性结合，然后加入GEM颗粒，锚定结构域与GEM颗粒进行特异性结合，通过一步低速离心将PRRS病毒粒子抓取出来，并富集于GEM颗粒表面，从而实现病毒的浓缩纯化[31]，大量研究证明红藻凝集素G的微生物结合谱非常广泛，可以与多种囊膜病毒结合，提示笔者建立的病毒纯化方法具有广泛的应用，理论上不仅可以纯化PRRSV，还可以纯化所有可以与红藻凝集素G结合的病毒。
以病毒入侵作为作用靶点的抗病毒药物有其独特的优势，不仅可以阻断健康细胞的感染，还能阻断感染细胞向健康细胞传播病毒的途径，所以凝集素在人医领域已被列为抗HIV的潜在药物。目前，红藻凝集素G被认为是最有效的抗HIV药物之一，通过与HIV表面糖蛋白相互作用来阻断病毒进入，皮摩尔浓度范围即可发挥较强的抗病毒活性，为此，笔者探索了红藻凝集素G对猪的两种重要传染病的抑制作用，体外研究结果表明红藻凝集素G对PRRSV和PEDV具有较强的抗病毒作用，可以尝试将红藻凝集素G在甘薯中进行表达，甘薯作为一种食物来源，饲喂患病动物，治疗由病毒引起的传染性疾病。
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