刘海1#, 赵婧1,2#, 李雪兵1, 刘鹏飞1, 罗廷英2, 张永军1,2
1.西南大学生物技术中心, 重庆 400715;
2.西南大学植物保护学院, 重庆 400715
收稿日期：2016-12-23；修回日期：2017-03-06；网络出版日期：2017-05-11
基金项目：国家自然科学基金（30871668）
*通信作者：张永军, Tel: +86-23-68250042; Fax: +86-23-68251883; E-mail: yjzhang@swu.edu.cn
#并列第一作者
摘要：[目的]探究腺苷酸糖基化因子ARF在球孢白僵菌（Beauveria bassiana）中存在种类及生物学功能。[方法]利用BLASTp搜索球孢白僵菌非冗余蛋白数据库，鉴定ARF并进行聚类分析，结合表达分析、反义抑制、超量表达野生型基因和GTP解离位点与结合位点突变的基因，解析其中1个ARF与白僵菌发育分化、逆境胁迫反应和毒力的关系。[结果]球孢白僵菌中存在至少6个ARF或类似蛋白，分别聚类于酵母、人类ARF及其类似蛋白的不同类群。其中BBA_01574与人类的ARF3、ARF4和ARF5聚为一类，命名为BbarfA。BbarfA在成熟的分生孢子和球形膨大时期表达明显高于芽管伸长期。反义抑制BbarfA加速了孢子萌发，提高了菌株毒力，而超量表达BbarfA和点突变GTP解离区域的BbarfA则延迟了孢子萌发速度，降低了菌株毒力。尽管BbarfA转录受高盐、髙渗、氧化和高温胁迫的诱导，但遗传修饰的转化子与野生菌株对上述胁迫反应的敏感性无明显差异。[结论]BbarfA介导分生孢子萌发和毒力。
关键词： 腺苷酸核糖基化因子 球孢白僵菌 孢子萌发 毒力
An ADP-ribosylation factor, BbarfA, is involved in conidial germination and virulence in Beauveria bassiana
Liu Hai1#, Zhao Jing1,2#, Li Xuebing1, Liu Pengfei1, Luo Tingying2, Zhang Yongjun1,2
1.Biotechnology Research Center, Southwest University, Chongqing 400715, China;
2.College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400715, China
Received 23 December 2016; Revised 6 March 2017; Published online 11 May 2017
*Corresponding author: Yongjun Zhang, Tel: +86-23-68250042; Fax: +86-23-68251883; E-mail: yjzhang@swu.edu.cn
Supported by the National Natural Science Foundation of China (30871668)
#These authors contributed equally to this work
Abstract: [Objective]To understand the number of ADP-ribosylation factor (ARFs) and their roles in Beauveria bassiana.[Methods]ARFs were identified by BLASTp searching against the database of B. bassiana proteins and analyzed using molecular phylogenetics. Role of an ARF in fungal growth, stress responses and virulence was characterized by analysis of the gene transcription pattern, and investigation of the genetically modified B. bassiana strains.[Results]At least six ARFs and ARF-like proteins (ARFLs) were identified in B. bassiana, which were distributed in different groups of yeast Saccharomyces cerevisiae and human Homo sapiens ARFs and ARFLs. One of ARFs, BBA_01574, designated BbarfA, was clustered in the group of human ARF3, ARF4 and ARF5. Transcription levels of BbarfA were obviously higher in the mature conidia or during the isotropic growth (swelling) phase of conidia than those during germ tube elongation phase. Antisense inhibition of BbarfA accelerated conidial germination and resulted in an increase in fungal virulence, whereas overexpression of BbarfA and the gene with site-mutation in GTP-binding sequences (BbarfAQ71I) caused the opposite phenotypes. Although expression of the gene was induced by high salt, osmotic, oxidative and high temperature stresses, no obvious difference was noted in sensitivities to these adverse stresses in all the genetically modified transformants, which included strains suppressing (by antisense inhibition) or overexpressing BbarfA, overexpressing the genes with site-mutation in GTP-dissociating (BbarfAD26G) or GTP-binding (BbarfAQ71I) sequences, and the wild type strains.[Conclusion]ADP-ribosylation factor, BbarfA, was involved in conidial germination and virulence in B. bassiana.
Key words: ADP-ribosylation factor Beauveria bassiana conidial germination virulence
腺苷酸核糖基化因子(ADP-ribosylation factor，ARFs)属于小G蛋白(GTP-binding proteins)超家族中的ARF亚族，分子量约为21 kDa，在真核生物中普遍存在并高度保守[1]，调节囊泡运输、磷脂代谢、细胞骨架重构等生物学过程[2]。ARFs是一个多基因家族，根据氨基酸序列相似性可将其分为3个类别(Class)。在哺乳动物中至少有6个ARF蛋白，其中ARF1、ARF2和ARF3聚为类别Ⅰ (Class Ⅰ)，ARF4和ARF5聚为类别Ⅱ (Class Ⅱ)，ARF6则单独聚为类别Ⅲ (Class Ⅲ)[3-4]。人类Class Ⅰ ARFs (ARF1和ARF3)定位于高尔基体复合体。ARF1和ARF3的相似性大于96%，均是该家族中高丰度表达的蛋白。Class Ⅱ ARFs (ARF4和ARF5)是低丰度表达蛋白，但在早期分泌途径中对于维持高尔基体结构和参与膜运输等生物学过程至关重要[5]。相反，Class Ⅲ ARFs (ARF6)则定位于细胞膜，调控内吞作用、肌动蛋白和质膜重构[6]。在真菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中仅存在2个Class Ⅰ ARF蛋白(ARF1和ARF2)和一个Class Ⅲ蛋白(ARF3)，但缺少Class Ⅱ ARF蛋白[3]。另外，真核细胞中也存在多种ARF类似蛋白(ARF-like，简称为ARL或ARFL)，与高尔基体复合物相关[7]。
ARFs的调控机制与异源三聚体G蛋白不同，其“分子开关”作用的发挥依赖于与其关联的蛋白鸟苷酸交换因子GEFs (guanine-nucleotide-exchange factors)和GTP酶激活蛋白GAPs (GTPase-activating proteins)。GEFs催化ARF转换为GTP的结合形式，激活ARFs。处于激活状态的ARFs通过和不同效应分子相互作用，行使不同的细胞和生理功能。GAPs通过启动水解GTP活性，将ARFs-GTP活性状态关闭，转换为非活性状态的ARFs-GDP[8]。ARFs-GTP结合蛋白通过向细胞膜表面补充外壳蛋白和肌动蛋白及改变膜脂成分等，调节囊泡运输和细胞结构[9]。ARFs与构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和酿酒酵母等多种真菌的菌丝极性生长、孢子萌发极性的建立与维持、囊泡的运输等密切相关[10]。另外研究还发现，ARFs对于一些真菌的正常存活是必需的[10]。
球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种国内外广泛用于农、林及卫生害虫生物防治的昆虫病原真菌，但ARFs及类似蛋白在白僵菌的存在数量、分类及生物学功能尚不明确。本研究以酵母AFR1、AFR2、AFR3和ARL氨基酸序列为探针，利用BLASTp搜索球孢白僵菌非冗余蛋白数据库，发现至少存在6个ARF或ARL因子，分别为BBA_02249、BBA_03298、BBA_04097、BBA_00918、BBA_07587和BBA_01574。系统聚类分析发现，BBA_01574独立于酵母ARFs，与人类的ARF3、ARF4和ARF5聚为一类，命名为BbarfA。通过表达特性分析、反义抑制、过表达野生型基因、GTP结合位点或解离位点突变的基因，研究BbarfA与病原菌发育分化和侵染致病的关系，为揭示ARFs在昆虫病原真菌参与的生物学功能奠定基础。
1 材料和方法 1.1 菌株和质粒 球孢白僵菌(B. bassiana) Bb0062 (CGMCC 7.34)，用于遗传转化的真菌亲本菌株；大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α，用于载体构建。上述菌株均保存于本实验室。
pUCm-T载体为Bio Basic Inc.公司产品，用于基因A-T克隆。pBARGPE1为真菌超量表达载体，保存于本实验室。
1.2 球孢白僵菌ARF(L)s系统聚类及序列分析 以酿酒酵母ARF1 (AAA34431)、ARF2 (AAA34430)、ARF3 (AAA61614)和ARLs (EGA83976、EGA 59715、AAC49875、EGA 79914、AAD13357和AAD56735)氨基酸序列为探针，利用BLASTp (protein-protein BLAST)搜索球孢白僵菌非冗余蛋白数据库(database of non-redundant protein sequences)。采用MEGA 6软件及最大似然率法(Maximum-Likelihood method)进行ARFs的系统进化分析。
1.3 BbarfA::eGFP基因融合、载体构建及遗传转化 以球孢白僵菌基因组DNA为模板，利用引物Bbarf1egfp-F/Bbarf1egfp-R扩增BbarfA启动子区域和编码区(删除终止密码子TAG)(2417 bp)，并在5′-端引入Nde Ⅰ酶切位点，3′-端引入3个三氨基酸(ARA)的铰链区(GCCCGAGCC)。以质粒eGFP-C1 (Becton Dickinson，Molecular Biology Products)为模板，利用引物eGFP-F/eGFP-R扩增eGFP片段(723 bp)，并在3′-端引入Bgl Ⅱ酶切位点。回收两扩增片段后通过无引物重叠PCR扩增融合，然后利用引物Bbarf1egfp-F/eGFP-R扩增融合片段。将融合片段AT克隆到pUCm-T载体进行测序验证。利用Nde Ⅰ和Bgl Ⅱ酶切融合片段，克隆到pBARGPE1的Nde Ⅰ和BamH Ⅰ位点，置换gpdA启动子区域。采用高频电流介导分生孢子遗传转化方法[11]将获得载体导入球孢白僵菌。引物序列见表 1。
表 1. 本研究所用引物 Table 1. Primers list in this study
| Primers | Sequence (5′→3′)* |
| Bbarf1egfp-F | GGAATTCCATATGCGGAGAGGAAATGCATAATC |
| Bbarf1egfp-R | TCCTCGCCCTTGCTCACCATGCCCGAGCCCTGATGGCCAGCCTTGCGGA |
| eGFP-F | GGCTCGGGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA |
| eGFP-R | GGAAGATCTTCCTATTACTTGTACAGCTCGT |
| BbarfA-FP | GGGAAGATCCTGCTTGTTG |
| BbarfA-BP | ATGTTCTTGTACTCGACGGATATCCCTAC |
| BbarfA-F | CGGGATCCCGCAATCATGGGTCTCGCTT |
| BbarfA-R | TCCCCCGGGGTTCTTCTACTGATGGCCAG |
| BbarfA-mR | GCGGCGCCGAGACCGACCAT |
| BbarfA-mF | ATGGTCGGTCTCGGCGCCGC |
| BbarfA-QIR | TCTTGTCGATACCACCGACA |
| BbarfA-QIF | TGTCGGTGGTATCGACAAGA |
| β-Tubulin-1 | TACTCTACGATTCGTCAAGT |
| β-Tubulin-2 | TGCTGGAACAGAGCCGTCTT |
| actin-F | TTGGTGCGAAACTTCAGCGTCTAGTC |
| actin-R | TCCAGCAAATGTGGATCTCCAAGCAG |
| arfaRT-F | AGCGCATGCTCAACGAGGA |
| arfaRT-R | TGATGGCCAGCCTTGCGGA |
| *: The introduced enzyme sites are underlined. | |
表选项
1.4 RNA提取和Real-time RT-PCR分析 利用Qiagen RNeasy Plant Mini Kit试剂盒提取真菌总RNA。取2 μg总RNA，采用Oligo (dT)引物合成cDNA第一链，具体操作参照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (MBI)反转录试剂盒说明书。以cDNA第一链为模板，采用Real-time RT-PCR试剂盒(iQTM SYBR Green Supermix，Bio-Rad公司)进行基因表达分析。以actin (GenBank ID：HQ232398)和β-tubulin (GenBank ID：DQ079603)作为参比基因归一化(normalize)靶标基因相对表达水平，具体计算采用CFX Manager software (Bio-Rad)。引物序列见表 1。
BbarfA在分生孢子萌发不同时期的表达分析：配制分生孢子悬浮液，接种于1/4SDY液体培养基至孢子终浓度为1×107 conidia/mL，于26 ℃、180 r/min摇瓶培养0、4、8、12、16、20 h。离心收集不同时期的分生孢子培养物，提取总RNA，反转录后利用引物arfaRT-F/arfaRT-R (表 1)和Real-time RT-PCR分析BbarfA表达特性。
BbarfA在不同胁迫条件下的表达分析：收集在1/4SDY液体培养基于26 ℃、180 r/min摇瓶培养72 h的野生菌株菌体，用灭菌水清洗后分别接种于Czapek Broth (CZB)、含0.8 mol/L NaCl、1.0 mol/L sorbitol或4.6 mmol/L H2O2的CZB，于26 ℃或32 ℃(高温)、180 r/min摇瓶培养12 h后收集菌丝，提取总RNA，反转录后利用Real-time RT-PCR分析BbarfA表达特性。
转化子中BbarfA表达分析：收集在1/4SDY液体培养基中于26 ℃、180 r/min培养48 h的菌体，用灭菌水洗涤后接种于CZB中，于26 ℃、180 r/min摇瓶培养24 h后收集菌体，提取总RNA，反转录后利用Real-time RT-PCR分析BbarfA表达水平。
1.5 BbarfA ihpRNA及超量表达BbarfA载体构建及遗传转化 根据Xiao et al.的方法[12]，设计引物BbarfA-FP/BbarfA-BP (表 1)，以球孢白僵菌基因组DNA为模板，直接扩增BbarfA中含内含子的发夹结构RNA (Intron-containing hairpin RNA，ihpRNA)。将扩增的BbarfA ihpRNA (602 bp)克隆到pUCm-T载体上测序验证，然后用EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ酶切回收测序正确的BbarfA ihpRNA，将其克隆到pBARGPE1载体的相同酶切位点，置于真菌基因组成型启动子PgadA之下，形成pBARGPE1-BbarfA-ihpRNA载体。采用高频电流介导分生孢子的遗传转化方法[11]将获得的载体导入球孢白僵菌。
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| 图 1 超量表达野生型及活性位点突变的BbarfA载体(A)与测序验证引入的突变位点(B) Figure 1 Diagram of BbarfA expression vectors and sequence verification of the introduced mutation sites in BbarfA. A: construction of vectors overexpressing BbarfA (pBARGPE1-arfA), BbarfAD26G (pBARGPE1-arfAD26G) and BbarfAQ71I (pBARGPE1-arfAQ71I); B: designed mutation sites in BbarfA and verification of the introduced mutation sites by DNA sequencing. |
| 图选项 |
以球孢白僵菌基因组DNA为模板，用引物BbarfA-F/BbarfA-R (表 1)扩增BbarfA编码区，约820 bp。扩增产物用BamH Ⅰ/Sma Ⅰ酶切后连接于BamH Ⅰ/EcoR Ⅴ酶切的pBARGPE1上，将其置于真菌基因组成型启动子PgadA之下，形成超量表达BbarfA载体pBARGPE-arfA (图 1-A)，采用高频电流介导分生孢子遗传转化方法[11]导入球孢白僵菌。
1.6 超量表达GTP解离位点或结合位点突变基因的载体构建及遗传转化 设计引物引入突变位点，采用重叠PCR分别扩增获得GTP解离位点和结合位点突变的BbarfAD26G和BbarfAQ71I片段。具体操作如下：以球孢白僵菌基因组DNA为模板，利用引物BbarfA-F/BbarfA-mR和BbarfA-mF/ Bbarf1A-R分别扩增GTP解离位点突变的BbarfA 5′-端片段(83 bp)和3′-端片段(约739 bp)，回收两扩增片段后通过无引物重叠PCR扩增融合，然后利用引物BbarfA-F/BbarfA-R扩增GTP解离位点突变的BbarfA片段BbarfAD26G (820 bp)。将扩增片段AT克隆到pUCm-T后测序验证(图 1-B)。利用引物BbarfA-F/BbarfA-QIR和BbarfA-QIF/BbarfA-R分别扩增GTP结合位点突变的BbarfA 5′-端片段(310 bp)和3′-端片段(510 bp)。回收两扩增片段后通过无引物重叠PCR扩增融合，然后利用引物BbarfA-F/BbarfA-R扩增GTP结合位点突变的BbarfA片段BbarfAQ71I (820 bp)，将扩增片段AT克隆到pUCm-T后测序验证(图 1-B)。利用BamH Ⅰ/Sma Ⅰ分别酶切测序正确的BbarfAD26G和BbarfAQ71I，将其克隆到pBARGPE1的BamH Ⅰ/EcoR Ⅴ位点，置于真菌基因组成型启动子PgadA之下，形成pBARGPE1-arfAD26G和pBARGPE1-arfAQ71I (图 1-A)，然后通过高频电流介导分生孢子遗传转化方法[11]将获得载体导入球孢白僵菌。引物序列参见表 1。
1.7 分生孢子萌发测定 将新鲜培养的分生孢子配成浓度为3×107 conidia/mL的孢子悬浮液，取100 μL接种于Czapek平板上，涂布均匀。于26 ℃恒温培养，从9 h开始每间隔1 h取样，用显微镜观察并统计孢子萌发率。每个视野统计孢子数目不少于100个，重复3次。芽管大于孢子的宽度视为萌发。
1.8 生物测定 以三龄大蜡螟幼虫(Galleria mellonella)为试虫，采用两种接种方式进行生物测定。一种是体壁侵染接种，即将试虫浸于浓度为2×107 conidia/mL的分生孢子悬浮液中20 s，然后用吸水纸吸去多余水分。另一种接种方式是微量注射法，即将浓度为1×107 conidia/mL分生孢子悬浮液微量注射到幼虫血腔，每头虫注射2 μL。两种接种方法均以0.05% (V/V) Tween-80进行相同处理的试虫为对照。接种后于26保湿培养，从48 h后每隔12 h统计死亡率。每处理为30–40头试虫，实验重复3次。利用Kaplan-Meyer曲线绘制试虫存活率趋势，并利用对数秩检验(log rank test)分析不同菌株处理与野生菌株处理的组间差异。利用SPSS 8.0软件计算不同处理的半致死时间(LT50)。
2 结果和分析 2.1 BbarfA序列分析 以酿酒酵母ARF1、ARF2、ARF3及其类似蛋白ARL1与ARL3氨基酸序列为探针，利用BLASTp搜索球孢白僵菌非冗余蛋白数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=protein & term=txid655819%5BOrganism%5D & cmd=search)，获得6个ARF及其类似蛋白，分别为BBA_01574、BBA_02249、BBA_03298、BBA_04097、BBA_00918和BBA_07587。系统聚类分析发现，BBA_02249与酵母ARF1和ARF2聚为一类，BBA_03298与酵母ARF3聚类一类，BBA_04097与酵母ARL1聚为一类，而BBA_01574则独立于酵母ARFs，与人类的ARF3、ARF4和ARF5聚为一类，BBA_00918和BBA_07587与人类的ARL8A聚为一类(图 2)。BBA_01574编码183个氨基酸，等电点为6.77，分子量约为20.9 kDa，将其命名为BbarfA。序列分析发现，BbarfA在第24–31位氨基酸含有保守的GTP解离区域GLDAAGKT (GXXXXGKT)，第67–71位、126–129位和159–162位含有保守的GTP结合区域DVGGQ、NKQD和CAT[13]。
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| 图 2 球孢白僵菌及人类和酵母ARFs的分子系统发育分析 Figure 2 Molecular phylogenetic analysis of ARFs from B. bassiana, Homo sapiens and Saccharomyces cerevisia using maximum-likelihood method. Evolutionary analysis was conducted in MEGA6. The tree is drawn to scale, with branch lengths measured in the number of substitutions per site. GenBank numbers is showed in the brackets followed the proteins. Bb, Beauveria bassiana; Sc, Saccharomyces cerevisia; Hs, Homo sapiens. |
| 图选项 |
2.2 BbarfA的表达特性 利用融合绿色荧光蛋白eGFP分析BbarfA在孢子发育过程中的表达特性，结果表明GFP荧光在成熟的分生孢子和球形膨大时期(接种后4 h)荧光较强，而在芽管出现和伸长过程中，荧光较弱且仅在孢子部位观察到荧光，而在芽管未观察到明显荧光(接种后8–20 h) (图 3-A)。Real-time RT-PCR分析进一步证实了BbarfA在分生孢子萌发过程中的表达特征(图 3-B)。在高盐(0.8 mol/L NaCl)、髙渗(1.0 mol/L sorbitol)、氧化(4.6 mmol/L H2O2)和高温胁迫(32)条件下，BbarfA的转录水平均明显高于在正常条件下(Control) (图 3-C)。由此推测，BbarfA可能与病原菌分生孢子的萌发以及逆境胁迫反应相关。
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| 图 3 BbarfA在分生孢子萌发过程和不同胁迫条件下的表达特性 Figure 3 Expression patterns of BbarfA during conidial germination, and under different stress conditions. A: GFP fluorescence of the transformants that harbored the fusion gene BbarfA::eGFP during conidial germination. FL, fluorescence light. BL, bright light. B and C: real-time RT-PCR analysis of BbarfA transcription patterns during conidial germination (B), and under different stress conditions (C). NaCl, Sorbitol and H2O2, indicate cultures in CZB containing 0.8 mol/L NaCl, 1.0 mol/L sorbitol and 4.6 mmol/L H2O2 at 26 ℃ for 12 h, which represent high salt, osmotic and oxidative stresses, respectively. HT indicates cultures in CZB grown at 32 ℃ for 12 h, which represents high temperature stress. actin and β-tubulin were used as internal standard to normalize expression of BbarfA. |
| 图选项 |
2.3 超量表达BbarfA ihpRNA、BbarfA、BbarfAD26G和BbarfAQ71I的转化子筛选 分别用Sca Ⅰ线性化表达载体pBARGPE1-BbarfA ihpRNA、pBARGPE1-arfA、pBARGPE1-arfAD26G和pBARGPE1-arfAQ71I，采用高频电流介导分生孢子转化法导入球孢白僵菌，在含200 μg/mL除草剂草甘膦(phosphinothricin)的Czapek平板上筛选抗性菌落。利用PCR扩增标记基因bar验证抗性菌落并筛选转化子(数据略)。转化子经连续继代培养3次后，采用Real-time RT-PCR筛选反义抑制BbarfA和过表达野生型、GTP解离位点和结合位点突变的BbarfA转化子。结果表明，arfA-ihpRNA转化子中BbarfA转录水平下调11%–67%，但部分转化子表达水平高于野生菌株(图 4-A)。超量表达BbarfA转化子中基因表达水平上调0.36–2.85倍(图 4-B)；超量表达BbarfAD26G转化子中导入基因上调0.34–1.23倍(图 4-C)；超量表达BbarfAQ71I转化子中导入基因上调0.35–1.48倍(图 4-D)。本研究选择BbarfA转录水平下调67%的arfA-ihpRNA转化子T6、上调水平分别提高2.85倍、1.23倍和1.48倍的超量表达BbarfA、BbarfAD26G和BbarfAQ71I转化子(T3、T3和T2)进行后续研究。
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| 图 4 Real-time RT-PCR分析转化子BbarfA的表达水平 Figure 4 Real-time RT-PCR analysis of BbarfA expression patterns in the transformants that overexpressed BbarfA ihpRNA (A), BbarfA (B), BbarfAD26G (C) and BbarfAQ71I (D), respectively, as compared with the wild type strain (WT). Total RNAs were isolated from cultures of CZB at 180 r/min and 26 ℃ for 24 h and used for real-time RT-PCR analysis. actin and β-Tubulin were used as internal standard to normalize expression of BbarfA. |
| 图选项 |
2.4 BbarfA介导球孢白僵菌分生孢子萌发 反义抑制和超量表达BbarfA、BbarfAD26G和BbarfAQ71I对球孢白僵菌生长和产孢无明显影响，但反义抑制BbarfA (arfA-ihpRNA)加快了孢子萌发速率，而超量表达BbarfA (OE-arfA)和BbarfAQ71I (OE-arfAQ71I)则延迟了孢子萌发(图 5)。不同菌株在CZP [添加0.5% (W/V)蛋白胨的Czapek agar]培养基上的孢子萌发趋势和状态如图 5-A和图 5-B所示。接种10 h后，野生菌株萌发率约42%，arfA-ihpRNA菌株的萌发率则达到64%，而OE-arfA和OE-arfAQ71I菌株的萌发率分别为31%和33%。培养12 h后，野生菌株(WT)、arfA-ihpRNA、OE-arfA和OE-arfAQ71I菌株萌发率分别为82%、93%、60%和72%。萌发中时(GT50)计算结果显示，arfA-ihpRNA的GT50 (9.32 h)比野生菌株(GT50=10.23 h)缩短了8.9%，而OE-arfA (11.25 h)和OE-arfAQ71I (10.74 h)菌株的GT50分别比野生菌株延长了10%和5%。OE-arfAD26G菌株分生孢子萌发率与野生菌株无明显差异。由此表明，BbarfA是介导球孢白僵菌分生孢子萌发的重要因子。
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| 图 5 分生孢子的萌发趋势 Figure 5 Determination of conidial germination. A: trends of conidial germination. Conidia were inoculated onto CZP plates [Czapek agar containing 0.5% (W/V) peptone], and germinated conidia were counted hourly beginning 9 h after inoculation. B: conidial germination of the test fungal strains at 10 h and 12 h after inoculation. Bar=10 μm. WT, wild type strain. arfA-ihpRNA, OE-arfA, OE-arfAD26G and OE-arfAQ71I indicate the strains that overexpressed BbarfA ihpRNA, BbarfA, BbarfAD26G and BbarfAQ71I, respectively. |
| 图选项 |
2.5 BbarfA负向调控球孢白僵菌毒力 以三龄大蜡螟幼虫为试虫，利用体壁接种和微量注射分生孢子两种方式进行生物测定。利用Kaplan–Meyer曲线绘制试虫存活率趋势，并利用对数秩检验(log rank test)分析不同菌株处理与野生菌株处理的组间差异。结果表明，体壁接种后，下调BbarfA(arfA-ihpRNA)显著提高了菌株毒力(P < 0.01)(图 6-A)，半致死时间(LT50=79.5 h)比野生菌株(96.6 h)缩短了17.7%，而超量表达BbarfA和BbarfAQ71I则显著降低了菌株毒力(P < 0.01) (图 6-A)，LT50分别为108.2 h和100.1 h，比野生菌株延长了12.0%和3.6%。而超量表达BbarfAD26G菌株与野生菌株的毒力无明显差异(P > 0.05，图 6-A)。微量注射接种后，超量表达arfA-ihpRNA显著提高了菌株毒力(P < 0.01)，而超量表达BbarfA和BbarfAQ71I则降低了菌株毒力(P < 0.01和P < 0.05，图 6-B)，LT50分别为75.4 h和69.4 h，比野生菌株(66.5 h)延长了13.4%和4.4%。超量表达BbarfAD26G菌株的毒力与野生菌株无明显差异(P > 0.05，图 6-B)。由此表明，BbarfA负向调控球孢白僵菌毒力。
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| 图 6 体壁接种和微量注射接种三龄大蜡螟幼虫后的存活率趋势 Figure 6 Survival of G. mellonella larvae after infection with the wild type strain (WT), and the transformants that overexpressed BbarfA ihpRNA (ihpRNA), BbarfA (arfA), BbarfAD26G (arfAD26G) and BbarfAQ71I (arfAQ71I), respectively. A: survival of G. mellonella larvae following topical application with 2×107 conidia/mL suspensions of the test strains [control insects were dipped in 0.05% (V/V) Tween-80]. B: survival of G. mellonella larvae following injection into the second proleg with 2 μL of 1×107 conidia/mL suspensions [control insects were injected with 2 μL 0.05% (V/V) Tween-80]. |
| 图选项 |
3 讨论 小G蛋白ARFs是一类重要的调控蛋白，主要定位于膜结构，通过GTP依赖的方式招募效应分子，参与多种生物学过程[14]。ARFs在GTP结合的活性状态和GDP结合的非活性状态循环。在活性状态下，ARFs能够招募一系列的效应分子，参与调控不同的生物学过程。GTP结合状态受鸟苷酸交换因子GEFs的正调控，受GTP酶激活蛋白GAPs的负调控[4]。
研究发现，ARFs对一些真菌的正常存活是不可或缺的[10]。我们试图利用同源重组破坏BbarfA却一直没有获得成功，推测BbarfA也可能是昆虫病原真菌球孢白僵菌生长和存活的必需因子。在构巢曲霉中，ArfA与酵母ARF1和ARF2同源，定位于高尔基体，通过影响分泌途径介导菌丝生长。过表达ArfA导致孢子芽管变细变短[10]。ArfB与酵母ARF6同源，参与菌丝顶点极性生长[10]。本研究也发现，BbarfA参与球孢白僵菌孢子萌发或芽管的极性生长，下调BbarfA促进了孢子萌发，而过表达BbarfA则延迟了孢子萌发，但其具体机制尚需进一步探究。ARF是GTP结合蛋白，在序列和结构上属于Ras超家族的一员。在球孢白僵菌中过表达显性激活突变的Ras1基因(Ras1G19V)或显隐性非活性突变的Ras1 (Ras1D126A)，增加胞内Ras1-GTP活性状态或Ras1-GDP非活性状态，均不同程度地影响了分生孢子萌发和菌丝生长[15]。本研究过表达GTP结合位点突变的BbarfA (BbarfAQ71I)也延迟了孢子萌发，推测过表达BbarfAQ71I阻碍或削弱了GTP水解速度[16]，导致野生菌株中存在过量的BbarfA-GTP激活状态，在一定程度上抑制了孢子萌发或芽管极性生长。本文推测BbarfA的GTP解离序列位于第24–31位氨基酸(GLDAAGKT)，突变第26位的D为G (BbarfAD26G)并在野生菌株中过表达，理论上可削弱解离与BbarfAD26G结合的GTP水平，增加胞内BbarfAD26G-GTP活性状态。然而，过表达BbarfAD26G菌株的孢子萌发与野生菌株并无明显差异，其具体机制尚有待于进一步明确。生物测定结果表明，BbarfA对球孢白僵菌毒力的影响与其对孢子萌发的影响趋势相似，即下调BbarfA提高了菌株毒力，而超量表达BbarfA和BbarfAQ71I则降低了菌株毒力。由此推测，BbarfA在一定程度上通过介导孢子萌发而影响菌株毒力。
ARFs参与调节分泌、内吞作用、吞噬作用等生物学过程[4]，干扰胞内ARFs活性和非活性形式的循环稳态，也可能导致相关生物学功能缺陷。如酵母ScArf1和ScArf2负责COPI笼形蛋白从顺面高尔基体到内质网的囊泡运输，突变ScArf1导致菌株生长缓慢、对低温和氟敏感，出现了多种分泌突变等表型，影响菌株的逆境适应性[17]。本研究中，尽管BbarfA在球孢白僵菌中的转录受髙盐、髙渗、氧化和高温等胁迫的诱导，但下调BbarfA以及超量表达BbarfA、BbarfAD26G和BbarfAQ71I菌株对这些胁迫条件的敏感性与野生菌株却无明显差异，推测BbarfA可能对菌株髙盐、髙渗、氧化和高温等胁迫反应的作用较弱。当然，我们也不排除反义抑制或超量表达基因强度不足，尚未引起菌株对逆境胁迫反应的表型发生明显变化的可能性。
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