周石磊, 孙悦, 岳哿丞, 张航, 王周强, 刘世崇, 彭瑞哲, 苑世超, 李再兴, 崔建升
河北科技大学环境科学与工程学院, 河北省污染防治生物技术实验室, 石家庄 050018
收稿日期: 2019-10-27; 修回日期: 2019-11-27; 录用日期: 2019-11-27
基金项目: 国家自然科学青年基金项目(No.51909056);河北科技大学引进人才科研启动基金项目(No.1181278)
作者简介: 周石磊(1987-), 男, 讲师(博士), E-mail:ZSLZhouShilei@126.com

摘要：结合16S rRNA高通量测序技术，对春季白洋淀养殖区（后塘和西李庄）沉积物垂向细菌群落演变特征及影响因素进行解析.结果表明：春季白洋淀沉积物环境因子（硝态氮、铵态氮、溶解性总磷、紫外光谱指数、三维荧光光谱指数和荧光组分强度）均呈现显著差异（p < 0.05），后塘采样点的硝态氮和铵态氮含量明显高于西李庄采样点；高通量测序得到23527个OTU，共分为11个主要门类，其中，变形菌门占比最大，达到15.33%~50.59%；α-多样性显示除辛普森指数和覆盖率外，ACE指数、Chao指数及香农指数呈现显著差异（p < 0.05），并且在后塘采样点高于西李庄；主坐标分析表明，后塘与西李庄采样点沉积物细菌群落存在显著差异，与Adonis分析的结果相一致（p < 0.01）；RDA分析发现，硝态氮和铵态氮是驱动沉积物细菌群落结构演变的主要环境因素；物种间网络分析显示，春季后塘和西李庄都为8个主要的模块，西李庄正向相关的边所占比例高达84.79%，明显高于后塘的62.82%；西李庄有244个关键物种OTU，也高于后塘的59个关键物种OTU；相关性分析得出两个采样点在主要属和模块上都存在差异，硝态氮、铵态氮、腐殖化指数（HIX）及生物源指数（BIX）是其主要环境因子.综上，通过对该时期养殖区沉积物垂向细菌群落演变特征及影响因素进行研究，可为白洋淀养殖区的污染控制提供技术支持.
关键词：细菌群落白洋淀春季网络分析驱动因素
Vertical distribution characteristics and driving factors of microbial community of spring culture area sediments in Baiyangdian Lake
ZHOU Shilei, SUN Yue, YUE Gecheng, ZHANG Hang, WANG Zhouqiang, LIU Shichong, PENG Ruizhe, YUAN Shichao, LI Zaixing, CUI Jiansheng
Pollution Prevention Biotechnology Laboratory of Hebei Province, School of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018
Received 27 October 2019; received in revised from 27 November 2019; accepted 27 November 2019
Abstract: Based on 16S rRNA gene high-throughput sequencing technology, the evolution characteristics and influencing factors of the bacterial community of spring culture area (HT and XLZ) sediments in Baiyangdian Lake were analyzed. The results revealed that the environmental factors (nitrate, ammonia, UV-vis spectra indices, excitation emission matrix spectroscopy indices, fluorescence intensity of components) showed significant differences (p < 0.05), and the concentrations of nitrate and ammonia at HT were higher than at the XLZ site; high-throughput sequencing obtained 23527 OTU, which were divided into 11 phyla, proteobacteria accounted for the largest proportion with 15.33%~50.59%. The α-diversity (ACE index, Chao index, and Shannon index) showed significant differences (p < 0.05), and the values for HT were higher than those of the XLZ site. The principal co-ordinates analysis revealed that bacterial communities of the two sites exhibited significant differences in the spring, which was consistent with the Adonis result (p < 0.001). Network analysis (OTU-OTU) showed that there were eight main modules for HT and XLZ sites, and the proportion of positive correlation edges of XLZ was 95.25%, which was higher than that of HT; there were 244 and 59 keystone OTUs for XLZ and HT, respectively. RDA indicated that nitrate and ammonia were the primary environmental factors driving the bacterial community structure. Correlation analysis revealed that the two sites exhibited different genera and modules, and that nitrate, ammonia, humification index (HIX), and biological index (BIX) were the main environmental factors. The results of this study would would provide technical support for the pollution control of culture area sediments in Baiyangdian Lake.
Keywords: bacterial communityBaiyangdian Lakespringnetwork analysisdriving factor
1 引言(Introduction)湖泊作为重要的淡水水体, 其水体水质和生态健康与否直接关系着该地区居民的生活和经济发展.由于我国大多数湖泊存在网箱养殖历史, 造成水体的水质恶化, 特别是由饵料带来的氮、磷污染, 造成了严重的水体富营养化(王珺等, 2010; 闫兴成等, 2018; 陈小华等, 2018).其中, 沉积物成为重要的污染物来源和微生物聚集场所(范成新, 2019).因此, 开展关于湖泊水体沉积物微生物的垂向分布特征及环境驱动因素的研究变得很有必要.
白洋淀作为华北地区最大的淡水湖泊, 为周边地区的经济发展提供了重要的生态保障.特别是雄安新区设立之后, 白洋淀与洱海、丹江口被定义为“新三湖”, 其水体水质与生态状况成为关乎新区建设的重要方面.白洋淀淀区水域构造独特, 水深较浅、起伏不定, 呈现“淀中有村、村中有淀”的特征, 并划分为旅游区、生活区、自然区及养殖区等多个不同功能区.其中, 养殖区作为白洋淀的典型功能分区, 承载了主要的内源污染, 特别是白洋淀中南部存在较长的网箱养殖历史, 过多饵料的沉积造成了严重的内源污染(杜奕衡等, 2018).因此, 开展白洋淀养殖区沉积物微生物垂向分布特征的研究, 对于分析该区域氮、磷等元素迁移转化的微生物作用机制意义重大.然而, 目前关于白洋淀养殖区的研究主要着眼于特定污染物的分布特征和生态评价.例如, 戴家银等(2018)研究了白洋淀中全氟己烷磺酸盐的分布和来源特征, 并对其暴露危害进行了评估；祝贵兵等(2018)通过测定冬季和夏季湖泊岸边带的氧化亚氮产生速率及反硝化微生物, 研究了氧化亚氮产生的微生物机制；单保庆等(2018b)研究了白洋淀植物分解过程中磷在水-沉积物界面的转化过程.春季是白洋淀的一个特殊时期, 在这一阶段白洋淀沉积物上覆水水体环境变化剧烈, 进而影响着沉积物中参与氮、磷等元素循环的微生物的变化.为了更好地控制氮、磷等元素污染、保护白洋淀水体, 选取养殖区代表性的区域深入分析该时期沉积物微生物群落特征及影响因素就变得非常必要.微生物网络分析可以通过网络规模、平均聚类系数、度等指标来研究物种-物种间及物种-环境因子间的相互作用(Dai et al., 2017), 评估微生物群落的稳定性(Yang et al., 2019), 进而可以解析微生物群落特征及环境驱动因子(Deng et al., 2012; 沈烽等, 2016; Deng et al., 2016).
基于此, 本文于春季选取位于白洋淀中南部养殖区的两个代表点(后塘和西李庄)进行取样, 基于高通量测序及微生物网络分析对沉积物垂向的微生物群落结构特征及驱动因子进行分析, 旨在为揭示该时期微生物参与的氮、磷等元素循环过程的关键物种及驱动因子提供科学依据.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 样品采集及测定白洋淀位于河北省雄安新区, 地理位置为38°43′~39°02′N、115°38′~116°07′E, 总面积为366 km², 是华北地区最大的淡水湖泊.于2018年春季(4月)采集白洋淀南部养殖区后塘(116°01′E, 38°50′N)和西李庄(115°59′E, 38°49′N)的柱状沉积物(图 1), 分析该时期的沉积物和微生物群落特征.现场对采样点进行分割, 分割成2 cm的柱状样品.后塘和西李庄采样点的深度分别为20 cm和26 cm, 新鲜的柱状样品装于聚乙烯封口袋中并编号, 放入冷藏箱带回实验室用冷冻干燥机进行冷冻干燥, 并将干燥后的沉积物样品研磨过100目筛.按照质量/体积比为1/20的比例进行浸提, 即称取2 g研磨后的沉积物样品, 加入40 mL Milli-Q超纯水进行浸提.振荡24 h(220 r·min^-1, 25 ℃)后离心(6000 r·min^-1, 15 min), 取上清液过0.45 μm滤膜(Whatman GF/F, 预先450 ℃灼烧)后分析水质和溶解性有机物特征(DOM).其中, 水质依据《水和废水监测分析方法》完成硝态氮(NO₃^--N)、亚硝态氮(NO₂^--N)、铵态氮(NH₃-N)、溶解性总氮(TDN)和溶解性总磷(TDP)的测定(魏复盛, 2002).依据紫外-可见吸收光谱(周石磊等, 2018)和三维荧光光谱(周石磊等, 2019)研究沉积物DOM特征, 具体包括：紫外荧光指数E₂/E₃、E₃/E₄、E₄/E₆, 以及三维荧光特征指数FI、BIX、HIX.
图 1(Fig. 1)

图 1 白洋淀养殖区春季沉积物采样点分布 Fig. 1Sampling sites map of spring culture area sediments in Baiyangdian Lake

2.2 水体DNA提取及测序分别取各个深度的沉积物寄送到上海美吉生物公司进行DNA提取；采用引物(338F/806R)进行PCR扩增(Xu et al., 2016), PCR反应条件由测序公司进行优化调整.PCR反应条件如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 30个循环；72 ℃保温10 min, 于4 ℃保存.反应结束后配制2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物.扩增后进行测序工作, 并采用QIIME对原始测序数据进行拼接、过滤和去除嵌合体, 得到有效数据(Caporaso et al., 2010).将有效序列按照97%的一致性聚类成为OTUs, 并采用SILVA数据库对OTUs进行注释(Wang et al., 2007).
2.3 测序分析α多样性分析(滕泽栋等, 2017)中, 采用Chao指数和ACE指数作为菌群丰度估计量, 采用香农指数(Shannon index)和辛普森指数(Simpson index)表征菌群的多样性, 用覆盖率(coverage)来表征测序深度.β多样性分析中, 采用R语言进行PCoA (Principal co-ordinates analysis)分析, 来研究样本群落组成的相似性和差异性(Calderón et al., 2017)；利用Adonis分析不同分组间在统计学意义上的显著性(Anderson et al., 2006).采用R语言进行方差膨胀因子(Variance Inflation Factor, VIF)分析, 来筛选环境因子(VIF < 10)；并通过冗余分析(Redundancy analysis, RDA)来研究物种和环境因子间的关系(Chen et al., 2017).
2.4 网络分析利用R软件的psych包进行物种-物种的网络分析, 应用Gephi软件进行网络可视化分析(Yu et al., 2019), 并依据“度(degree) >5”及“中介中心值(Betweenness centrality value) < 1000”的准则来选取节点作为关键物种(Li et al., 2019).同时, 参照前人文献(de Menezes et al., 2015; Zhang et al., 2018a), 以各个模块群落主坐标分析的第一主成分来代表各个模块；然后通过计算各模块第一主成分与环境因子的斯皮尔曼相关系数来分析微生物网络模块与环境因子的关系.
2.5 统计分析本文中绘图和数据统计分析采用SPSS、R和Origin软件完成.以“*”表示p < 0.05, 说明存在显著差异；“**”表示0.001 < p < 0.01, 存在极显著差异；“***”表示p < 0.001, 存在极其显著差异.
3 结果与分析(Results and analysis)3.1 沉积物主要环境因子垂向特征白洋淀养殖区春季沉积物主要环境因子的垂向分布如图 2所示, 图中HT表示后塘采样点, XLZ表示西李庄采样点, C1、C2和C3分别表示荧光组分C1、C2和C3.对于后塘采样点而言：铵态氮垂向浓度为(3.57±1.01) mg·L^-1(p < 0.001), 硝态氮垂向浓度为(7.72±2.90) mg·L^-1(p < 0.001), 溶解性总磷垂向浓度为(0.03±0.01) mg·L^-1(p < 0.001)；紫外光谱指数E₂/E₃为7.84±2.34(p < 0.001), E₃/E₄为2.83±0.41(p < 0.001), E₄/E₆为1.62±0.09(p < 0.001)；三维荧光光谱指数FI为2.56±0.30(p < 0.001), BIX为1.08±0.09(p < 0.001), HIX为1.95±0.29(p < 0.001)；荧光强度C1为(0.33±0.24) R.U(p < 0.01), C2为(0.14±0.09) R.U(p < 0.05), C3为(0.15±0.10) R.U(p < 0.05).对于西李庄采样点而言：铵态氮垂向浓度为(1.91±1.20) mg·L^-1(p < 0.001), 硝态氮垂向浓度为(0.64±0.52) mg·L^-1(p < 0.001), 溶解性总磷垂向浓度为(0.08±0.05) mg·L^-1(p < 0.05)；紫外光谱指数E₂/E₃为3.56±0.30(p < 0.001), E₃/E₄为2.93±0.34(p < 0.001), E₄/E₆为2.05±0.25(p < 0.001)；三维荧光光谱指数FI为2.31±0.22(p < 0.001), BIX为0.93±0.21(p < 0.001), HIX为2.74±1.53(p < 0.001)；荧光组分C1为(1.88±1.08) R.U(p < 0.001), C2为(0.89±0.39) R.U(p < 0.001), C3为(0.83±0.49) R.U(p < 0.001).与此同时, 除E₃/E₄、BIX及HIX外, 两个采样点间的铵态氮(p < 0.01)、硝态氮(p < 0.001)、溶解性总磷(p < 0.01)、E₂/E₃(p < 0.001)、E₄/E₆(p < 0.001)、FI(p < 0.05)、C1(p < 0.001)、C2(p < 0.001)及C3(p < 0.001)都呈现显著差异.
图 2(Fig. 2)

图 2 白洋淀养殖区春季沉积物环境因子特征(HT:后塘, XLZ:西李庄) Fig. 2Characteristics of environmental factors of spring culture area sediments in Baiyangdian Lake

通过比较两个采样点的氮、磷指标可以发现, 后塘采样点的铵态氮和硝态氮浓度明显高于西李庄采样点, 但溶解性总磷浓度低于西李庄.紫外荧光指数E₂/E₃用于表征DOM相对分子质量大小, 与分子量成反比(李璐璐等, 2014).后塘采样点样品的E₂/E₃值明显高于西李庄采样点, 说明后塘采样点样品的DOM分子量低于西李庄采样点.紫外荧光指数E₃/E₄用于表征DOM腐殖化程度(Li et al., 2017).两个采样点样品的E₃/E₄值都小于3.5, 表明两个采样点的腐殖化程度较高.紫外荧光指数E₄/E₆与DOM腐殖化程度成反比(Chen et al., 1977).本文结果表明, 后塘采样点的腐殖化程度要高于西李庄.三维荧光光谱指数FI用于表征DOM的来源, 两个采样点的FI都大于1.8, 表明两个采样点的DOM都为自生源(Lavonen et al., 2015).三维荧光光谱指数BI用于表征DOM来源(Huguet et al., 2009).后塘采样点的BIX大于1, 呈现自生源特征；西李庄采样点的BIX在0.9~1.0范围内, 呈较强的自生源特征.两个采样点的HIX都小于4, 表明以自生源为主(Lavonen et al., 2015).基于平行因子分析得到3个组分：组分1(C1)为类酪氨酸(λ_Ex/λ_Em=275 nm/300 nm)(Chen et al., 2012)；组分2(C2)为类腐殖质(λ_Ex/λ_Em=265 nm/530 nm)(周石磊等, 2018)；组分3(C3)为土壤富里酸(λ_Ex/λ_Em=280 nm/570 nm)(S?ndergaard et al., 2003).西李庄采样点沉积物的3个荧光组分都高于后塘采样点.
3.2 沉积物垂向细菌群落结构3.2.1 α多样性分析如图 3a所示, 后塘采样点的菌群丰度估计量参数ACE指数和Chao指数都高于西李庄采样点；其中, 后塘采样点的ACE指数为3716.41±272.80, 高于西李庄采样点的3100.41±704.99, 并且呈显著差异(p < 0.05)；后塘采样点的Chao指数为3709.89±268.48, 高于西李庄采样点的3055.50±666.57, 并且呈显著差异(p < 0.01).后塘采样点用于表征菌群多样性的香农指数为6.48±0.21, 高于西李庄采样点的6.17±0.36, 并且呈显著差异(p < 0.05).后塘采样点的辛普森指数和菌群覆盖率均低于西李庄采样点.另外, Adonis分析显示两个采样点的α多样性存在显著差异(p < 0.05).与此同时, 基于α多样性指数进行RDA分析(图 3b), 通过VIF分析筛选出NH₃-N(VIF=9.22)、NO₂^--N(VIF=2.12)、NO₃^--N (VIF=10.00)、TDP(VIF=1.97)、Fn₃₅₅(VIF=6.70)和C1(VIF=4.33)共6个主要环境因子, RDA1和RDA2共解释了全部α多样性的31.98%, 并且两个采样点各个深度的样品分布在不同的区域.
图 3(Fig. 3)

图 3 白洋淀养殖区春季沉积物垂向细菌群落多样性指数分布(a)及冗余分析(b) Fig. 3Bacteria community diversity index(a) and RDA(b) of spring culture area sediments in Baiyangdian Lake

3.2.2 细菌群落组成和结构通过物种注释, 春季水库水体共得到23527个OTU, 分为11个主要的门类(图 4a), 分别为变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、Aminicenantes门、Latescibacteria门、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、螺旋体门(Spirochaetes)等.其中, 变形菌门为第一大门类, 所占比例为15.33%~50.59%；后塘和西李庄采样点沉积物中变形菌门所占比例随采样深度的增加呈下降趋势, 后塘采样点从表层0~2 cm处的38.51%下降到16~18 cm深度的17.43%, 西李庄采样点从表层0~2 cm处的40.37%下降到24~26 cm深度的18.34%.前人研究发现, 变形菌门在碳和氮代谢过程中具有重要作用(Hou et al., 2018), 放线菌门在降解有机物过程中起主要作用(Droppo et al., 2016; Ou et al., 2018), 拟杆菌门主要参与硝化反应过程(Wu et al., 2018), 厚壁菌门能促进植物残留物的降解(Kielak et al., 2016).两个采样点沉积物各主要门类在垂向上呈显著差异(p < 0.01).在纲水平上(图 4b), 共包括11个纲, 其中, δ-proteobacteria纲占比最大, 达到4.77%~23.67%, 并且垂向间存在显著差异(p < 0.001)；β-proteobacteria纲次之, 占比为3.64%~16.25%, 并且垂向间存在显著差异(p < 0.001), 同时β-proteobacteria纲有助于铵态氮的去除(Jie et al., 2018).
图 4(Fig. 4)

图 4 白洋淀养殖区春季沉积物垂向细菌群落结构组成(a.门水平, b.纲水平, c.属水平) Fig. 4Bacterial community composition of spring culture area sediments in Baiyangdian Lake

图 4c所示为丰度前19的主要属, 包括：norank_Anaerolineaceae、norank_Acidobacteria、Nitrospira、Thiobacillus、Sva0081_sediment_group、norank_Gaiellales、norank_Xanthomonadales_Incertae_Sedis、norank_Aminicenantes、norank_Bacteroidetes_vadinHA17、norank_KD4-96、Actibacter、norank_Latescibacteria、Desulfatiglans、unclassified_Chloroflexi、norank_Sva0485、norank_Syntrophobacteraceae、norank_Belgica2005-10-ZG-3、Desulfobacca和norank_Actinobacteria, 并且垂向上各个属的分布都存在显著差异.后塘采样点的norank_Anaerolineaceae丰度随深度的增加呈现升-降-升-降的变化过程, 丰度峰值分别为6~8 cm处的15.81%和14~16 cm处的18.67%；西李庄采样点的norank_Anaerolineaceae丰度随深度的增加呈现升-降-升的变化过程, 丰度峰值分别为2~4 cm处的17.20%和22~24 cm处的15.32%.其中未分类的占主体, 可能与关于白洋淀沉积物环境的微生物研究较少有关.Nitrospira能够降解土壤中的有机物和铵态氮(Shi et al., 2018), Thiobacillus能够通过自养反硝化实现硝态氮的去除(Zhang et al., 2019b), Sva0081_sediment_group与铵态氮成正比(阴星望等, 2018).
3.2.3 β多样性分析图 5a为春季养殖区沉积物垂向物种群落的分布情况.PCoA1、PCoA2分别解释了总体变化的44.03%、14.01%, 总共解释了整体变化的58.04%；其中, 后塘采样点垂向间的分布较集中, 主要集中于第二象限, 西李庄采样点垂向间的分布较分散, 分布于第三和第四象限.后塘和西李庄采样点的Adonis分析结果为p < 0.01, 显示两个采样点的细菌群落结构存在显著的差异性.
图 5(Fig. 5)

图 5 白洋淀养殖区春季沉积物垂向细菌群落的主坐标分析(a)和冗余分析(b) Fig. 5PCoA(a) and RDA(b) of bacterial community of spring culture area sediments in Baiyangdian Lake

3.3 物种与环境因子关系分析本研究通过RDA分析了春季养殖区沉积物细菌与环境因子的关系(图 5b).通过向前选择分析, 基于α=0.05标准得到2个主要的环境因子为硝态氮(VIF=1.94, p < 0.05)和铵态氮(VIF=1.94, p < 0.001), 分别解释了总体变化的27.34%和9.50%.RDA分析得到的前两个轴分别解释了总体变化的28.13%和8.71%, 总共解释了36.84%；硝态氮与RDA1和RDA2的相关系数分别为-0.76(p < 0.001)和-0.65(p < 0.001), 铵态氮与RDA1和RDA2的相关系数分别为-0.99(p < 0.01)和0.11(p < 0.01), 说明硝态氮和铵态氮是驱动沉积物细菌群落演变的主要因素.
为了研究环境因子对细菌群落的影响, 本研究通过斯皮尔曼相关性分析了环境因子对细菌群的影响, 丰度前30的属与环境因子的相关性如图 6所示.后塘采样点的结果显示：norank_Aminiceantes和Clostridium_sensu_stricto_1与荧光组分C1、C2及C3呈正相关；Clostridium_sensu_stricto_1与铵态氮呈负相关；unclassified_Nocardioidaceae、norank_Xanthomonadales、norank_SZB30、norank_Syntrophaceae及norank_Alcaligenaceae与硝态氮呈负相关.西李庄采样点的结果显示：Sva0081_sediment_group、norank_Xanthomonadales、Clostridium_sensu_stricto_1、norank_SJA.15、norank_Bacteroidetes_vadinHA17、norank_Alcaligenaceae及Desulfatiglans与铵态氮呈显著正相关关系(p < 0.05), 相关系数为0.80~0.88.养殖区全部采样点的结果显示：Sva0081_sediment_group、norank_Syntrophobacteraceae及norank_Gaiellales与荧光组分C1、C2及C3呈显著负相关(p < 0.05), 而Micromonospora与荧光组分C1、C2、C3及溶解性总磷呈显著正相关(p < 0.05)；unclassified_Nocardioidaceae及Micromonospora与铵态氮(p < 0.01)和硝态氮(p < 0.05)呈显著负相关；Sva0081_sediment_group、norank_Xanthomonadales、norank_Syntrophobacteraceae及norank_SZB30与铵态氮和硝态氮呈显著正相关(p < 0.05)；norank_Gaiellales与溶解性总磷呈显著负相关(p < 0.01).其中, Xanthomonadales不仅在生物膜反应器中被发现是一个典型的反硝化细菌(Ontiveros-Valencia et al., 2014), 而且能够利用纤维素, 是碳转化过程中的主要细菌(Hervé et al., 2014)；Alcaligenaceae也是典型的反硝化菌(Zhang et al., 2019a)；Micromonospora为会仙岩溶湿地中的优势属, 与C/N呈显著正相关(贾远航等, 2019)；Syntrophobacteraceae在厌氧产沼及硫酸盐还原过程中均发挥着重要作用(张堃, 2018)；Micromonospora是具有溶磷能力的放线菌(薛冬等, 2018).
图 6(Fig. 6)

图 6 春季白洋淀水体反硝化细菌与环境因子的相关性分析 Fig. 6Correlation analysis for the denitrifying bacterial populations in the spring of Baiyangdian Lake

3.4 网络分析3.4.1 网络特性分析分别选取后塘和西李庄采样点及全部两个采样点OTU间的斯皮尔曼相关系数|r|>0.9且显著性p < 0.001的物种OTU, 构建微生物OTU-OTU网络, 研究后塘采样点(图 7a)、西李庄采样点(图 7b)及养殖区沉积物细菌物种间的关系(图 7c).图中节点大小与网络节点的度成比例, 节点与节点间边的颜色显示了物种间的作用关系：红色为正向关系, 绿色为负向关系, 边的宽度与相关系数|r|值成比例.
图 7(Fig. 7)

图 7 白洋淀春季养殖区沉积物垂向细菌群落的网络分析 Fig. 7Network analysis for bacterial community of spring culture area sediments in Baiyangdian Lake

后塘采样点沉积物细菌OTU-OTU网络结果表明：该网络共得到414个节点、745个边, 正向相关的边所占比例为62.82%, 负向相关的边所占比例为37.18%；网络的平均度为3.60, 网络直径为16, 图密度为0.009, 平均加权度为3.34, 平均聚类系数为0.38, 模块性为0.68>0.4, 表明网络具有模块结构(沈烽等, 2016)；共得到80个模块, 表示微生物网络中共有80个功能相近的、关系紧密的一组微生物(Zhou et al., 2011).本文划分为8个主要模块, 其中, 模块1占比11.59%, 模块2占比7.97%, 模块3占比7.00%, 模块4占比6.28%, 模块5占比5.80%, 模块6占比5.56%, 模块7占比5.07%, 模块8~80占比50.73%.基于节点度大于6和中介中心值小于1000的标准, 得到59个关键物种OTU, 其中, 分布在模块1中的有25个, 分布在模块2中的有5个, 分布在模块3中的有9个, 分布在模块4中的有10个, 分布在模块5中的有6个, 分布在模块6和7中的各有1个, 其他模块中有2个(图 7a).59个关键物种OTU主要隶属于放线菌、β-proteobacteria纲、δ-proteobacteria纲、γ-proteobacteria纲.
西李庄采样点沉积物细菌OTU-OTU网络结果表明：该网络共得到429个节点、3649个边, 正向相关的边所占比例为84.79%, 负向相关的边所占比例为15.21%；网络的平均度为17.01, 网络直径为9, 图密度为0.04, 平均加权度为23.70, 平均聚类系数为0.45, 模块性为0.48.与后塘采样点相比, 西李庄采样点的网络图中, 正向相关边的占比明显增加, 表明西李庄采样点物种间的协同作用较强.共得到21个模块, 本文划分为8个模块, 其中, 模块1占比26.11%, 模块2占比19.58%, 模块3占比16.78%, 模块4占比16.08%, ,模块5占比4.90%, 模块6占比4.20%, 模块7占比2.33%, 模块8~21占比10.02%.得到244个关键物种OTU, 分布在模块1中的有66个, 分布在模块2中的有55个, 分布在模块3中的有48个, 分布在模块4中的有51个, 分布在模块5中的有14个, 分布在模块6中的有9个, 分布在模块7中的有1个(图 7b).244个关键物种OTU主要隶属于酸杆菌纲、放线菌、α-proteobacteria纲、β-proteobacteria纲、δ-proteobacteria纲、γ-proteobacteria纲、Anaerolineae纲、Bacteroidetes_vadinHA17、梭菌纲、硝化螺旋菌纲、螺旋体属纲.
两个采样点组合的养殖区沉积物细菌OTU-OTU网络结果表明：该网络共得到161个节点、278个边, 正向相关的边所占比例为93.88%, 负向相关的边所占比例为6.12%；网络的平均度为3.45, 网络直径为10, 图密度为0.022, 平均加权度为6.91, 平均聚类系数为0.46, 模块性为0.71.共得到24个模块, 本文划分为8个模块, 其中, 模块1占比18.63%, 模块2占比15.53%, 模块3占比14.91%, 模块4占比8.70%, 模块5占比7.45%, 模块6占比4.35%, 模块7占比3.73%, 模块8~24占比26.70%.得到73个关键物种OTU, 分布在模块1中的有16个, 分布在模块2中的有12个, 分布在模块3中的有16个, 分布在模块4中的有14个, 分布在模块5中的有6个, 分布在模块6中的有2个, 分布在模块7中的有2个, 其他模块中有5个(图 7c).73个关键物种OTU主要隶属于酸杆菌纲、放线菌、α-proteobacteria纲、β-proteobacteria纲、芽孢杆菌纲、梭菌纲.综上, 两个采样点的物种网络结构存在差异, 西李庄采样点的关键物种OTU要多于后塘采样点, 并且所属的物种类别相对更丰富；综合两个采样点的物种网络中, 正向相关的边占比增加到93.88%, 明显高于各自采样点, 表明该区域沉积物微生物更多的表现为共生关系.
3.4.2 网络模块与环境因子相关分析为了进一步研究环境因子对春季养殖区沉积物细菌群落结构演变的影响, 本文分析了环境因子与微生物模块的相关性(图 8).在后塘采样点中, Fn₃₅₅与模块5呈负相关, 相关系数为-0.70, 表明Fn₃₅₅对该模块群落演变具有负向作用；亚硝态氮与模块1、模块6及模块7呈正相关, 相关系数分别为0.78、0.84、0.73, 表明亚硝态氮对这些模块群落演变具有正向作用；亚硝态氮与其他模块组呈负相关, 相关系数为-0.74, 表明亚硝态氮对其他模块组群落演变具有负向作用.在西李庄采样点中, Fn₂₈₀与模块1、模块2及其他模块呈显著负相关, 相关系数分别为-0.71(p < 0.05)、-0.72(p < 0.05)及-0.79(p < 0.05), 表明Fn₂₈₀对这些模块群落演变具有负向作用；Fn₃₅₅与其他模块组呈现负相关, 相关系数为-0.78(p < 0.05), 表明Fn₃₅₅对该模块组群落演变具有负向作用；HIX与模块1、模块2、模块6及其他模块组呈显著正相关(p < 0.05), 相关系数为0.77~0.80, 表明HIX对这些模块群落演变具有正向作用；铵态氮与模块1、模块2、模块3、模块6及其他模块组呈现显著负相关(p < 0.05), 相关系数为-0.73~-0.81, 表明铵态氮对这些模块群落演变具有负向作用；亚硝态氮和β/α与铵态氮和模块间的关系类似, 呈现出对模块1、模块2、模块3的负向作用.在结合两个采样点组合的网络中, A₂₅₄/A₂₀₄、C1、C2、C3与模块1、模块4、模块5及其他模块组呈现显著正相关(p < 0.05), 相关系数为0.55~0.78, 表明A₂₅₄/A₂₀₄、BIX、C1、C2及C3对这些模块群落演变呈有正向作用；A₂₂₀/A₂₅₄、BIX、E₂/E₃、E₂/E₄、铵态氮、硝态氮及β/α与模块1、模块4、模块5及其他模块组呈现显著负相关(p < 0.05), 相关系数为-0.52~-0.81, 表明A₂₂₀/A₂₅₄、BIX、E₂/E₃、E₂/E₄、铵态氮、硝态氮及β/α对这些模块群落演变具有负向作用；HIX与模块1、模块2、模块3、模块7及其他模块组呈现显著正相关(p < 0.05), 相关系数为0.61~0.72, 表明HIX对这些模块群落演变具有正向作用；溶解性总磷对模块4和模块5具有显著正向作用(p < 0.01).
图 8(Fig. 8)

图 8 白洋淀养殖区春季沉积物垂向细菌群落模块与环境因子的相关性分析(括号中“/”前后数据分别表示该模块中关键物种OTU的数目及该模块总共的OTU数目) Fig. 8Correlation analysis between module and environmental factor in Baiyangdian Lake

4 结论(Conclusions)1) 春季养殖区沉积物的硝态氮、铵态氮、溶解性总磷、紫外光谱指数、三维荧光光谱指数及荧光组分都呈现显著的垂向差异, 其中, 后塘采样点的硝态氮和铵态氮浓度明显高于西李庄采样点.
2) 春季养殖区沉积物细菌主要为11个门类, 其中, 变形菌门为第一大门类, 所占比例为15.33%~50.59%；后塘采样点的菌群丰度(ACE指数和Chao指数)要显著高于西李庄采样点(p < 0.05)；两采样点垂向细菌群落呈现显著差异(p < 0.01)；硝态氮和铵态氮是影响微生物群落变化的主要环境因子, 分别解释了总体变化的27.34%和9.50%.
3) 网络分析显示, 西李庄采样点物种网络中物种间的正向作用高于后塘采样点, 关键物种也较后塘采样点丰富；环境因子与模块及主要属的相关性分析得出两个采样点存在差异, 硝态氮、铵态氮、HIX和BIX是驱动该时期沉积物垂向群落结构及关键物种演变的因素.

参考文献

Anderson M J, Ellingsen K E, Mcardle B H. 2006. Multivariate dispersion as a measure of beta diversity[J]. Ecology Letters, 9(6): 683-693.

Calderón K, Spor A, Breuil M C, et al. 2017. Effectiveness of ecological rescue for altered soil microbial communities and functions[J]. The ISME Journal, 11(1): 272-283.

Caporaso J G, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. 2010. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nature Methods, 7(5): 335-336.

Cui Q, Pan Y, Zhang H, et al. 2018. Elevated concentrations of perfluorohexanesulfonate and other per- and polyfluoroalkyl substances in Baiyangdian Lake (China):Source characterization and exposure assessment[J]. Environmental Pollution, 241: 684-691.

陈小华, 钱晓雍, 李小平, 等. 2018. 洱海富营养化时间演变特征(1988-2013年)及社会经济驱动分析[J]. 湖泊科学, 30(1): 70-78.

Chen X, Chuai X, Yang L, et al. 2012. Climatic warming and overgrazing induced the high concentration of organic matter in Lake Hulun, a large shallow eutrophic steppe lake in northern China[J]. Science of the Total Environment, 431(5): 332-338.

Chen X, Hou F, Wu Y, et al. 2017. Bacterial and fungal community structures in loess plateau grasslands with different grazing intensities[J]. Frontiers in Microbiology, 8: 606.

Chen Y, Senesi N, Schnitzer M. 1977. Information provided on humic substances by E4/E6 ratios 1[J]. Soil Science Society of America Journal, 41(2): 352-358.

Dai W, Zhang J, Tu Q, et al. 2017. Bacterioplankton assembly and interspecies interaction indicating increasing coastal eutrophication[J]. Chemosphere, 177: 317-325.

Deng Y, Jiang Y H, Yang Y, et al. 2012. Molecular ecological network analyses[J]. BMC Bioinformatics, 13(1): 113.

Deng Y, Zhang P, Qin Y, et al. 2016. Network succession reveals the importance of competition in response to emulsified vegetable oil amendment for uranium bioremediation[J]. Environmental Microbiology, 18(1): 205-218.

De Menezes A B, Prendergast-miller M T, Richardson A E, et al. 2015. Network analysis reveals that bacteria and fungi form modules that correlate independently with soil parameters[J]. Environmental Microbiology, 17(8): 2677-2689.

杜奕衡, 刘成, 陈开宁, 等. 2018. 白洋淀沉积物氮磷赋存特征及其内源负荷[J]. 湖泊科学, 30(6): 1537-1551.

Droppo I G, Krishnappan B G, Lawrence J R. 2016. Microbial interactions with naturally occurring hydrophobic sediments:Influence on sediment and associated contaminant mobility[J]. Water Research, 92: 121-130.

范成新. 2019. 湖泊沉积物-水界面研究进展与展望[J]. 湖泊科学, 31(5): 1191-1218.

Hervé V, Le Roux X, Uroz S, et al. 2014. Diversity and structure of bacterial communities associated with P hanerochaete chrysosporium during wood decay[J]. Environmental Microbiology, 16(7): 2238-2252.

Hou L, Zhou Q, Wu Q, et al. 2018. Spatiotemporal changes in bacterial community and microbial activity in a full-scale drinking water treatment plant[J]. Science of the Total Environment, 625: 449-459.

Huguet A, Vacher L, Relexans S, et al. 2009. Properties of fluorescent dissolved organic matter in the Gironde Estuary[J]. Organic Geochemistry, 40(6): 706-719.

贾远航, 靳振江, 袁武, 等. 2019. 会仙岩溶湿地、稻田与旱地土壤细菌群落结构特征比较[J]. 环境科学, 40(7): 3313-3323.

Jie G, Yu D, Ying L, et al. 2018. Long- and short-chain AHLs affect AOA and AOB microbial community composition and ammonia oxidation rate in activated sludge[J]. Journal of Environmental Sciences-China, 78: 53-62.

Kielak A M, Barreto C C, Kowalchuk G A, et al. 2016. The ecology of acidobacteria:Moving beyond Genes and Genomes[J]. Frontiers in Microbiology, 7: 744.

Lavonen E, Kothawala D, Tranvik L, et al. 2015. Tracking changes in the optical properties and molecular composition of dissolved organic matter during drinking water production[J]. Water Research, 85: 286-294.

李璐璐, 江韬, 闫金龙, 等. 2014. 三峡库区典型消落带土壤及沉积物中溶解性有机质(DOM)的紫外-可见光谱特征[J]. 环境科学, 35(3): 933-941.

Li P, Hur J. 2017. Utilization of UV-Vis spectroscopy and related data analyses for dissolved organic matter (DOM) studies:A review[J]. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 47(3): 131-154.

Li Y, Wu H, Shen Y, et al. 2019. Statistical determination of crucial taxa indicative of pollution gradients in sediments of Lake Taihu, China[J]. Environmental Pollution, 246: 753-762.

沈烽, 黄睿, 曾巾, 等. 2016. 分子生态网络分析研究进展[J]. 环境科学与技术, 39(S1): 94-98.

Ou D, Li H, Li W, et al. 2018. Salt-tolerance aerobic granular sludge:Formation and microbial community characteristics[J]. Bioresoure Technology, 249: 132-138.

Ontiveros-valencia A, Tang Y, Zhao H P, et al. 2014. Pyrosequencing analysis yields comprehensive assessment of microbial communities in pilot-scale two-stage membrane biofilm reactors[J]. Environmental Science & Technology, 48(13): 7511-7518.

S?ndergaard M, Stedmon C A, Borch N H. 2003. Fate of terrigenous dissolved organic matter (DOM) in estuaries:Aggregation and bioavailability[J]. Ophelia, 57(3): 161-176.

Shi X, Hu H W, Wang J, et al. 2018. Niche separation of comammox Nitrospira and canonical ammonia oxidizers in an acidic subtropical forest soil under long-term nitrogen deposition[J]. Soil Biology and Biochemistry, 126: 114-122.

滕泽栋, 李敏, 朱静, 等. 2017. 野鸭湖湿地芦苇根际微生物多样性与磷素形态关系[J]. 环境科学, 38(11): 4589-4597.

王珺, 裴元生, 杨志峰. 2010. 营养盐对白洋淀草型富营养化的驱动与限制[J]. 中国环境科学, 30(S1): 7-13.

Wang Q, Garrity G M, Tiedje J M, et al. 2007. Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy[J]. Applied Environmental Microbiology, 73(16): 5261-5267.

魏复盛. 2002. 水和废水监测分析方法(第4版)[M]. 北京: 中国环境科学出版社.

Wu D, Zhang Z, Yu Z, et al. 2018. Optimization of F/M ratio for stability of aerobic granular process via quantitative sludge discharge[J]. Bioresoure Technology, 252: 150-156.

Xu N, Tan G, Wang H, et al. 2016. Effect of biochar additions to soil on nitrogen leaching, microbial biomass and bacterial community structure[J]. European Journal of Soil Biology, 74: 1-8.

薛冬, 黄向东, 杨瑞先, 等. 2018. 牡丹根际溶磷放线菌的筛选及其溶磷特性[J]. 应用生态学报, 29(5): 1645-1652.

闫兴成, 王明玥, 许晓光, 等. 2018. 富营养化湖泊沉积物有机质矿化过程中碳、氮、磷的迁移特征[J]. 湖泊科学, 30(2): 306-313.

Yang Y, Gao Y, Huang X, et al. 2019. Adaptive shifts of bacterioplankton communities in response to nitrogen enrichment in a highly polluted river[J]. Environmental Pollution, 245: 290-299.

阴星望, 田伟, 丁一, 等. 2018. 丹江口库区表层沉积物细菌多样性及功能预测分析[J]. 湖泊科学, 30(4): 1052-1063.

Yu Y, Wu M, Petropoulos E, et al. 2019. Responses of paddy soil bacterial community assembly to different long-term fertilizations in southeast China[J]. Science of the Total Environment, 656: 625-633.

Zhao S, Wang Q, Zhou J, et al. 2018. Linking abundance and community of microbial N2O-producers and N2O-reducers with enzymatic N2O production potential in a riparian zone[J]. Science of the Total Environment, 642: 1090-1099.

Zhang W, Jin X, Meng X, et al. 2018. Phosphorus transformations at the sediment-water interface in shallow freshwater ecosystems caused by decomposition of plant debris[J]. Chemosphere, 201: 328-334.

Zhang B, Zhang J, Liu Y, et al. 2018. Co-occurrence patterns of soybean rhizosphere microbiome at a continental scale[J]. Soil Biology and Biochemistry, 118: 178-186.

Zhang Y, Wei D, Morrison L, et al. 2019. Nutrient removal through pyrrhotite autotrophic denitrification:Implications for eutrophication control[J]. Science of the Total Environment, 662: 287-296.

Zhang C, Li L, Hu X, et al. 2019. Effects of a pulsed electric field on nitrogen removal through the ANAMMOX process at room temperature[J]. Bioresource Technology, 275: 225-231.

张堃. 2018. 德国分散式污水处理系统微生物群落结构及功能[J]. 中国环境科学, 38(8): 2981-2989.

周石磊, 张艺冉, 黄廷林, 等. 2018. 周村水库主库区水体热分层形成过程中沉积物间隙水DOM的光谱演变特征[J]. 环境科学, 39(12): 5451-5463.

周石磊, 孙悦, 张艺冉, 等. 2019. 山东省周村水库季节演替中沉积物上覆水溶解性有机物的紫外-可见与三维荧光光学特征[J]. 湖泊科学, 31(5): 1344-1356.

Zhou J, Deng Y, Luo F, et al. 2011. Phylogenetic molecular ecological network of soil microbial communities in response to elevated CO2[J]. MBio, 2(4): e00122-11.