, 何江涛
, 劳天颖, 何宝南, 关翔宇中国地质大学(北京)水资源与环境工程北京市重点实验室, 北京 100083
收稿日期: 2019-09-17; 修回日期: 2019-10-30; 录用日期: 2019-10-30
基金项目: 国家水体污染控制与治理科技重大专项（No.2018ZX07109-04）；中央高校基本科研业务费项目（No.53200859568）
作者简介: 黄斯艺(1997-), 女, E-mail:865164062@qq.com
通讯作者（责任作者）: 何江涛, E-mail:jthe@cugb.edu.cn
摘要：为探寻纳米乳化油原位修复地下水硝酸盐氮污染过程中微生物堵塞的形成原因，本研究采用市售的反硝化细菌接种微生物，以纳米乳化油为碳源，中砂为介质，分别建立2组反应器进行模拟实验，分析不同反应器中硝氮的降解情况，同时采用MiSeq高通量测序技术表征不同反应器的微生物菌落结构和多样性.结果表明，纳米乳化油作为碳源具有良好的降解效果，添加纳米乳化油的反应器，反应周期内硝酸盐氮的总降解效率为91.76%，而对照反应器的降解效率仅为38.11%.在硝酸盐氮降解过程中，均存在以蛋白质和多糖为主的代谢产物胞外聚合物增加的趋势，且蛋白质的含量均显著高于多糖.反应结束时，实验组和对照组的胞外聚合物累积量分别为384.49 mg和279.45 mg，单位质量硝氮降解产生的胞外聚合物分别为1.79 mg·mg-1和39.43 mg·mg-1.高通量测序结果显示，添加纳米乳化油会引起细菌浓度的升高及细菌群落多样性的降低，但具有反硝化作用的微生物相对丰度增加.实验组和对照组反应器中共同的优势菌门为Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria，相对丰度分别为73.35%、6.77%、8.49%及33.46%、47.15%、7.15%，纳米乳化油的添加会刺激Proteobacteria等具有较高反硝化作用的微生物增多，因此，以纳米乳化油作为碳源能够有效提高硝酸盐氮的降解效率，但与此同时纳米乳化油也会刺激微生物的生长及影响微生物群落演变.Sphingamonas、Rhodopseudomonas和Microbacterium菌属相对丰度增加，会引起粘性代谢产物增多，造成多孔介质渗透性下降和生物堵塞.
关键词：纳米乳化油硝氮降解Miseq高通量测序胞外聚合物细菌群落
Experimental study of microbial characteristics in the process of in-situ nitrate pollution remediation by nano emulsified oil
HUANG Siyi
, HE Jiangtao, LAO Tianying, HE Baonan, GUAN XiangyuBeijing Key Laboratory of Water Resources and Environmental Engineering, School of Water Resources and Environment, China University of Geosciences(Beijing), Beijing 100083
Received 17 September 2019; received in revised from 30 October 2019; accepted 30 October 2019
Abstract: To explore the causes of bioclogging in the process of in-situ nitrate pollution remediation by nano emulsified oil, experiments were conducted with reactors in which microorganisms were inoculated by commercial denitrifying bacteria, and nano emulsified oil and medium sands were used as carbon source and porous media, respectively. The nitrate degradation was evaluated and the variation of microorganisms community structure and diversity were characterized by the MiSeq high-throughput sequencing technology. The results showed that nano emulsified oil performed as a good degradation carbon source. The total degradation efficiency of nitrate in the reactor with nano emulsified oil reached 91.76%, but in the control reactor without nano emulsified oil, it is only 38.11%. In the process of nitrate degradation, extracellular polymers with proteins and polysaccharides as the main components showed an increasing trend in all reactors, and proteins content was significantly higher than that of polysaccharides. At the end of experiments, the cumulative amounts of extracellular polymers in the experimental group and the control group were 384.49 mg and 279.45 mg, and the average extracellular polymeric substance production corresponding to the degradation of nitrate nitrogen per unit mass were 1.79 mg·mg-1 and 39.43 mg·mg-1, respectively. The High-throughput sequencing analyses indicated that addition of nano emulsified oil resulted in an increase in bacterial concentration and a decrease in bacterial community diversity, but a proliferation in denitrifying bacteria. Proteobacteria, Bacteroidetes and Actinonobacteria were the dominant groups on the phylum level in all reactors. Their relative abundance were 73.35%, 6.77% and 8.49% in the experimental reactors and 33.46%, 47.15% and 7.15% in the control reactors, respectively. The reason was that that nano emulsified oil could stimulate the proliferation of denitrifying microorganisms, such as Proteobacteria. Therefore, as a carbon source, Nano emulsified oil could effectively improve the degradation efficiency of nitrate. Meanwhile, it could stimulate the growth of microorganisms and affect the evolution of microbial communities. It was concluded that the increase in relative abundance of Sphingamonas, Rhodopseudomonas and Microbacterium could lead to the increase in production of extracellular polymers and consequently result in the decrease of permeability of porous media and aquifers clogging.
Keywords: nano emulsified oilthe degradation of nitrate nitrogenMiseq high-throughput sequencingextracellular polymersbacterial community
1 引言(Introduction)乳化油作为一种新型的缓释碳源, 具有高能、无毒、廉价等特性(Zawtocki et al., 2004), 且乳化油在地下水中迁移性良好, 可长期作为碳源及电子供体, 在原位生物修复地下水中的重金属(Cr、Mn等)、硝基苯、氯代烃、硝酸盐污染等问题中有较好的效果, 因而近年来受到了广泛的关注(Borden et al., 2007；Tang et al., 2013；Harkness et al., 2013；Deng et al., 2016；董军等, 2018).但在实际应用中, 由于乳化油原位注入含水层进行修复的过程中会加快微生物的生长繁殖, 使其在含水介质中附着并分泌大量的胞外聚合物.胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances, EPS)在多孔介质孔隙中形成生物膜造成含水层渗透性下降, 从而导致修复效率的降低甚至失败.
研究表明(Baveye et al., 1998；Seki et al., 2001), 以乳化油为碳源原位修复地下水污染造成的微生物堵塞主要有以下几个原因：①微生物菌体细胞的大量积累；②细胞代谢产物胞外聚合物的产生和积累；③微生物代谢产气.微生物堵塞主要分为3个阶段：第一阶段微生物在介质孔喉处生长, 形成微菌落, 导致水力传导系数下降；第二阶段随着附着微菌落的增加, 其弥散度有所增大使得溶质的运移出现明显的扰动现象；第三阶段微生物堵塞发生, 产生绕流现象, 大孔隙形成优先流(Seifert et al., 2007).目前, 有关回灌领域微生物堵塞现象及原位修复地下水污染过程中微生物的数量变化已得到了广泛的关注, 然而现有的研究并没有深入地分析原位生物修复过程中微生物生长代谢产物的动态变化及从分子生物学的角度鉴定造成含水层堵塞的优势菌种.一般而言, 柱实验通常反映的是多个堵塞因素, 是包括碳源本身、微生物、胞外聚合物、产气等多个因素的综合表现, 难以将各个因素的影响刻画出来.因此, 为进一步掌握地下水污染原位修复过程中微生物的变化特征, 本文采用纳米乳化油为外加碳源, 以中砂为介质, 开展硝酸盐降解批实验, 模拟研究纳米乳化油原位生物修复过程中微生物及其代谢产物的变化特征.同时, 采用MiSeq高通量测序技术鉴定造成堵塞的微生物优势菌群, 并分析不同周期内微生物浓度及胞外聚合物的组成和累积情况及过程, 尝试揭示乳化油原位修复地下水污染过程中造成含水介质微生物堵塞的过程及机理, 为地下水污染原位修复过程中多孔介质微生物堵塞的缓解手段研究提供依据.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 实验材料批实验试剂及介质：纳米乳化油(大豆油、食品及乳化剂Tween 80和Span 80)、市售反硝化菌剂(上海甘度环境工程有限公司, 表 1)、硝酸钾(天津市光复科技发展有限公司)、去离子水、中砂(0.25~0.50 mm)；硝酸盐氮(NO3-N)检测试剂：氨基磺酸、盐酸；蛋白质(Protein, PN)和多糖(Polysaccharides, PS)检测试剂：浓硫酸、蒽酮和考马斯亮蓝.
表 1(Table 1)
| 表 1 反硝化细菌参数 Table 1 The parameters of denitrifying bacteria | ||||||||
表 1 反硝化细菌参数 Table 1 The parameters of denitrifying bacteria
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2.2 实验方法2.2.1 纳米乳化油制备采用升温相转变技术将乳化油转化为纳米乳化油(何宝南, 2017).将大豆油、tween 80、span 80和去离子水按照一定比例混合, 以1500 r·min-1速率的电动增力搅拌器搅拌10 min, 然后超声处理10 min, 用恒温水浴加热箱加热至55 ℃, 静止48 h无破乳分层现象, 则得到稳定的纳米乳化油, 其平均粒径为255.1 nm, 稳定性动力学指数为0.5, COD释放浓度为4.72×105 mg·L-1, 粘度为3.72×10-4 Pa·s(何宝南, 2017).
2.2.2 实验装置本实验用于监测硝酸盐氮降解中微生物变化的装置为规格1.5 L的圆柱型容器, 里面盛有1.2 L反应液及150 g中砂.反应开始前经过120 ℃、25 min的灭菌处理及20 min的曝氩气处理以保证反应容器内为无氧、灭菌环境.反应容器开口用橡胶塞密封, 上部橡胶塞装有套针, 通过上部套针取清液中悬浮态微生物的样品(图 1).
图 1(Fig. 1)
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| 图 1 实验装置示意图 Fig. 1Schematic diagram of experimental set-up |
实验在避光、常温的条件下进行, 每个分组包含3个平行组, 具体方案设计见表 2.其中, #1反应器为对照组, #2反应器为实验组, 用于验证有碳源的情况下市售的反硝化细菌对于硝酸盐氮降解过程中微生物变化情况的影响.反应容器中有反硝化微生物、合适的电子供体及厌氧环境确保反应条件为反硝化条件.
表 2(Table 2)
| 表 2 各组初始加入的物质 Table 2 The initial addition of each group | ||||||||||||||||||
表 2 各组初始加入的物质 Table 2 The initial addition of each group
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2.2.3 试验运行静态批实验采用一次性加入3 mL纳米乳化油和0.75 g市售反硝化菌剂, 周期性加入硝酸盐氮溶液的方式启动, 其中, 硝酸盐氮初始浓度为50 mg·L-1(劳天颖等, 2019).当反应体系中硝酸盐氮的浓度降低至不再变化时, 记作一个周期.
待该周期结束后, 向反应体系中添加硝酸盐氮溶液, 将反应体系中硝酸盐氮溶液提升至初始的浓度水平, 进行下一周期硝酸盐氮的降解.
2.2.4 测试方法常规分析项目：NO3--N采用紫外分光光度法测定(国家环保总局编委会, 2012).
悬浮微生物浓度：利用3M PetrifilmTM菌落总数测试片与OD 600的微生物浓度关系曲线测定.
胞外聚合物：采用分光光度法进行分析.微生物胞外聚合物通过加热法(吕英, 2007)进行提取, 具体操作为：对所取样品以0.9%NaCl补充体积, 在4 ℃、7300 r·min-1下离心舍去上清液, 加入0.9%NaCl缓冲液恢复体积, 将样品在80 ℃下水浴加热30 min, 然后在8000 r·min-1下离心10 min, 取上清液过0.22 μm微孔滤膜则得EPS提取液.为了保证多糖和蛋白质不变性, 最好在提取的当天测定.多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法(罗毅等, 2005), 蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法(李如亮, 1998), 两者之和约占EPS总量的70%~90%(Sheng et al., 2010), 因此, 以EPS提取液中蛋白质和多糖含量测定结果之和近似代替EPS总量.
微生物群落结构特征：用高通量测序平台Illumina MiSeq对扩增产物进MiSeq高通量测序.MiSeq测序得到的PE reads首先根据barcode区分每个样本, 而后对序列质量进行质控和过滤, 再根据overlap关系进行拼接, 拼接后的序列再次进行质控和过滤, 最后得到的优化序列进行OTU聚类分析和物种分类学分析.
3 结果与讨论(Results and discussion)3.1 纳米乳化油降解硝酸盐效果各反应体系中硝酸盐氮浓度变化如图 2所示.由图可知, 对照组中4个周期的硝氮降解效率分别为88.0%、42.0%、17.41%和5.01%, 在前两个周期内能够有效地降解反应体系中的硝酸盐氮, 但后两个周期中几乎无降解作用, 表明市售的反硝化菌剂中本身可能添加了酶和一定的营养物质.实验初期, 反硝化菌剂利用自身携带的营养物质进行反硝化作用；随着实验的进行, 自身的营养物质消耗完, 微生物缺乏生长繁殖所需的物质, 会出现相互捕食作用, 同时微生物逐渐开始衰亡, 此时硝酸盐氮的浓度不再降低.实验组在整个实验周期内硝酸盐氮浓度均有所下降, 降解效率分别为93.6%、95.4%、95.8%和84.83%.相比于对照组, 实验组前两个周期的硝酸盐氮降解速率更快, 说明外加碳源纳米乳化油能够提供微生物生长繁殖所需的物质, 促进了硝酸盐氮的降解.但随着纳米乳化油的消耗, 反硝化细菌缺少生长代谢所需的碳源, 第Ⅳ周期的降解效率有所降低.
图 2(Fig. 2)
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| 图 2 不同反应体系中硝酸盐氮浓度的降解情况 Fig. 2Degradation of nitrate nitrogen concentration in different reaction systems |
3.2 微生物及其代谢产物的变化情况微生物生长变化情况如图 3所示, 整个实验中反应体系的微生物浓度整体均呈下降趋势.#1反应体系无碳源添加, 在饥饿环境下主要通过微生物之间的相互捕食, 以及利用细菌代谢产物胞外聚合物和其他有机质分解作为生长代谢所需的碳源.#2反应体系添加了纳米乳化油, 前期缺乏分解碳源的酶, 后期不同种类的菌相互竞争抑制生长, 一些不适应环境的微生物逐渐死亡, 部分菌种存活下来成为优势菌种.
图 3(Fig. 3)
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| 图 3 不同反应体系中OD600、PN、PS和EPS含量变化 Fig. 3Changes of OD600, PN, PS and EPS contents in different reaction systems |
在对照组和实验组中, 蛋白质在第60 d的累积量分别为247.5和316.3 mg, 多糖分别为31.9和68.2 mg, 蛋白质的含量显著高于多糖的含量, 这与大多数研究结论一致(余肇璟等, 2017；Castao et al., 2017).胞外多糖含量较少的原因是胞外蛋白中有一部分是胞外酶, 其可降解水溶性胞外多聚物和不溶于水的胞外物质, 使这些生物大分子变成小分子产物被细胞代谢吸收(Jahn et al., 1998；Abbasnezhad et al., 2011).实验组初期蛋白质含量相比于对照组瞬时增加而多糖含量无明显变化, 分析认为微生物处于饥饿状态时EPS的多糖利用速率显著快于蛋白质.随着反应的进行, 对照组和实验组胞外聚合物的累积量都逐渐增多, 分别为384.9 mg和279.5 mg.说明可作为碳源的胞外聚合物的含量远小于不能降解的胞外聚合物含量(Laspidou et al., 2002；张云霞等, 2008).对照组中硝酸盐氮的总降解率不到40%, 而实验组的降解率平均高达90%, 这表明添加纳米乳化油的反应体系C/N值会增加.大量研究表明, 营养物质促进细胞转为EPS, 其主要取决于细胞生长培养基质的组成, 含碳量与营养物质的比例(C/N)越高, 则越有利于胞外聚合物的产生(Miqueleto et al., 2010；孙洪伟等, 2018).这表明加入适量的碳源在提高反硝化速率的同时也会提高代谢产物胞外聚合物的含量.
为了进一步分析胞外聚合物的变化情况, 分别对各个周期内胞外聚合物的含量及单位质量硝酸盐降解所产生的胞外聚合物进行分析(表 3).从表 3可以看出, 对照组第Ⅰ、Ⅱ周期胞外聚合物的产生量较少, 分析认为水体中营养物质不足, 微生物繁殖代谢缓慢, 且生成的胞外聚合物一部分作为细胞生长代谢的碳源及营养物质；在第Ⅲ、Ⅳ周期胞外聚合物的含量明显增多, 且单位质量硝酸盐降解所产生的胞外聚合物含量也大幅增长, 其原因可能是反应体系缺乏营养物质, 微生物凋亡和裂解产生了大量胞外聚合物.实验组胞外聚合物含量在第Ⅰ周期内增多, 而后在第Ⅱ周期内减少, 最后在第Ⅲ、Ⅳ周期持续增加, 且单位质量硝酸盐降解所产生的胞外聚合物含量在第Ⅳ周期突然增大.结合微生物在不同周期的生长情况, 分析认为随着碳源的消耗, 生成的胞外聚合物部分用于微生物生长代谢所需要的营养物质, 胞外聚合物的含量略有下降；而随着可利用的胞外聚合物消耗殆尽, 反硝化细菌缺少自身生长代谢所需要的营养物质开始逐渐死亡, 胞外聚合物除了生长代谢生成外还有细胞脱落和凋亡所产生的.研究表明, 微生物堵塞主要由微生物本身及其代谢产物胞外聚合物引起的(夏璐等, 2014；Dellagnezze et al., 2014).结合图 3和表 3推测, 在系统开放性良好的情况下, 纳米乳化油原位修复硝酸盐污染地下水过程中, 前期微生物堵塞可能由微生物本身造成的, 后期堵塞可能由微生物的代谢产物胞外聚合物引起的.
表 3(Table 3)
| 表 3 不同周期内EPS产生量及单位质量硝酸盐降解产生的EPS Table 3 Statistical table of extracellular polymeric substances content in different periods | |||||||||||||||||||||||||||||
表 3 不同周期内EPS产生量及单位质量硝酸盐降解产生的EPS Table 3 Statistical table of extracellular polymeric substances content in different periods
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3.3 纳米乳化油降解硝酸盐氮过程中微生物群落特性3.3.1 碳源对微生物多样性指数的影响采用高通量测序技术表征不同反应容器中微生物群落结构变化, 经质控过滤和拼接, 最终得到用于后续分析的有效优化序列共163484条, 通过OTU聚类分析实际观察到的OTU个数为571.由表 4可知, 4组样品中微生物的覆盖率均大于99.9%, 说明测序序列基本覆盖了细菌的多样性, 测序结果可以代表样本的真实情况.比较微生物群落α多样性指数发现, 不同周期不同反应器中微生物群落的多样性和丰富度均发生了变化.随着反应的进行, 未添加碳源的#1反应器微生物的Chao、ACE和Simpson指数下降, 分析认为该反应体系缺少营养物质, 导致反应器中微生物大量死亡, 反硝化速率逐渐降低, 具有脱氮性能的优势菌属减少而其他微生物群落结构增多, 使得样品丰富度降低, 多样性升高.添加了纳米乳化油的#2反应器微生物的Chao、ACE和Simpson指数均较高, 原因可能为#2反应器中添加了碳源, 微生物生长繁殖加快, 使得反硝化速率提高, NO3--N浓度降低, 具有反硝化作用的微生物群落迅速增殖, 最终导致样本丰富度升高而多样性降低(罗晓等, 2018).
表 4(Table 4)
| 表 4 微生物群落α多样性指数 Table 4 Alpha diversity index of microbial samples | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 4 微生物群落α多样性指数 Table 4 Alpha diversity index of microbial samples
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3.3.2 碳源对细菌群落结构的影响反应初始及#1和#2反应器第Ⅳ周期样品OUT在门水平上的细菌群落结构及分布如图 4所示.所有样品的细菌群落结构具有一定的相似性, 其相对丰度较高的菌群相同, 但相对丰度较低的菌群不大相同, 且各类细菌菌群的相对丰度存在一定的差异.运行后期, #1和#2反应器中Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)和Actinobacteria(放线菌门)为最主要的菌门, 相对丰度分别为33.46%、47.15%、7.15%和73.35%、6.77%、8.49%.
图 4(Fig. 4)
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| 图 4 反应初始和第Ⅳ周期样品门水平的群落结构 Fig. 4Bacterial communities at phylum level of sample in the initial and period IV |
Proteobacteria菌门为革兰氏阴性菌, 其中大多数细菌为厌氧异养细菌, 通过分解有机物从而获取营养物质.研究表明, Proteobacteria菌门与反硝化作用密切相关, 是反硝化细菌的常见菌种(陈谊等, 2010；郝瑞霞等, 2014；郑林雪等, 2015), 具有脱氮除磷、降解多种污染物等重要作用(Yang et al., 2013).相比于#1反应器, #2反应器中Proteobacteria所占的比例相对较高, 产生这一现象的原因是许多已被证实的反硝化细菌都隶属于Proteobacteria, 随着反硝化速率的提高, Proteobacteria所占比例也随之增加, 这与不同反应器中硝酸盐降解效果相一致, 且本研究中Proteobacteria相对丰度最高, 这与Ma等(2015)的研究结果一致.Bacteroidetes菌门为革兰氏阴性菌, 可与葡萄糖、果糖、乳糖等作用并产生气体.Actinobacteria菌体呈菌丝状生长, 可以分解吸收有机物质供自身生长, 常用于污水处理及产生抗生素领域.
在属水平上将反应初始及#1和#2反应器第Ⅳ周期样品中相对丰度小于1%的菌属合并到其他(Others), 不同样品的菌属群落结构分布差异较大(图 5).运行初期, 反应器中的微生物菌属主要为Herbaspirillum(20.78%)、Janthinobacterium(16.67%)和Novosphingobium(10.42%).随着反应的进行, 微生物主要菌属发生了较大改变, 其相对丰度也随之改变.#1反应器中微生物的菌属较多但相对丰度较低, 主要菌属为Asinibacterium(43.17%)、Sphingamonas(7.67%)和Chryseobacterium(2.86%).其中, Sphingamonas(鞘氨醇单胞菌属)属于Proteobacteria(变形菌门), 有研究证明其在反硝化作用过程中发挥了重要作用, 保证了反硝作用的快速进行(郝瑞霞等, 2014).#2反应器中微生物的菌属主要为Sphingamonas(22.63%)、Afipia(15.06%)和Microbacterium(14.39%).Sphingamonas和Afipia属于Proteobacteria的不同分支, Sphingamonas菌属相对丰度的提高说明#2反应器中反硝化作用的高效运行, 验证了#2反应器反硝化速率明显高于#1反应器.#1反应器中不存在Afipia和Microbacterium菌属, 且周梦娟等(2018)研究表明, 添加碳源的反应器的微生物群落结构与无碳源的反应器的微生物群落结构大不相同, 说明碳源对微生物群落结构具有生长选择性.而添加不同的碳源其优势菌属的相对丰度改变不一, 进一步说明不同碳源对于细菌群落结构选择性不同.
图 5(Fig. 5)
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| 图 5 反应初始和第Ⅳ周期样品属水平的群落结构 Fig. 5Bacterial communities at genera level of sample in the initial and period IV |
3.3.3 微生物群落演替特征为进一步分析纳米乳化油与微生物群落演替特征之间的关系, 结合实验组试验始末EPS产生量, 分析实验组反应器试验初期和结束时微生物优势群落的变化特征, 结果如图 6所示.反应前期, 优势菌属为Pseudomonas(11.83%)和Enterobacter(31.0%).其中, Pseudomonas(假单胞菌属)为典型的兼性厌氧反硝化细菌, 呈杆状或稍弯, 代谢过程可产生粘滑性聚合物(R.E.布坎南等, 1984).该菌属中有多个种类已被作为研究反硝化过程的典型菌株, 且具有高效的反硝化作用(王弘宇等, 2009；Sun et al., 2017).Enterobacter(肠杆菌属)为革兰氏阴性菌, 是生物制氢中广泛采用的微生物(Zhang et al., 2005), 且能为氢型甲烷菌提供氢从而促进CH4合成, 可促进纳米乳化油自身发生反应从而在第Ⅰ周期内生成较多的CO2、CH4等气体, 这与劳天颖等(2019)的研究结果相吻合.随着反应的进行, 到反应末期体系的细菌群落结构与反应初期呈现明显的差异, 其优势菌属为Sphingamonas(22.63%)、Afipia(15.06%)、Microbacterium(14.39%)和Rhodopseudomonas(11.33%).其中, Sphingamonas(鞘氨醇单胞菌属)为革兰氏阴性菌, 大多数呈杆状, 可作为脱氮细菌将硝氮转化为亚硝酸盐氮和氮气, 具有较高的反硝化作用, 且具有能够降解多种芳香化合物的重要功能类群—大质粒, 质粒上的编码可大量运输能降解芳香化合物(如苯酚、甲苯等)的酶(Basta et al., 2004；Thomsen et al., 2007), 但其在代谢过程中会产生粘性的胞外高聚物(胡杰等, 2007).
图 6(Fig. 6)
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| 图 6 试验始末实验组EPS产生量和微生物群落结构的对比 Fig. 6Comparison of EPS production and bacterial communities in the beginning and end of the experiment |
随着试验的进行, 在胞外聚合物生成量增多的同时Pseudomonas和Enterobacter菌属的相对丰度降低, 而Sphingamonas、Microbacterium和Rhodopseudomonas菌属的相对丰度增大, 进一步说明了碳源对于微生物群落结构具有生长选择性, 同时Microbacterium(微杆菌属)和Rhodopseudomonas(红假单细胞菌属)可产生由多糖等大分子组成的粘性胞外多聚物(Sheng et al., 2006；Godinho et al., 2009), 是形成菌胶团必要的“粘合剂”, 且这些优势菌属的运动能力普遍较差, 附着性较好, 这一特性为其在含水层多孔介质上的优先附着提供了有利的条件.因此, 分析认为纳米乳化油原位修复地下水污染过程中细胞代谢产物胞外聚合物的产生和积累造成的微生物堵塞问题, 可能是由于Sphingamonas、Microbacterium及Rhodopseudomonas菌落的代谢产物增多引起的.
4 结论(Conclusions)1) 纳米乳化油作为碳源能够有效提高硝酸盐氮的降解率.整个周期内, 实验组硝氮总降解率高达91.76%, 而对照组硝氮总降解率仅为38.11%；实验组和对照组的微生物浓度整体均呈下降趋势, 以蛋白质和多糖为主的代谢产物胞外聚合物累积量呈递增的趋势, 分别为384.49 mg和279.45 mg, 蛋白质的含量显著高于多糖, 降解单位质量硝氮生成的平均胞外聚合物分别为1.79 mg·mg-1和39.43 mg·mg-1.
2) 高通量测序结果表明, 添加了纳米乳化油的反应器在一定程度上导致细菌浓度升高和菌落多样性降低, 但具有反硝化作用的微生物群落结构有所增加.与反硝化作用密切相关的Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria为两组反应器的主要菌门.实验组中具有高效反硝化作用的Proteobacteria菌门的相对丰度相较对照组有所增加.
3) 纳米乳化油对微生物群落结构具有生长选择性.相比于实验组试验初期, 末期Pseudomonas和Enterobacter菌属的相对丰度小于1%, 而Sphingamonas、Microbacterium和Rhodopseudomonas菌属的相对丰度增大, 与此同时末期胞外聚合物的产生量也增多, 说明纳米乳化油原位修复地下水硝酸盐氮污染造成的微生物堵塞主要是由这3种菌属所产生的粘性代谢产物增多导致的.
参考文献
| Abbasnezhad H, Gray M, Foght J M. 2011. Influence of adhesion on aerobic biodegradation and bioremediation of liquid hydrocarbons[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 92(4): 653-675. |
| Basta T, Keck A, Klein J, et al. 2004. Detection and characterization of conjugative degradative plasmids in xenobiotic-degrading sphingomonas strains[J]. Journal of Bacteriology, 186(12): 3862-3872. DOI:10.1128/JB.186.12.3862-3872.2004 |
| Baveye P, Vandevivere P, Hoyle B L, et al. 1998. Environmental impact and mechanisms of the biological clogging of saturated soils and aquifer materials[J]. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 28(2): 123-191. DOI:10.1080/10643389891254197 |
| Borden R C. 2007. Concurrent bioremediation of perchlorate and 1, 1, 1-trichloroethane in an emulsified oil barrier[J]. Journal of Contaminant Hydrology, 94(1): 13-33. |
| Casta?o J, Guadarrama Y, Hernndez J, et al. 2017. Preparation, characterization and antifungal properties of polysaccharide-polysaccharide and polysaccharide-protein films[J]. Journal of Materials Science, 52(1): 353-366. DOI:10.1007/s10853-016-0336-3 |
| 陈谊, 孙宝盛, 张斌, 等. 2010. 不同MBR反应器中硝化菌群落结构的研究[J]. 中国环境科学, 30(1): 69-75. |
| Dellagnezze B M, De Sousa G V, Martins L L, et al. 2014. Bioremediation potential of microorganisms derived from petroleum reservoirs[J]. Marine Pollution Bulletin, 89(1/2): 191-200. |
| Deng Y, Zhang P, Qin Y, et al. 2016. Network succession reveals the importance of competition in response to emulsified vegetable oil amendment for uranium bioremediation[J]. Environmental Microbiology, 18(1): 205-218. DOI:10.1111/1462-2920.12981 |
| 董军, 徐暖, 刘同喆, 等. 2018. 乳化植物油强化土著微生物修复中高浓度Cr(Ⅵ)污染地下水[J]. 吉林大学学报(地), 48(1): 234-240. |
| Godinho A L, Bhosle S. 2009. Sand aggregation by exopolysaccharide-producing microbacterium arborescens-AGSB[J]. Current Microbiology, 58(6): 616-621. DOI:10.1007/s00284-009-9400-4 |
| 国家环保总局编委会. 2012. 水与废水监测分析方法(第四版)[M]. 北京: 中国环境科学出版社. |
| Harkness M, Fisher A. 2013. Use of emulsified vegetable oil to support bioremediation of TCE DNAPL in soil columns[J]. Journal Contaminant Hydrology, 151: 16-33. DOI:10.1016/j.jconhyd.2013.04.002 |
| 郝瑞霞, 孟成成, 王建超, 等. 2014. 三维电极生物膜-硫自养耦合脱氮系统中反硝化细菌多样性研究[J]. 北京工业大学学报, (11): 1722-1729. DOI:10.11936/bjutxb2014111722 |
| 何宝南.2017.纳米乳化油制备及其在多孔介质中的迁移释放模拟实验[D].北京: 中国地质大学(北京) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-11415-1017135890.htm |
| 胡杰, 何晓红, 李大平, 等. 2007. 鞘氨醇单胞菌研究进展[J]. 应用与环境生物学报, 13(3): 431-437. DOI:10.3321/j.issn:1006-687X.2007.03.030 |
| Jahn A, Nielsen P H. 1998. Cell biomass and exopolymer composition in sewer biofilms[J]. Water Science & Technology, 37(1): 17-24. |
| Laspidou C S, Rittmann B E. 2002. A unified theory for extracellular polymeric substances, soluble microbial products, and active and inert biomass[J]. Water Research, 36(11): 2711-2720. DOI:10.1016/S0043-1354(01)00413-4 |
| 劳天颖. 2019. 纳米乳化油修复地下水硝酸盐过程中产气及微生物增殖代谢对多孔介质堵塞的模拟评估[J]. 环境科学学报, 39(12): 4047-4056. |
| 李如亮. 1998. 生物化学实验[M]. 武汉: 武汉大学出版社, 32-35. |
| 罗晓, 郑向阳, 赵丛丛, 等. 2018. A/O工艺中污泥浓度对微生物群落结构的影响[J]. 中国环境科学, 38(1): 275-283. DOI:10.3969/j.issn.1000-6923.2018.01.031 |
| 罗毅, 潘细贵, 刘刚, 等. 2005. 苯酚-硫酸法测定多糖含量显色方式的优选[J]. 中国中医药信息杂志, 12(1): 45-46. DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2005.01.022 |
| 吕英.2007.活性污泥胞外聚合物提取方法及其对重金属离子的吸附研究[D].天津: 天津大学 http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=degree&id=Y1357848 |
| Ma Q, Qu Y, Shen W, et al. 2015. Bacterial community compositions of coking wastewater treatment plants in steel industry revealed by Illumina high-throughput sequencing[J]. Bioresource Technology, 179: 436-443. DOI:10.1016/j.biortech.2014.12.041 |
| Miqueleto A P, Dolosic C C, Pozzi E, et al. 2010. Influence of carbon sources and C/N ratio on EPS production in anaerobic sequencing batch biofilm reactors for wastewater treatment[J]. Bioresource Technology, 101(4): 1324-1330. DOI:10.1016/j.biortech.2009.09.026 |
| R.E.布坎南, N.E.吉本斯. 1984. 伯杰细菌鉴定手册(第八版)[M]. 北京: 科学出版社. |
| Seifert D, Engesgaard P. 2007. Use of tracer tests to investigate changes in flow and transport properties due to bioclogging of porous media[J]. Journal of Contaminant Hydrology, 93(1/4): 58-71. |
| Seki K, Miyazaki T. 2001. A mathematical model for biological clogging of uniform porous media[J]. Water Resources Research, 37(12): 2995-2999. DOI:10.1029/2001WR000395 |
| Sheng G P, Yu H Q, Yue Z, et al. 2006. Factors influencing the production of extracellular polymeric substances by Rhodopseudomonas acidophila[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 58(2): 89-93. |
| Sheng G P, Yu H Q, Li X Y. 2010. Extracellular polymeric substances (EPS) of microbial aggregates in biological wastewater treatment systems:A review[J]. Biotechnology Advances, 28(6): 882-894. DOI:10.1016/j.biotechadv.2010.08.001 |
| Sun H, Wu Q, Yu P, et al. 2017. Denitrification using excess activated sludge as carbon source:performance and the microbial community dynamics[J]. Bioresource Technology, 238: 624-632. DOI:10.1016/j.biortech.2017.04.105 |
| 孙洪伟, 陈翠忠, 高宇学, 等. 2018. 碳氮比对活性污泥胞外聚合物的长期影响[J]. 中国环境科学, 38(3): 950-958. DOI:10.3969/j.issn.1000-6923.2018.03.019 |
| Tang G P, Watson D B, Wu W M, et al. 2013. U(VI) Bioreduction with emulsified vegetable oil as the electron donor-model application to a field test[J]. Environmental Science & Technology, 47(7): 3218-3225. |
| Thomsen T R, Kong Y, Nielsen P H. 2007. Ecophysiology of abundant denitrifying bacteria in activated sludge[J]. FEMS Microbiology Ecology, 60(3): 370-382. DOI:10.1111/j.1574-6941.2007.00309.x |
| 王弘宇, 马放, 杨开, 等. 2009. 两株异养硝化细菌的氨氮去除特性[J]. 中国环境科学, 29(1): 47-52. DOI:10.3321/j.issn:1000-6923.2009.01.010 |
| 夏璐, 郑西来, 段玉环, 等. 2014. 砂柱微生物堵塞过程及机理分析[J]. 水利学报, 45(6): 749-755. |
| Yang X L, Zhao N, Chen M, et al. 2013. Analysis of microbial community structure in MBR with different ammonia concentrations using fluorescence in situ hybridization[J]. Journal of Southeast University(Natural Science Edition), 43(2): 380-385. |
| 余肇璟, 余润兰, 刘阿娟, 等. 2017. 生物浸出黄铜矿中pH值对嗜酸氧化亚铁硫杆菌分泌胞外蛋白和胞外多糖的影响[J]. 中国有色金属学报:英文版, (27): 406-412. |
| Zawtocki C, Lieberman M T, Borden R C, et al.2004.Treatment of perchlorate and 1, 1, 1-trichloroethane in groundwater using edible oil substrate (EOS)[R].Proceedings of Remediation of Chlorinated and Recalcitrant Compounds-4th International Conference.Monterey, CA |
| Zhang C, Xing X H, Lou K. 2005. Rapid detection of a gfp-marked Enterobacter aerogenes under anaerobic conditions by aerobic fluorescence recovery[J]. FEMS Microbiology Letters, 251(2): 211-218. DOI:10.1016/j.femsle.2005.08.003 |
| 张云霞, 季民, 李超, 等. 2008. 好氧颗粒污泥胞外聚合物(EPS)的生化性研究[J]. 环境科学, 29(11): 3124-3127. DOI:10.3321/j.issn:0250-3301.2008.11.023 |
| 郑林雪, 李军, 胡家玮, 等. 2015. 同步硝化反硝化系统中反硝化细菌多样性研究[J]. 中国环境科学, 35(1): 116-121. |
| 周梦娟, 缪恒锋, 陆震明, 等. 2018. 碳源对反硝化细菌的反硝化速率和群落结构的影响[J]. 环境科学研究, 31(12): 2047-2054. |
